大黃酸對馬兜鈴酸A引起的斑馬魚腎臟損傷的保護(hù)作用

王 雪，劉可春，王希敏，韓利文，張姍姍，何秋霞，陳錫強(qiáng)，韓 建，王榮春

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東省科學(xué)院斑馬魚藥物篩選平臺(tái)，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250014）

大黃酸對馬兜鈴酸A引起的斑馬魚腎臟損傷的保護(hù)作用

王 雪，劉可春，王希敏，韓利文，張姍姍，何秋霞，陳錫強(qiáng)，韓 建，王榮春

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東省科學(xué)院斑馬魚藥物篩選平臺(tái)，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250014）

目的 觀察大黃酸在馬兜鈴酸A引起的斑馬魚腎臟損傷中的作用。方法 將腎臟發(fā)育完成的斑馬魚仔魚（4dpf）用馬兜鈴酸A處理24 h，造成馬兜鈴酸腎病模型，同時(shí)加入大黃酸處理，然后觀察仔魚的表型變化情況，并用肌酐檢測試劑盒測定仔魚組織中的肌酐含量，利用qPCR對仔魚組織中的炎性相關(guān)因子（cox2a）和致纖維化因子（TGFβ-1）進(jìn)行定量檢測。結(jié)果 馬兜鈴酸A處理24h后，部分仔魚出現(xiàn)眼周水腫及血循環(huán)系統(tǒng)異常，表現(xiàn)為心跳微弱，心腔縮小，血流緩慢甚至停滯，發(fā)生率具有劑量相關(guān)性，馬兜鈴酸處理組仔魚組織中的肌酐含量比對照組明顯升高，cox2a和TGFβ-1表達(dá)量也比對照組明顯上升，同時(shí)加入大黃酸能降低異常仔魚所占比例，降低組織肌酐含量，并下調(diào)cox2a的表達(dá)，但對馬兜鈴酸引起的TGFβ-1的上升無影響。結(jié)論

大黃酸對馬兜鈴酸引起的斑馬魚腎臟損傷有一定的保護(hù)作用。

馬兜鈴酸；斑馬魚；仔魚；腎臟；大黃酸；肌酐

大黃酸（rhein，Rhe）屬單蒽核類1，8-二羥基蒽醌衍生物，是大黃、何首烏、虎杖等多種中藥的主要有效成分之一，藥理作用廣泛。在糖尿病腎病大鼠，大黃酸能下調(diào)血清中IL-1β、IL-12和TNF-α等細(xì)胞因子的濃度，減輕炎癥反應(yīng)，減少糖尿病腎病大鼠尿蛋白泄漏，改善血脂異常，在糖尿病腎病各期發(fā)揮多靶點(diǎn)、多層次的治療作用［1］。大黃酸對腎臟纖維化形成的多個(gè)環(huán)節(jié)有治療作用。病理狀態(tài)下，以轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1為主導(dǎo)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)激活成纖維細(xì)胞為肌成纖維細(xì)胞，并能將許多腎臟固有細(xì)胞如腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致腎臟纖維化發(fā)生。大黃酸能抑制促纖維化因子TGF-β1的表達(dá)，阻止間質(zhì)成纖維細(xì)胞的激活，阻斷腎間質(zhì)的纖維化進(jìn)程，在多種腎臟疾病中發(fā)揮腎保護(hù)作用［2］。在亞慢性鎘染毒小鼠，大黃酸對肝臟及腎損傷表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用［3］。

馬兜鈴酸（aristolochic acid，AA）對多種動(dòng)物種屬具有腎毒性，主要損傷腎小管上皮細(xì)胞，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化及腎萎縮，并出現(xiàn)低分子蛋白尿、嚴(yán)重貧血癥狀，被稱為“馬兜鈴酸腎病”。實(shí)驗(yàn)中用馬兜鈴酸處理發(fā)育早期的斑馬魚，會(huì)引起仔魚水腫和腎臟形態(tài)功能異常，引起不可逆性腎臟損傷并終至仔魚死亡［4］。目前，臨床上對“馬兜鈴酸腎病”僅以預(yù)防為主，尚未找到有效的治療藥物和方法。本研究在利用馬兜鈴酸A進(jìn)行染毒處理造成斑馬魚腎臟損傷的基礎(chǔ)上，加用大黃酸進(jìn)行干預(yù)，通過檢測腎臟功能相關(guān)指標(biāo)的變化，研究大黃酸在馬兜鈴酸腎病中的作用，并為利用斑馬魚模型篩選具有潛在治療腎臟損傷活性的化合物提供方法和思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所用為AB系野生型斑馬魚，在水溫28.5℃，保持14 h光照/10 h黑暗光照周期條件下養(yǎng)殖，每日于9：00 am和3：00 pm喂食兩次顆粒飼料。排卵前日將♀♂斑馬魚成魚按2∶1放入具篩板的產(chǎn)卵缸內(nèi)，中間放置隔板，次日亮燈前抽去隔板，在光照刺激下排卵后，收集魚卵，用培養(yǎng)水沖洗3遍，然后放入新培養(yǎng)水中，在28.5℃，相同光照條件下發(fā)育至4 d大小。

