酸敏感離子通道1a在高糖環(huán)境下肝纖維化發(fā)病中的作用研究

王 歡，汪應(yīng)紅，田遠耀，孫仕偉，黃蒙蒙，李小楓，孟曉明，黃 艷

（安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院基礎(chǔ)與臨床藥理教研室，安徽醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，安徽合肥 230032）

酸敏感離子通道1a在高糖環(huán)境下肝纖維化發(fā)病中的作用研究

王 歡，汪應(yīng)紅，田遠耀，孫仕偉，黃蒙蒙，李小楓，孟曉明，黃 艷

（安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院基礎(chǔ)與臨床藥理教研室，安徽醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，安徽合肥 230032）

目的 研究ASIC1a（acid-sensing ion channel 1a）對糖尿病合并肝纖維化的病理影響及高糖環(huán)境下PDGF-BB刺激的HSC-T6細胞活化增殖的作用。方法 采用鏈脲佐菌素（STZ）制備大鼠糖尿病模型，四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，觀察糖尿病組、單純肝纖維化組及糖尿病并發(fā)肝纖維化雙模型組肝組織損傷程度及ASIC1a的表達變化；體外實驗，利用ASIC1a阻斷劑阿米洛利（amiloride）預(yù)處理HSC-T6細胞，然后加入高糖處理HSC-T6細胞24 h，再添加重組小鼠血小板衍生生長因子（PDGF-BB）刺激24 h，觀察HSC-T6的活化增殖情況；Western blot檢測ASIC1a、α-SMA 和Collagen I蛋白表達水平。結(jié)果 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠、CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠和STZ加CCl4聯(lián)合誘導(dǎo)的糖尿病肝纖維化雙模型大鼠肝組織較對照組大鼠肝組織均出現(xiàn)不同程度的肝損傷，其中雙模型大鼠的損傷最為嚴重，且3組大鼠肝組織較對照組大鼠肝組織中ASIC1a表達明顯升高，雙模型大鼠肝組織中ASIC1a升高最為明顯；阿米洛利預(yù)處理HSC-T6，明顯降低了高糖環(huán)境下ASIC1a的表達，并抑制了高糖環(huán)境下PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC-T6中α-SMA、Colla-gen I的表達。結(jié)論 高糖環(huán)境加劇CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化及PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC活化，其可能與高糖環(huán)境下ASIC1a的過表達有關(guān)。

高糖；糖尿??；肝星狀細胞；ASIC1a；肝纖維化；活化增殖

糖尿病是一組可引起各種急、慢性并發(fā)癥，以血糖升高和伴隨組織酸化為特點的代謝性疾病。多項研究表明，高血糖對腎臟［1］、神經(jīng)［2］、血管的纖維化形成［3］及視網(wǎng)膜病變［4］有著明顯的促進作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，高血糖對肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）活化增殖及膠原形成也起重要的促進作用［5－6］。肝纖維化是由多種致病因子引起的肝臟慢性損傷、細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積的炎癥反應(yīng)，是慢性肝病共有的病理過程。HSC的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，同時活化增殖的HSC也是ECM的主要來源細胞。已有研究表明，高血糖是肝臟疾病死亡率增高的一個重要促進因子［7－8］，因此，深入研究高血糖對HSC活化增殖的機制，已受到國內(nèi)外學(xué)者廣泛的關(guān)注。

