燈盞細(xì)辛提取物中3種活性成分在Caco-2細(xì)胞模型吸收機(jī)制的研究

胡 杰，侯 佳，李月婷，王愛民，2，黃 勇

（貴州醫(yī)科大學(xué)1.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，3.藥學(xué)院，貴州貴陽 550004）

燈盞細(xì)辛提取物中3種活性成分在Caco-2細(xì)胞模型吸收機(jī)制的研究

胡 杰1，3，侯 佳1，李月婷1，3，王愛民1，2，黃 勇1，3

（貴州醫(yī)科大學(xué)1.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，3.藥學(xué)院，貴州貴陽 550004）

目的 研究燈盞細(xì)辛提取物（erigeron breviscapus ex-tract，Ebe）中3種活性成分燈盞甲素、咖啡酸和綠原酸的吸收機(jī)制。方法 建立人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系（the human colon carcinoma cell line，Caco-2細(xì)胞）模型；利用該模型研究Ebe的細(xì)胞攝取規(guī)律，通過UPLC-MS/MS法測(cè)定Caco-2細(xì)胞中燈盞甲素、咖啡酸和綠原酸的濃度，研究pH、時(shí)間以及藥物濃度對(duì)3種活性成分的轉(zhuǎn)運(yùn)影響；考察在P-糖蛋白抑制劑（維拉帕米、環(huán)孢素A）存在與否時(shí)3種活性成分在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。結(jié)果 受試物Ebe在所設(shè)置的濃度范圍內(nèi)（0.1～25.0 g·L－1）對(duì)Caco-2細(xì)胞無毒副作用。燈盞甲素和綠原酸在Caco-2細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中具有濃度、時(shí)間依賴性，呈正相關(guān)，滲透系數(shù)維持在一個(gè)平衡狀態(tài)?？Х人峋哂袧舛蕊柡托?，且加入P-糖蛋白抑制劑后咖啡酸的細(xì)胞攝取量明顯增加。結(jié)論 Ebe中燈盞甲素和綠原酸主要表現(xiàn)為被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，P-糖蛋白參與了咖啡酸的攝取過程，咖啡酸的吸收主要由載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)現(xiàn)。

吸收；燈盞細(xì)辛提取物；燈盞甲素；咖啡酸；綠原酸；Caco-2細(xì)胞；UPLC-MS/MS法；P-糖蛋白抑制劑

燈盞細(xì)辛是菊科植物短葶飛蓬Erigerm brevisca-pus（Vant.）Hand.-Mazz的干燥全草，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)，具有散寒解表、活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、消炎止痛之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明：燈盞細(xì)辛具有抗血栓、抗缺血以及腦缺血/再灌注神經(jīng)損傷保護(hù)作用。目前已從燈盞細(xì)辛中分離、鑒定出黃酮類化合物、咖啡酸酯類化合物、酚酸類化合物以及其它類化合物［1］。其中燈盞甲素、咖啡酸和綠原酸分別代表這三大類化合物，均具有抗氧化、清除自由基等腦保護(hù)作用，是燈盞細(xì)辛中的有效成分。燈盞甲素、咖啡酸和綠原酸的同時(shí)檢測(cè)能夠較好地代表燈盞細(xì)辛的整體效應(yīng)，符合中藥研究整體觀念的新思路。Caco-2來源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)和生化作用類似人小腸上皮細(xì)胞。將Caco-2細(xì)胞模型作為中藥吸收研究的快速篩選工具，能夠在細(xì)胞水平上提供藥物分子吸收的綜合信息。因此本文采用Caco-2細(xì)胞模型，結(jié)合UPLC-MS/MS法研究燈盞細(xì)辛提取物（erigeron breviscapus extract，Ebe）中有效成分燈盞甲素、咖啡酸和綠原酸的吸收特征，以期為Ebe的口服制劑研究提供一定的科學(xué)依據(jù)，并為中藥體外吸收機(jī)制研究提供新思路［2－5］。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 葛根素（批號(hào)110752-200912）、綠原酸（批號(hào)L11-2013012）、咖啡酸（批號(hào)1163-091112）和燈盞甲素（批號(hào)1384-101215），以上對(duì)照品均購(gòu)自中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；燈盞細(xì)辛提取物自制（批號(hào)：20130615）；Hank’s緩沖溶液（HBSS，Gibco）；DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，Gibco）；考馬斯亮藍(lán)（20140822，南京建成生物工程研究所）；胎牛血清（Fetalbovineseurm，Biochrom）；鏈霉素；胰蛋白酶（Trypsin，igma）；DMSO（北京Solarbio科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器 ACQUITY系統(tǒng)超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器和Masslynx4.1質(zhì)譜工作站（美國(guó)Waters公司）；Allegra 64R高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備總廠）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo scientif-ic）；ZH-2渦旋混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；CQ 250A-TS超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）；置相差顯微鏡（日本Olympus）；功能酶標(biāo)儀（Thermo3001 VARIOSKAN FLASH）；TGL-16G離心機(jī)；Mill cell-ERS電位儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 色譜條件 Waters Acquity BEH C18（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）色譜柱；0.1％甲酸乙腈－0.1％甲酸水梯度洗脫，梯度為0～3 min：5％～25％，3～4 min：25％～95％，4～5 min：5％；流速為0.35 mL ·min－1；柱溫：45℃。進(jìn)樣體積為1 μL［6］。