1.2 試劑 馬兜鈴酸A（MW：341.27，純度≥99.0％）與大黃酸（MW：284.22，純度≥99.0％），均購自于中國食品藥品檢定研究院，分別用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解配制成儲(chǔ)液。TR-Izol試劑（美國Invitrogen公司），PrimeScriptTM1st Strand cDNA合成試劑盒（大連寶生物工程有限公司），iTaq Universal SYBR Green Supermix（美國Bio-Rad公司），Creatinine Assay kit ab65340與10 ku Spin Column ab93349（Abcam），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

胚胎培養(yǎng)水成分為：NaCl 5 mmol·L－1，KCl 0.17 mmol·L－1，CaCl20.4 mmol·L－1，MgSO40.16 mmol·L－1，用去離子水配制。

熒光定量PCR儀CFX96（美國Bio-Rad）；倒置顯微鏡IX51（日本Olympus），Spectra MR型酶標(biāo)儀（美國Dynex），MICCRA D-1勻漿器（德國ART）

2 方法

2.1 斑馬魚分組與給藥 選用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。吸取適量馬兜鈴酸A儲(chǔ)液至孔內(nèi)，加入培養(yǎng)水進(jìn)行稀釋，分別得到20 μmol·L－1和40 μmol ·L－1馬兜鈴酸A溶液作損傷組；向孔內(nèi)同時(shí)加入馬兜鈴酸A與大黃酸儲(chǔ)液，用培養(yǎng)水稀釋得到含上述濃度馬兜鈴酸A與40 μmol·L－1大黃酸的混合液作為治療組；馬兜鈴酸A與大黃酸濃度由預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。向孔內(nèi)加入含DMSO的培養(yǎng)水（DMSO含量≤0.5％V/V）作為溶劑對照組，小心混勻各孔溶液。隨機(jī)選取發(fā)育4dpf的斑馬魚仔魚，移入上面各孔溶液內(nèi)，每孔中放置30尾仔魚，每孔同時(shí)做3個(gè)平行重復(fù)，然后放于恒溫控光培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育24 h。

處理結(jié)束后，在倒置顯微鏡下觀察各組仔魚形態(tài)，記錄仔魚異常情況并計(jì)數(shù)，拍照。

2.2 斑馬魚仔魚組織中肌酐含量檢測 肌酐是肌肉的代謝產(chǎn)物，由前體化合物磷酸肌酸轉(zhuǎn)化而成，正常情況下，每日產(chǎn)生的肌酐主要由腎小球?yàn)V過排出體外。肌酐的含量變化主要由腎臟濾過能力決定，腎功能受損時(shí)，肌酐在體內(nèi)蓄積，含量升高。

實(shí)驗(yàn)中收集各處理組與對照組中存活仔魚，用純凈水充分沖洗后，移入2 mL離心管，盡量吸凈水分，然后向每管加入500 μL去離子水，冰浴勻漿。將勻漿樣品加入10 ku Spin Column中，4℃，10 000 ×g，離心10min，除去樣品中的蛋白成分，收集濾液。然后按Creatinine Assay kit操作步驟，吸取濾液與肌酐反應(yīng)液混合，37℃，反應(yīng)1 h，于570 nm處讀取OD值。根據(jù)肌酐標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算各樣品中的肌酐含量，進(jìn)一步計(jì)算得到各組斑馬魚仔魚組織中的肌酐含量。