酸敏感離子通道（ASICs）是一類由細胞外質(zhì)子（H＋）所激活的陽離子通道，當(dāng)胞外pH降低時，開放的通道對Na＋、Ca2＋具有通透性，進而引起細胞一系列生理病理變化［9］。到目前為止，ASICs已克隆了由4個功能基因編碼的6個亞基：ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4。過去20年，ASICs的研究主要圍繞中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)，ASIC1a在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼等組織的細胞、肺上皮細胞及椎間盤細胞均有表達且起著重要的病理生理作用［10］。有研究表明，ASIC1a參與了酸誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞基質(zhì)代謝失衡及自噬的發(fā)生，從而參與關(guān)節(jié)炎的病變［11－12］。近來研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化發(fā)生的過程中，ASIC1a變化，進而引起HSC活化增殖，促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［13－14］。而高糖是否引起HSC中ASIC1a離子通道過表達及激活，從而部分解釋糖尿病高發(fā)肝纖維化的機制，目前國內(nèi)外尚未見報道。為此，本研究從體內(nèi)實驗和體外實驗兩個方面，探索高糖環(huán)境下肝纖維化進程中ASIC1a的變化及其可能作用，為糖尿病性肝纖維化的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ♂SD大鼠，4～6周齡，體質(zhì)量100～140 g，清潔級，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 細胞株 細胞株HSC-T6購自中國科學(xué)院上海細胞庫，為永生化大鼠HSC。

1.3 主要材料與試劑 鏈脲佐菌素STZ、阿米洛利（amiloride）、DMSO（美國Sigma公司），四氯化碳CCl4（汕頭西隴化工廠）；重組小鼠血小板衍生生長因子（PDGF-BB）（英國PEPROTECH公司）；細胞組織裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF（上海碧云天公司）；Rabbit mAb anti-ASIC1（美國Alomone公司）；Rabbit mAb anti-α-SMA、Rabbit mAb anti-Colla-genⅠ（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；四甲基偶氮唑藍（MTT）（美國Amresco公司）；DMEM培養(yǎng)液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）。

1.4 主要儀器 NAPCO-6100型細胞培養(yǎng)箱（美國SHELLAB）；SW-CJ-IF型超凈工作臺（江蘇蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Western blot設(shè)備（美國Biorad公司）；酶標儀MK3（荷蘭雷勃公司）；Sig-ma3-16K高速離心機（美國Sigma公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.5 方法

1.5.1 動物分組與模型建立 實驗動物自由飲水和進食，隨機分為糖尿病組（n＝45）、肝纖維化組（n ＝15）和對照組（n＝6）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，糖尿病組大鼠以高脂飼料（10％豬油，20％蔗糖，10％蛋黃粉，1％膽固醇，59％基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)6周，對照組和肝纖維化組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)6周后，糖尿病組大鼠隔夜禁食12 h，腹腔內(nèi)注射0.1 mmol·L－1的鏈脲佐菌素（STZ，45 mg·kg－1）檸檬酸鹽緩沖液，肝纖維化組和對照組等體積檸檬酸鹽緩沖液。72 h后尾尖采血測定空腹血糖，若空腹血糖≥7 mmol·L－1為糖尿?。?5］。于實驗第4周起，隨機抽取20只糖尿病大鼠（糖尿病肝纖維化雙模型組）和肝纖維化組大鼠，皮下注射40％CCl4植物油溶液，首劑4 ml·kg－1，以后2 ml·kg－1，2次/周，共8周，對照組皮下注射同體積植物油溶液。在末次注射CCl4植物油溶液3 d后隔夜禁食處死。

1.5.2 HE染色 取大鼠肝臟右葉相同位置組織，10％甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察染色結(jié)果并拍照，分析和評價大鼠肝損傷和纖維化程度。

1.5.3 免疫組織化學(xué)檢測ASIC1a、α-SMA的表達大鼠肝組織用10％甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋、切片。采用SP法染色，切片常規(guī)脫蠟，加50 μL過氧化酶溶液，室溫孵育30 min；PBS沖洗后加0.1％的胰蛋白酶消化20 min，加50 μL非免疫性動物血清，室溫下孵育20 min；加50 μL的一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗后加50 μL生物素標記的二抗，室溫下孵育30 min；再加50 μL鏈霉菌抗生素蛋白－過氧化物酶溶液，室溫下孵育30 min；DBA顯色、蘇木精復(fù)染、封片觀察。

1.5.4 HSC-T6細胞培養(yǎng)和傳代 HSC-T6細胞使用含有10％胎牛血清及100 kU·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的低糖培養(yǎng)基（1 000 mg·L－1），置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長融合達到約80％時，用0.25％胰蛋白酶消化傳代或按所需濃度接種培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板。