1.4 質(zhì)譜條件 Waters Acquity TQD質(zhì)譜儀，Mass-LynxV4.1工作站，電噴霧電離源（ESI）；毛細(xì)管電壓：3kV；離子源溫度：120℃；去溶劑氣溫度：350℃；去溶劑氣為氮?dú)猓?50 L·h－1）；碰撞氣為氬氣（0.16 mL·min－1）［6］；掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（MRM），用于定量的正離子對(duì)等質(zhì)譜信息見Tab 1。

Tab 1 Mass spectrometric condition

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取綠原酸、咖啡酸和燈盞甲素適量，用甲醇定容至10 mL。獲得綠原酸（0.5004 g·L－1）、咖啡酸（0.497 g·L－1）和燈盞甲素（1.06 g·L－1）儲(chǔ)備液。分別精密量取綠原酸等3種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，得混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。置冰箱（－20℃）保存，備用。

1.6 Caco-2細(xì)胞模型的建立 Caco-2細(xì)胞株，傳代數(shù)在50代之內(nèi)。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含10％胎牛血清（含3.7 g·L－1NaHCO3，1％L-谷氨酰胺以及105U· L－1青霉素、鏈霉素雙抗液）置于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［2］。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合約80％貼壁時(shí)，采用0.25％胰蛋白酶消化，細(xì)胞按10×104個(gè)·cm－2接種于6孔培養(yǎng)板，接種24 h后更換培養(yǎng)液，以后隔天換培養(yǎng)液1次，1周后每天換液1次，細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，細(xì)胞生長(zhǎng)均勻、邊界清晰，成單層膜狀態(tài)，測(cè)定細(xì)胞跨膜電阻值為300 Ω·cm2以上，可用于攝取實(shí)驗(yàn)［2］。

1.7 細(xì)胞裂解液的制備 將已培養(yǎng)好的Caco-2細(xì)胞用PBS緩沖液洗去其表面雜質(zhì)。加入含藥的Hank’s溶液（考察藥物濃度對(duì)Caco-2細(xì)胞的影響時(shí)，此處加入不同濃度的Ebe Hank’s溶液）2 mL，置于37℃的培養(yǎng)箱中，分別考察不同培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)介質(zhì)不同pH和P-糖蛋白抑制劑對(duì)Ebe細(xì)胞攝取的影響。在考察的培養(yǎng)時(shí)間取出后，加入4℃的PBS緩沖液洗去細(xì)胞表面藥液和雜質(zhì)，加入0.1％ Triton X-100細(xì)胞裂解液500 μL，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，取出細(xì)胞超聲5 min，得細(xì)胞裂解液［2］。

1.8 樣品前處理方法 取轉(zhuǎn)運(yùn)樣品（細(xì)胞裂解液或細(xì)胞混懸液）300 μL，加入10 μL葛根素內(nèi)標(biāo)和300 μL甲醇沉淀蛋白，渦混2 min，離心（4℃，15 000 r·min－1）10 min，分離上清液2 μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

2.1 UPLC-MS/MS分析方法的確證 分別取空白細(xì)胞混懸液、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（內(nèi)標(biāo)為葛根素）以及進(jìn)行攝取實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞樣品溶液，渦旋2 min，離心（15 000 r·min－1）10 min，分離出上清液進(jìn)樣分析。在本實(shí)驗(yàn)條件下，空白細(xì)胞混懸液中無雜質(zhì)峰干擾，細(xì)胞混懸液中綠原酸，咖啡酸、燈盞甲素及內(nèi)標(biāo)葛根素分離完全，保留時(shí)間Rt分別為1.55、1.77、3.19、1.87 min。結(jié)果見Fig 1，圖中以時(shí)間為橫坐標(biāo)，百分強(qiáng)度為縱坐標(biāo)。

以混合溶液中的藥物濃度為橫坐標(biāo)，樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，得到燈盞細(xì)辛提取物的工作曲線，其線性范圍、回歸方程如Tab 2所示。

