八肽膽囊收縮素及其受體拮抗劑對(duì)嗎啡戒斷大鼠腦內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)的影響

張雅靜，文 迪，楊勝昌，于 峰，馬春玲，叢 斌

（1.河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)系，河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050017；2.石家莊市第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北石家莊 050011）

八肽膽囊收縮素及其受體拮抗劑對(duì)嗎啡戒斷大鼠腦內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)的影響

張雅靜1，2，文 迪1，楊勝昌1，于 峰1，馬春玲1，叢 斌1

（1.河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)系，河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050017；2.石家莊市第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北石家莊 050011）

目的 觀察八肽膽囊收縮素（CCK-8）、CCK-1受體拮抗劑L-364，718及CCK-2受體拮抗劑LY-288，513對(duì)嗎啡戒斷大鼠額葉皮質(zhì)、海馬、紋狀體細(xì)胞內(nèi)鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）表達(dá)的影響。方法 建立嗎啡依賴及納洛酮催促戒斷大鼠模型，觀察CCK-8、L-364，718及LY-288，513對(duì)嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的影響；采用Western blot方法檢測(cè)上述腦區(qū)CaMKⅡ蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果①CCK-8、L-364，718及LY-288，513能明顯改善嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的發(fā)生；②與鹽水對(duì)照組相比，嗎啡依賴組大鼠額葉皮質(zhì)、海馬、紋狀體細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)明顯升高；納洛酮催促戒斷后上述腦區(qū)CaMKⅡ蛋白表達(dá)較嗎啡依賴組均明顯降低；③CCK-8、L-364，718及LY-288，513均使嗎啡戒斷大鼠額葉皮質(zhì)、海馬及紋狀體內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)升高。結(jié)論 CaMKⅡ參與了嗎啡依賴及戒斷的形成，CCK-8及其受體拮抗劑抑制嗎啡依賴大鼠戒斷反應(yīng)的機(jī)制可能與其對(duì)相關(guān)腦區(qū)CaMKⅡ蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)。

八肽膽囊收縮素；L-364，718；LY288，513；嗎啡依賴；嗎啡戒斷；鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白激酶Ⅱ

阿片類物質(zhì)長(zhǎng)期濫用引起了相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)突觸可塑性的改變，導(dǎo)致阿片類成癮，一旦斷藥，將出現(xiàn)以戒斷癥狀為表現(xiàn)的生理功能紊亂，并導(dǎo)致患者產(chǎn)生復(fù)吸，因此尋找安全、快速、有效的脫毒方法刻不容緩。八肽膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK-8）作為最強(qiáng)的內(nèi)源性抗阿片肽類物質(zhì)，通過(guò)與CCK-1和CCK-2受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。我室既往研究已證實(shí)，CCK-8及其受體拮抗劑可以翻轉(zhuǎn)納洛酮催促戒斷后所致相關(guān)腦區(qū)細(xì)胞內(nèi)鈣離子（［Ca2＋］i）和鈣調(diào)蛋白（CaM）活性的下降［1］。CaMKⅡ作為Ca2＋-CaM-CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的下游信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶和突觸可塑性中發(fā)揮重要作用［2－3］。因此本實(shí)驗(yàn)將重點(diǎn)研究CCK-8及其受體拮抗劑L-364，718及LY-288，513對(duì)嗎啡依賴大鼠戒斷反應(yīng)的影響是否與調(diào)節(jié)相關(guān)腦區(qū)細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)有關(guān)，為戒毒提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 鹽酸嗎啡（morphine hydrochlo-ride，Mor）為沈陽(yáng)第一制藥廠產(chǎn)品；CCK-8、納洛酮（naloxone，Nal）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CCK-1受體拮抗劑（L-364，718）及CCK-2受體拮抗劑（LY-288，513）購(gòu)自英國(guó)Tocris公司，CaMKⅡ兔抗大鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，HRP-山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)KPL公司。