1.5.5 MTT檢測細胞增殖 HSC-T6細胞生長80％融合，用0.25％胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基重懸，臺盼藍法細胞計數(shù)，每孔5×103個細胞接種于96孔板。待細胞貼壁后，加入D-Glucose溶液，使其終濃度分別為1 000、2 500、4 500、6 000、8 000 mg· L－1，作用不同時間（0、6、12、24、48、72 h），同時設(shè)立等濃度甘露醇（D-mannitol）作為高滲對照，每組6個復(fù)孔，每孔均為200 μL體系。置于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到時間后，每孔加20 μL 5×103mg·L－1MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，5 mL注射器小心吸盡各孔中液體，加入150 μL DMSO，立即用酶標儀于490 nm波長處檢測吸光度值。

1.5.6 Western blot檢測HSC中ASIC1a、α-SMA和Collagen I蛋白表達 根據(jù)MTT結(jié)果篩選出最適高糖濃度（6 000 mg·L－1）和作用時間（48 h），①采用低糖（1 000 mg·L－1）、高糖（6 000 mg·L－1）和甘露醇對照（1 000 mg·L－1＋5 000 mg·L－1甘露醇）分別作用細胞48 h，收集細胞蛋白檢測ASIC1a、α-SMA和Collagen I的表達；②細胞分為低糖、高糖、高糖＋Amiloride及甘露醇對照組。Amiloride預(yù)處理1 h后，細胞分別用低糖、高糖和甘露醇培養(yǎng)48 h，收集蛋白檢測ASIC1a、α-SMA和CollagenⅠ的表達；③細胞分為高糖、高糖＋PDGF、高糖＋PDGF＋Amiloride及甘露醇對照組，Amiloride預(yù)處理1 h后，分別用低糖、高糖和甘露醇培養(yǎng)24 h，再加入PDGF-BB刺激24 h，提取細胞蛋白檢測ASIC1a、α-SMA和CollagenⅠ的表達。具體步驟如下：收集各組細胞，加蛋白裂解液RIPA（含PMSF），冰上搖晃裂解30 min。4℃，12 000 r·min－1離心30 min，取上清液。用定量儀對蛋白樣品定量后，加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃加熱10 min使蛋白變性。每孔加15 μL總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，膜在室溫下用5％脫脂奶粉（TBST配制）封閉3 h，用TBST清洗后，用待檢測蛋白的一抗孵育，4℃，過夜。次日，膜用TBST清洗后，用與一抗種屬相匹配的的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，用One-Way ANOVA檢驗各組間差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理染色 HE染色結(jié)果（Fig 1）顯示，正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)正常；糖尿病組肝臟結(jié)構(gòu)輕度破壞，出現(xiàn)炎性壞死、脂肪變性；肝纖維化組肝細胞廣泛脂肪變性、壞死，炎性細胞浸潤，以匯管區(qū)及中央靜脈周圍較重，有膠原纖維沉積，纖維間隔粗大，形成假小葉；糖尿病肝纖維化雙模型組可見正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維結(jié)締組織增生形成纖維條索，伸入肝實質(zhì)內(nèi)，肝細胞脂肪變性、壞死，有炎性細胞浸潤，并已向肝硬化轉(zhuǎn)化，表明STZ誘發(fā)的高血糖可以促進大鼠肝纖維化發(fā)生，并加劇CCl4對肝纖維化的病變作用。

2.2 各組大鼠肝組織中ASIC1a、α-SMA蛋白表達免疫組化法檢測各組大鼠肝組織中ASIC1a、α-SMA蛋白的表達，陽性染色細胞質(zhì)呈棕黃色顆粒。結(jié)果顯示，正常組大鼠肝臟組織中ASIC1a、α-SMA抗原陽性表達較少，STZ糖尿病大鼠和CCl4肝纖維化大鼠及雙模型組大鼠肝臟組織中ASIC1a、α-SMA抗原陽性細胞明顯增多、著色明顯加深，且多分布在肝實質(zhì)區(qū)域，而雙模型大鼠的抗原細胞及著色較STZ與CCl4單獨誘導(dǎo)的大鼠肝組織明顯增多。提示高糖可加重肝纖維化的發(fā)生，其機制可能與ASIC1a相關(guān)，見Fig 2。