2.3 qPCR檢測斑馬魚仔魚組織TGFβ-1、cox2a基因的表達(dá)量 馬兜鈴酸導(dǎo)致腎臟損害的重要特征是腎間質(zhì)纖維化，同時(shí)伴有炎癥反應(yīng)發(fā)生。在利用斑馬魚為模型進(jìn)行馬兜鈴酸腎病研究中，已檢測到促炎性因子cox2a與致纖維化因子TGFβ-1表達(dá)量上升，說明TGFβ-1與cox2a這兩種因子的表達(dá)水平與馬兜鈴酸腎病發(fā)病機(jī)制及病程進(jìn)展密切相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)中收集對照組和處理組的存活斑馬魚仔魚，用滅菌水沖洗后，分別加入TRIzol試劑提取仔魚組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取1 μL cDNA產(chǎn)物進(jìn)行qPCR，檢測各組斑馬魚仔魚組織中TGFβ-1、cox2a基因的表達(dá)情況，以β-actin作為內(nèi)參基因。qPCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：95℃30 s，95℃5 s，60℃40 s，40個(gè)循環(huán)。采用2－△△Cq法分析基因的相對表達(dá)量：△Cq（處理組）＝Cq（處理組目的基因）－Cq（對照組內(nèi)參基因），△Cq（對照組）＝Cq（對照組目的基因）－Cq（對照組內(nèi)參基因），△△Cq＝△Cq（處理組）－△Cq（對照組），以2－△△Cq表示處理組目的基因的表達(dá)倍數(shù)。

β-actin：forward 5′AGAGCTATGAGCTGCCT-GACG 3′；reverse 5′CCGCAAGATTCCATACCCA 3′；cox2a：forward 5′ATCCTGTTGTCAAGGTCCCA 3′；re-verse 5′CAAGGGTGCGGGTGTAAT 3′；TGFβ-1：for-ward 5′GAACTCGCTTTGTCTCCA 3′；reverse 5′TACAGTCGCAGTATAACCTCA 3′。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組均值用±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法比較組間差異的顯著性。

3 結(jié)果

3.1 不同處理組斑馬魚仔魚的表型與存活情況發(fā)育4 dpf的斑馬魚仔魚經(jīng)馬兜鈴酸A處理24 h后，部分仔魚出現(xiàn)明顯的眼周水腫表現(xiàn)，發(fā)生率與馬兜鈴酸A濃度呈相關(guān)性。當(dāng)馬兜鈴酸A濃度升高至40μmol·L－1時(shí)，除眼周水腫外，斑馬魚仔魚的血循環(huán)系統(tǒng)也出現(xiàn)中毒癥狀，表現(xiàn)為心跳微弱、心腔縮小，血流緩慢甚至停滯（Fig 1），仔魚的活動(dòng)能力明顯降低。用40 μmol·L－1大黃酸與馬兜鈴酸A同時(shí)對斑馬魚仔魚進(jìn)行處理，24 h后，出現(xiàn)上述異常的仔魚比例較損傷組均有顯著降低。處理時(shí)間為24 h時(shí)，各處理組仔魚的死亡率與對照組比較差異無顯著性（Tab 1）。

3.2 斑馬魚仔魚組織中肌酐含量 在發(fā)育5 dpf時(shí)，正常對照組斑馬魚仔魚組織中的肌酐含量值為每50尾（153.51±7.1）nmoL。4 dpf的斑馬魚仔魚經(jīng)馬兜鈴酸A（20 μmol·L－1）和大黃酸（40 μmol· L－1）處理24 h后，損傷組與治療組仔魚組織中肌酐含量值與對照組相比無明顯變化。在40 μmol· L－1馬兜鈴酸A處理組，斑馬魚仔魚組織肌酐含量值升高至每50尾（183.30±8.2）nmoL，高于對照組，差異有顯著性。大黃酸治療組仔魚組織肌酐值為每50尾（159.23±5.6）nmoL，比損傷組有明顯降低。

Tab 1 Defective phenotypes and mortality of zebrafish larvae after exposure to aristolochic acid and rhein

Fig 1 Phenotypes of zebrafish larvae after aristolochic acid treatment

Fig 2 Creatinine value in zebrafish larvae of different treatment groups

3.3 斑馬魚仔魚TGFβ-1、cox2a基因的表達(dá) 經(jīng)20 μmol·L－1馬兜鈴酸A處理24 h后，斑馬魚仔魚組織中cox2a表達(dá)水平為對照組的（4.43±0.475）倍，差異有顯著性，同時(shí)加入大黃酸能明顯降低cox2a表達(dá)水平，但與對照組相比，仍有明顯升高。在馬兜鈴酸A濃度為20 μmol·L－1時(shí)，損傷組與大黃酸治療組TGFβ-1的表達(dá)量與對照組均無明顯差異。馬兜鈴酸A濃度為40 μmol·L－1時(shí)，處理24 h后，仔魚組織中cox2a、TGFβ-1的表達(dá)量比對照組均有明顯升高，分別為對照組的（9.55±0.407）和（1.59±0.074）倍，大黃酸治療組cox2a的表達(dá)仍保持在較高水平，與損傷組差異無顯著性。見Fig 3。