Tab 2 Linear relationships of three components

選取Tab 2中2、4、6這3個(gè)濃度的標(biāo)液，加入空白細(xì)胞混懸液中作為質(zhì)量控制樣品（QC），分別進(jìn)樣分析，將測(cè)定的濃度與加入的已知標(biāo)液濃度比較，求得提取回收率為90.2％～105.8％。每一個(gè)濃度進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，日內(nèi)精密度RSD％ 為0.11％～8.44％；日間精密度RSD％為0.11％～6.43％。上述質(zhì)控樣品分別于室溫下保存1、2和 3 d后處理并測(cè)定，與零時(shí)測(cè)定結(jié)果比較，RSD％均＜15％。以上結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定、靈敏，重現(xiàn)性好。

Fig 1 Typical UPLC-MS/MS chromatograms

Fig 2 Study on toxicity of Ebe to Caco-2 cells（±s，n＝5）

2.2 不同濃度Ebe對(duì)Caco-2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、藥物組。對(duì)照組每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)液；藥物組將藥物稀釋至不同體積比濃度：0.1、1、5、15、25 g·L－1，每孔加入100 μL。分別作用Caco-2細(xì)胞4 h后用MTT法檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)每個(gè)濃度平行5孔，重復(fù)3次，結(jié)果見Fig 2，對(duì)照組與各給藥組間細(xì)胞生長(zhǎng)情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在所設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，Ebe對(duì)Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)無毒性作用，可以進(jìn)行下一步攝取實(shí)驗(yàn)。

2.3 濃度依賴性攝取實(shí)驗(yàn) 取不同濃度的Ebe Hank’s溶液（0.3、1、2.5、4、5 g·L－1）2 mL（n＝3）加入Caco-2細(xì)胞中，于37℃條件培養(yǎng)60 min，考察不同濃度Ebe對(duì)細(xì)胞攝取的影響。結(jié)果見圖3，燈盞甲素和綠原酸的攝取量隨著Ebe溶液濃度的增加而緩慢增加；咖啡酸隨著Ebe溶液濃度的增加，先增加，后減少。

Fig 3 Effects of different concentrations of Ebe on uptake of Caco-2 cells（±s，n＝5）

2.4 時(shí)間對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取的影響 將Ebe（4 g ·L－1）加入到培養(yǎng)好的細(xì)胞中，考察不同時(shí)間（15、 30、60、90、120、180 min）后Ebe中各成分作用被Ca-co-2細(xì)胞攝取的變化。結(jié)果見Fig 4，隨著攝取時(shí)間的延長(zhǎng)，綠原酸和燈盞甲素的攝取量緩慢增加，而咖啡酸的攝取量呈遞減趨勢(shì)，可能受藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)器的影響，使已攝取入胞內(nèi)的部分咖啡酸排出細(xì)胞。

Fig 4 Effects of different time of Ebe on uptake of Caco-2 cells（±s，n＝5）

2.5 pH值對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取的影響 將Ebe（4 g·L－1）分別溶于不同pH（4.0、6.0、7.4）Hank’s溶液中，在加藥培養(yǎng)60 min后測(cè)定不同pH值對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取Ebe的影響。結(jié)果見Fig 5，燈盞甲素、綠原酸的細(xì)胞攝取量隨pH值增加而降低，咖啡酸的細(xì)胞攝取量隨pH值增加而明顯增加，表明Ebe中各成分的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于pH，綜合各成分的吸收特征確定藥物吸收的最佳pH值有利于藥物的最大吸收。

Fig 5 Effects of different pH of Ebe on uptake of Caco-2 cells（±s，n＝5）

2.6 p-糖蛋白抑制劑對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取的影響P-糖蛋白抑制劑維拉帕米（verapamil，50 mg·L－1）和環(huán)孢素A（cyclosporine A，10 mg·L－1）對(duì)Ebe中各成分轉(zhuǎn)運(yùn)的影響見Tab 3。燈盞甲素和綠原酸的細(xì)胞攝取量與對(duì)照組相比差異均無顯著性（P＞0.05），表明燈盞甲素和綠原酸的攝取不受P-gp影響。而維拉帕米和環(huán)孢素A均能影響咖啡酸的攝取，P-糖蛋白抑制劑的參與使咖啡酸的攝取量明顯增加（P≤0.05）。

Tab 3 Effect of verapamil and cyclosporine A on uptake by Caco-2 cell monolayers（±s，n＝3）

Tab 3 Effect of verapamil and cyclosporine A on uptake by Caco-2 cell monolayers（±s，n＝3）

*P＜0.05 vs extract.