Fig 1 HE staining of rat liver tisssues（HE×200）

Fig 2 Immunostaining signal of ASIC1a and α-SMA（SP×200）

2.3 不同糖濃度培養(yǎng)基對HSC增殖活化的影響MTT結(jié)果（Fig 3）顯示，糖對HSC-T6細胞的活化增殖有促進作用，且這一作用有濃度－時間依賴性，在6 000 mg·L－1濃度，作用48 h時，細胞增殖最佳，與低糖組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Western blot結(jié)果（Fig 4）顯示，高糖可明顯增加HSC-T6細胞中ASIC1a、α-SMA和CollagenⅠ的表達，較低糖組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 阿米洛利對高糖誘導(dǎo)的HSC中ASIC1a表達的調(diào)控作用 結(jié)果如Fig 5所示，阿米洛利（25、50、100、200 μmol·L－1），能夠劑量依賴性的明顯抑制高糖誘導(dǎo)的HSC中ASIC1a的表達，與高糖組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。此外，ASIC1a抑制劑阿米洛利可明顯減少高糖誘導(dǎo)的α-SMA和Colla-genⅠ基因表達，與高糖組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Western blot結(jié)果（Fig 6）還顯示，與高糖組比較，阿米洛利可明顯抑制高糖對PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC-T6中α-SMA和CollagenⅠ表達的促進作用，抑制HSC-T6細胞活化增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

Fig 3 Effect of glucose on proliferation of HSC-T6

Fig 4 Effect of high glucose on expression of ASIC1a，α-SMA and collagen I in HSC-T6

Fig 5 Amiloride inhibits the expression of ASIC1a，α-SMA and collagenⅠin HSC-T6 under high glucose

Fig 6 Amiloride inhibits expression of ASIC1a and relieves effect of high glucose on PDGF-BB induced HSC-T6 cells expression of α-SMA and collagenⅠ

3 討論

糖尿病和肝臟疾病關(guān)系密切，一方面慢性肝損傷可影響糖代謝，導(dǎo)致糖耐量減退和糖尿病。另一方面糖尿病可促進慢性肝病肝纖維化進展，各種慢性肝病的發(fā)生率增高。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，HSC在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，其激活時發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，成為肌成纖維細胞并特異性地表達α-SMA等細胞外基質(zhì)［16］。本研究HE染色結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠肝組織和肝纖維化組大鼠肝組織均出現(xiàn)不同程度的肝臟細胞脂肪變性，并伴有脂肪空泡，膠原沉積，炎性細胞浸潤等現(xiàn)象。在糖尿病肝纖維化雙模型組中，纖維結(jié)締組織增生形成纖維條索，伸入肝實質(zhì)內(nèi)，脂肪空泡多且大，并已向肝硬化轉(zhuǎn)化，表明高血糖可促進肝纖維化發(fā)生，加劇肝纖維化的病變。

有研究表明，在肝纖維化大鼠組織及PDGF-BB誘導(dǎo)的肝星狀細胞中均發(fā)現(xiàn)ASIC1a的高表達，ASIC1a離子通道或通過升高細胞內(nèi)Ca2＋從而促進肝纖維化的發(fā)生［13－14］。本實驗免疫組化結(jié)果顯示，糖尿病組和肝纖維化組大鼠肝組織ASIC1a和α-SMA表達的范圍及棕黃色著色深淺均大于對照組，而糖尿病肝纖維化雙模型組表達進一步加深。提示ASIC1a離子通道開放或在糖尿病肝纖維化的形成過程中起著重要的促進作用。