4 討論

目前已知，服用含馬兜鈴酸成分的中藥材會(huì)嚴(yán)重?fù)p害腎臟功能，并導(dǎo)致腎臟癌變發(fā)生。馬兜鈴酸引起腎臟損傷的機(jī)制隨劑量不同而有差別，在大劑量下，馬兜鈴酸直接引起腎小管上皮細(xì)胞急性壞死，進(jìn)而發(fā)生腎間質(zhì)纖維化；長期小劑量攝入時(shí)，馬兜鈴酸與細(xì)胞DNA形成AA-DNA加合物，引起DNA斷裂，導(dǎo)致腎小管損傷和腎間質(zhì)纖維化。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用馬兜鈴酸處理發(fā)育早期的斑馬魚胚胎，會(huì)引起胚胎腎臟形態(tài)發(fā)育異常和腎臟功能受損［4］。斑馬魚發(fā)育周期短，受精72 hpf時(shí)，腎臟發(fā)育已經(jīng)完成，具備成熟的濾過排泄功能。在胚胎期，斑馬魚腎臟在進(jìn)化階段上屬于前腎，前腎結(jié)構(gòu)相對簡單，僅由一對腎單位組成，但在分子水平和生物功能上與哺乳動(dòng)物類相似，是進(jìn)行化合物腎臟毒性研究的理想模型。

Fig 3 Expression levels of TGFβ-1 and cox2a genes in zebrafish larvae of different treatment groups

本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)育4dpf的斑馬魚仔魚經(jīng)馬兜鈴酸A處理24 h后，仔魚出現(xiàn)明顯的眼周水腫。水腫是腎臟疾病患者的常見癥狀，是由于腎功能受損致使水分無法排出，潴留在組織間隙引起。已有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在腎臟功能發(fā)生損傷時(shí)，斑馬魚也會(huì)出現(xiàn)局部或全身水腫表現(xiàn)。在Zhou等［5］實(shí)驗(yàn)中，用甲硝唑處理Tg（pod：：NTR-mCherry）斑馬魚，誘導(dǎo)腎臟足細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致腎臟功能受損后，胚胎出現(xiàn)明顯的眼周水腫表現(xiàn)。但另一方面，在基于斑馬魚模型進(jìn)行的化合物毒性實(shí)驗(yàn)中，水腫是一種較為常見的表型改變，可繼發(fā)于多種器官毒性損傷，而非腎臟損傷特異。為進(jìn)一步確認(rèn)腎臟損傷情況，實(shí)驗(yàn)中選取了與腎臟功能相關(guān)的特異指標(biāo)進(jìn)行檢測。肌酐是肌肉組織的代謝產(chǎn)物，每日產(chǎn)生的肌酐均由腎臟排出體外，腎臟功能受損時(shí)，肌酐在體內(nèi)蓄積。在臨床上，檢測血肌酐值是診斷腎臟疾病的常用手段。由于斑馬魚仔魚體積小，不易獲取血液樣本，本實(shí)驗(yàn)中對仔魚組織中的肌酐進(jìn)行提取檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在40 μmol ·L－1馬兜鈴酸A處理組，斑馬魚仔魚組織中肌酐含量值較正常組有明顯提高，說明仔魚的腎臟功能受到損害，肌酐排泄受阻，致使肌酐在體內(nèi)出現(xiàn)蓄積。

作為多種中藥材的有效成分之一，大黃酸具有抗炎、降低纖維化等藥理活性，能降低糖尿病腎病鼠的尿蛋白水平，減輕腎臟肥大。為觀察大黃酸對斑馬魚馬兜鈴酸腎病中的保護(hù)作用，在本實(shí)驗(yàn)中，在用馬兜鈴酸A處理造成腎臟損傷的同時(shí)加入大黃酸作為治療組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療組仔魚眼周水腫和血循環(huán)系統(tǒng)異常的發(fā)生率較相應(yīng)損傷組均有明顯降低，同時(shí)，大黃酸能降低馬兜鈴酸A處理組仔魚組織的肌酐值，說明大黃酸在馬兜鈴酸所致的腎臟損傷中具有腎臟保護(hù)作用。馬兜鈴酸導(dǎo)致腎臟損害的一個(gè)重要特征是腎間質(zhì)發(fā)生纖維化，同時(shí)伴有炎癥反應(yīng)的發(fā)生，因此，本實(shí)驗(yàn)中對各組仔魚組織的炎性相關(guān)因子cox2a和致纖維化因子TGF-β1的基因表達(dá)量進(jìn)行了檢測。發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸A處理組cox2a和TGF-β1基因的表達(dá)水平較對照組有明顯升高，并具有劑量相關(guān)性。在馬兜鈴酸A低濃度（20 μmol· L－1）處理組，合并加入大黃酸后能明顯降低cox2a的表達(dá)水平，但在馬兜鈴酸A高濃度（40 μmol· L－1）組，大黃酸對cox2a表達(dá)量的影響并不明顯，損傷組與治療組cox2a的表達(dá)水平均明顯高于對照組。以往在糖尿病腎病大鼠模型中觀察到大黃酸能夠下調(diào)TGF-β1表達(dá)水平，抑制腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，阻止纖維化發(fā)生。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在馬兜鈴酸引起的腎臟損傷中大黃酸對TGF-β1的表達(dá)水平幾乎沒有影響。蘇健等［6］用慢性移植腎腎?。–AN）大鼠模型研究大黃酸對抗纖維化因子的影響，發(fā)現(xiàn)隨著CAN病程的進(jìn)展，腎組織TGF-β1的表達(dá)明顯增加，加入大黃酸未影響CAN進(jìn)展過程中TGF-β1的表達(dá)。由此可見，在不同類型的腎臟疾病中，大黃酸對TGF-β1產(chǎn)生不同作用，這也提示我們，大黃酸對TGF-β1的下調(diào)及阻抑并不是其發(fā)揮抗纖維化活性的唯一機(jī)制。