Composition Uptake/mg·g－1Pro Chlorogenic acid 0.11±0.03 Verapamil＋Chlorogenic acid 0.10±0.01 Cyclosporin A＋Chlorogenic acid 0.11±0 3，4-Dihydroxycinnamic acid 0.15±0.01 Verapamil＋3，4-Dihydroxycinnamic acid 0.19±0.02*CyclosporinA＋3，4-Dihydroxycinnamic acid 0.19±0.02*Apigenin-7-O-glucronide 9.46±2.59 Verapamil＋Apigenin-7-O-glucronide 9.52±2.11 CyclosporinA＋Apigenin-7-O-glucronide 10.03±0.87

3 討論

Caco-2細(xì)胞模型是目前國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的體外吸收模型，已成為藥物吸收研究的快速篩選工具，并獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)。該模型能夠在細(xì)胞水平上提供藥物透過小腸黏膜的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及毒性的綜合信息。用Caco-2細(xì)胞模型可以分別研究藥物從AP側(cè)（apical side）的攝入和BL側(cè)（basolateral side）的外排過程，該模型能夠較好地闡明藥物在小腸中的吸收機(jī)制，而動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則無法做到［7］。

Caco-2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ebe中各成分的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于pH，且各成分吸收的最佳pH并不一致，綜合Ebe中各成分的吸收特征確定其吸收的最佳pH，將有助于該藥物制劑的設(shè)計(jì)。Ebe中咖啡酸的吸收具有飽和現(xiàn)象，其吸收機(jī)制可能為載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，維拉帕米和環(huán)孢素A的參與能夠明顯提高咖啡酸的吸收。因此，咖啡酸可能是P-糖蛋白的底物，其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)中的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。P-糖蛋白作為主要的藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)器，能將其底物從漿膜側(cè)泵回黏膜側(cè)而進(jìn)入腸腔排出，其結(jié)果可能會(huì)導(dǎo)致藥物透膜吸收減少，生物利用度降低。因此，對(duì)于某些可被P-糖蛋白識(shí)別并外排的藥物，通過抑制P-糖蛋白的表達(dá)可促進(jìn)藥物吸收，提高其生物利用度［8－9］。

研究顯示，中藥防治疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)是多成分協(xié)同作用的綜合結(jié)果。因此，同時(shí)研究中藥中多個(gè)成分的吸收特征，將多成分整體性質(zhì)擬合進(jìn)行綜合分析，符合中藥研究整體觀念新思路。并且在中藥多成分研究中，有預(yù)見性地針對(duì)吸收性質(zhì)不良或特殊的成分提出新的口服劑型方案，將對(duì)中藥口服劑型的現(xiàn)代化發(fā)展和走向世界起到重要作用［10］。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)在貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心聯(lián)合完成。真誠(chéng)感謝貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心為本實(shí)驗(yàn)開展提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)耗材與儀器設(shè)備。真誠(chéng)感謝實(shí)驗(yàn)室各位同事、老師在實(shí)驗(yàn)中給予我的指導(dǎo)與幫助。）

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In vitro absorption mechanism of Erigeron breviscapus extract in Caco-2 cell monolayer model

HU Jie1，3，HOU Jia1，LI Yue-ting1，3，WANG Ai-min1，2，HUANG Yong1，3
（1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics；2.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM（Ministry of Education）；3.School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

Aim To study the absorption mechanism of apigenin-7-O-glucronide，3，4-Dihydroxycinnamic acid and chlorogenic acid in Erigeron breviscapus extract （Ebe）by Caco-2 cell monolayer model.Methods The three active ingredients were quantified by UPLC-MS/MS method，and the effect of Ebe concentrations，conveying times，pH values and P-glycoprotein inhibi-tor on the transport of three active ingredients were also investigated.Results Apigenin-7-O-glucronide and chlorogenic acid in Caco-2 cell monolayer model were time-dependent and concentration-dependent.The 3，4-Dihydroxycinnamic acid in Caco-2 cell uptake was concentration-saturate and P-glycoprotein inhibitor was involved in the uptake process.Conclusion The mechanism of apigenin-7-O-glucronide and chlorogenic acid absorption in cells is mainly through passive trans-port，and the absorption of 3，4-Dihydroxycinnamic acid is mainly realized by the carrier transport.

absorption；Erigeron breviscapus extract；apigenin-7-O-glucronide； 3，4-Dihydroxycinnamic acid；chlorogenic acid；Caco-2 cell；UPLC-MS/MS method；P-glycoprotein inhibitor

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.030.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.015

A

1001－1978（2016）03－0373－05

R284.1；R329.24；R977.6

2015－10－22，

2015－12－17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81260636）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（No黔科合J字［2013］2035號(hào)）；貴州省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計(jì)劃（No黔教合協(xié)同創(chuàng)新字No ［2013］04）；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)專項(xiàng)基金項(xiàng)目（No黔科合重G字［2013］4001）；貴州省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（No QZYY-2015-080）

胡 杰（1991－），女，碩士生，E-mail：hujie51619＠sina.cn；黃 勇（1976－），男，博士，教授，研究方向：中藥活性成分及新藥開發(fā)，通訊作者，Tel/Fax：0851-86908899，E-mail：759843553＠qq.com