本研究結(jié)果顯示，高糖培養(yǎng)狀態(tài)下，HSC-T6表達ASIC1a、α-SMA和CollagenⅠ均明顯增加，提示ASIC1a可能參與高糖誘導(dǎo)的HSC的活化增殖。阿米洛利是ASICs家族的有效阻斷劑，在高糖環(huán)境下，阿米洛利阻斷ASIC1a的表達，伴隨著HSC活化增殖標志α-SMA和CollagenⅠ表達的降低，進一步證實高糖對肝纖維化促進作用或與ASIC1a的表達增加有關(guān)。進一步研究顯示，PDGF在高糖環(huán)境下刺激的HSC-T6表達ASIC1a、α-SMA和CollagenⅠ較高糖組明顯增加，提示高糖不僅可以促進HSC活化增殖，更能加劇PDGF對HSC的活化增殖作用。本研究結(jié)果還表明，阻斷ASIC1a表達，抑制高糖對PDGF誘導(dǎo)的HSC活化增殖作用，證實ASIC1a在高糖加劇PDGF誘導(dǎo)HSC活化增殖作用中起重要促進作用。

綜上所述，高血糖可誘導(dǎo)HSC的活化，并增強PDGF-BB誘導(dǎo)HSC表達α-SMA和CollagenⅠ，其機制可能與ASIC1a的變化有關(guān)，為肝纖維化的治療提供新的靶點。

（致謝：本實驗主要在安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院科教大樓分子藥理學(xué)實驗室完成，在此特別感謝實驗室的負責(zé)老師及研究生同學(xué)的支持與幫助！）

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Effect of ASIC1a on hepatic fibrosis under high glucose

WANG Huan，WANG Ying-hong，TIAN Yuan-yao，SUN Shi-wei，HUANG Meng-meng，LI Xiao-feng，MENG Xiao-ming，HUANG Yan
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032，China；Institute for Liver Diseases of Anhui Medical University，Hefei 230032，China）

Aim To investigate the effect of ASIC1a （acid-sensing ion channel 1a）on the pathological change of diabetes complication liver fibrosis and the proliferation and activation of hepatic stellate cell （HSC-T6）stimulated by PDGF-BB under hyperglyce-mia.Methods Diabetes rats model was established by streptozotocin（STZ），and liver fibrosis rats model was induced by carbon tetrachloride（CCl4）.Then，the liver extent of damage and the expression of ASIC1a were observed in the diabetic rats，liver fibrosis rats and diabetes complication liver fibrosis rats.In vitro，after pretreated with amiloride，HSC-T6 was treated with high glucose for 24 h and then stimulated with PDGF-BB for another 24 h.The proliferation and acti-vation of HSC-T6 were observed，and the expression of ASIC1a，α-SMA and collagenⅠwere detected by Western blot.Results Compared with the control group，rats from diabetic group induced by STZ，liver fibrosis group induced by CCl4，and the diabetes com-plication liver fibrosis rats co-induced by STZ and CCl4were all observed with liver damage at different levels，and tissue injury of complication group was most seri-ous.However，the expression of ASIC1a in the three model groups was significantly increased compared to the control group.ASIC1a level was most obvious in the diabetes complication liver fibrosis rats.Amiloride pretreatment significantly decreased ASIC1a expression and inhibited PDGF-BB mediated proliferation and the expression of α-SMA and collagenⅠin HSC-T6 under high glucose environment.Conclusion High ambient glucose aggravates HSC activation and hepatic fibrosis，and this may be related with the increasing expression of ASIC1a.

high glucose；diabetes；hepatic stellate cell；acid-sensing ion channel 1a；hepatic fibrosis；ac-tivation and proliferation

時間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.034.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.017

A

1001－1978（2016）03－0384－06

R-332；R322.47；R329.24；R575.202.2；R587.1；R587.2

2015－09－01，

2015－11－28

安徽省學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人選課題（No 2015H040）；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目資助課題（No gxyq2016049）；安徽醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)（“5＋3”一體化）專業(yè)學(xué)生“早期接觸科研”訓(xùn)練計劃項目（No 2015-ZQKY-46）

王 歡（1990－），女，碩士生，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)，E-mail：wanghuan7＠126.com；黃 艷（1979－），女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：aydhy＠126.com