綜上所述，在斑馬魚馬兜鈴酸腎病模型中，加入大黃酸進(jìn)行處理，能減少異常發(fā)生率，降低仔魚組織中的肌酐含量，顯示出一定的腎臟保護(hù)作用。大黃酸安全性高、藥理活性廣泛，尤其在糖尿病腎病治療中的獨(dú)特療效已得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，目前國內(nèi)已將單體大黃酸列為一類新藥進(jìn)行重點(diǎn)研究，相信經(jīng)過體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)及臨床療效確證，大黃酸將能在腎臟功能保護(hù)及腎臟損傷治療方面得到更為廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)利用斑馬魚腎臟損傷模型評價(jià)化合物的活性，充分利用了斑馬魚產(chǎn)卵量大、發(fā)育周期短的優(yōu)勢，可以快速篩選獲得具有腎臟保護(hù)作用的活性成分，極大提高了新藥發(fā)現(xiàn)和研發(fā)效率。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)全部于山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選研究室完成，在此表示衷心感謝！）

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Protective effect of rhein on aristolochic acid-induced renal injury in zebrafish

WANG Xue，LIU Ke-chun，WANG Xi-min，HAN Li-wen，ZHANG Shan-shan，HE Qiu-xia，CHEN Xi-qiang，HAN Jian，WANG Rong-chun
（Biology Institute of Shandong Academy of Sciences，Zebrafish Drug Screening Platform of Shandong Academy of Sciences，Key Laboratory for Biosensors of Shandong Province，Jinan 250014，China）

Aim To study the effect of rhein on renal damage induced by aristolochic acid.Methods Ze-brafish model of aristolochic acid nephropathy，genera-ted by treating zebrafish larvae with aristolochic acid for 24 h，was treated with rhein simultaneously.Mor-pholigical changes were observed and the creatinine level in larvae tissue was measured.And mRNA ex-pression levels of inflammatory factor cox2a and fibrosis factor TGF-β1 in larvae tissue were detected using qPCR.Results Some larvae show periocular edema and circulation system defection e.g.weak heart beat，narrow cardiac vesicle，decreased blood flow and even blockage，with a dose-response relationship after expo-sure to aristolochic acid for 24 h.The creatinine level in larvae tissue of the treated group was significantly higher than that of the control larvae.And the expres-sion levels of cox2a and TGF-β1 in larvae tissue of the treated group were also significantly increased.Per-centage of abnormal larvae and creatinine level in lar-vae tissue were decreased when treated with rhein sim-ultaneously.And the expression levels of cox2a was down-regulated by rhein compared with the aristolochic acid treated group.But rhein had no effect on TGF-β1 expression.Conclusion To some extent rhein can protect renal from damage induced by aristolochic acid.

aristolochic acid；zebrafish；larvae；kid-ney；rhein；creatinine

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.026.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.013

A

1001－1978（2016）03－0361－05

R-332；R284.1；R322.61；R692.01

2015－10－09，

2015－12－24

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81202584，31400979）；山東省自主創(chuàng)新重大專項(xiàng)（No 2014ZZCX0215）

王 雪（1978－），女，碩士，高級(jí)工程師，研究方向：藥物毒性評價(jià)及活性篩選，E-mail：wangxue8809＠163.com；劉可春（1964－），男，博士，研究員，通訊作者，Tel：0531-82605352，E-mail：hliukch＠sdas.org