1.2 動(dòng)物分組及給藥方式 清潔級(jí)健康♂Wistar大鼠42只，體質(zhì)量190～210 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫（22± 1）℃，濕度50％，自然晝夜循環(huán)非直接光照條件生活，通風(fēng)良好，自由攝食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)［4］建立大鼠慢性嗎啡依賴及納洛酮急性催促戒斷模型：以遞增法連續(xù)皮下注射嗎啡（10、20、30、40、50 mg·kg－1）5 d，每天2次，間隔12 h （8：00、20：00），記錄每日大鼠體重變化。d 6，8：00皮下注射嗎啡50 mg·kg－1，2 h后腹腔注射鹽酸納洛酮（5 mg·kg－1）進(jìn)行催促戒斷，記錄戒斷后15 min大鼠跳躍次數(shù)及1 h后體重變化。然后用改良Gellert-Holtzman法［5］評(píng)價(jià)模型建立是否成功，剔除未成模動(dòng)物。具體分組如下，①鹽水對(duì)照組（Con-trol）：背部皮下注射同等劑量的生理鹽水；②嗎啡依賴組（Mor）：按照上述方案進(jìn)行嗎啡皮下注射；③戒斷組（Nal）：按照上述方案進(jìn)行嗎啡皮下注射，2 h后進(jìn)行納洛酮催促戒斷；④～⑥：慢性藥物干預(yù)組（CCK-8、L-364，718、LY-288，513）：每次給予嗎啡前30min腹腔內(nèi)分別注射CCK-8（50 μg·kg－1）、L-364，718（1 mg·kg－1）、LY-288，513（1 mg·kg－1），余同③；⑦溶劑對(duì)照組（Vehice）：每次給予嗎啡前30 min，注射同等體積的溶劑（DMSO∶1，3-丙二醇＝1∶4，1 mL·kg－1），余同③。

1.3 大鼠腦組織的急性分離 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠行斷頭術(shù)，取腦放入定位模具內(nèi)，參照大鼠腦立體定位圖譜（Paxinos and Watson，1998），冰浴下分離額葉皮質(zhì)、海馬和紋狀體，立即置液氮內(nèi)保存，后移入－70℃的冰箱內(nèi)。

1.4 Western blot法檢測(cè)CaMKⅡ蛋白的表達(dá)臨用前稱重腦組織，參照文獻(xiàn)提取組織蛋白加入預(yù)冷的含PMSF的總蛋白提取液（20 mmol·L－1Tris-HCL pH 7.4，0.5％NP-40，0.5％脫氧膽酸鈉，50 mmol·L－1NaF，5 mmol·L－1EDTA，1 mmol·L－1PMSF，5 mg·L－1亮肽酶，5 mg·L－1抑肽酶，1 mmol ·L－1DTT，1 mmol·L－1Na3VO4），冰浴上勻漿，勻漿液置于1.5 mL EP管中，冰上裂解1 h，每隔10 min在漩渦震蕩器上混勻一次，4℃14 000×g離心10 min，取上清，用考馬斯亮蘭法定量蛋白濃度。取各組蛋白70 μg，與等體積的上樣緩沖液混合后，煮沸5 min，使蛋白充分變性，將樣品在4％及10％的SDS-聚丙烯凝膠中進(jìn)行電泳2 h后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上。用含5％人脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h后，加入相應(yīng)一抗，4℃過(guò)夜。TBST充分漂洗3次后加入HPR標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫作用2 h，TBST充分漂洗3次，ECL法顯色1～3 min，暗盒曝光1 min，顯影，定影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 顯影后將條帶掃描至計(jì)算機(jī)中，用Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描，以各組目的蛋白條帶光密度值對(duì)內(nèi)參蛋白光密度值計(jì)算相對(duì)比值，以Control組該比值為100％，其余各組與之相比，再次計(jì)算比值為統(tǒng)計(jì)值（±s），各組均數(shù)的比較行單因素方差分析（ANOVA），用最小顯著差法（LSD）作兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 嗎啡催促戒斷模型的成功建立 嗎啡依賴大鼠在給予納洛酮催促戒斷后，出現(xiàn)了體重下降、跳躍、濕狗樣抖動(dòng)、腹瀉、流淚、齒顫、流涎等戒斷癥狀。CCK-8、L-364，718及LY-288，513明顯抑制了催促戒斷大鼠的體重下降及Gellert-Holtzman評(píng)分（Tab 1）。

2.2 CCK-8及其受體拮抗劑對(duì)額葉皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)的影響 慢性嗎啡處理后，大鼠額葉皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較明顯升高（P＜0.01）；納洛酮催促戒斷后，額葉皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)與嗎啡依賴組比較明顯降低（P＜0.01）；CCK-8及其受體拮抗劑預(yù)處理后使嗎啡戒斷大鼠額葉皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)與戒斷組相比明顯升高（P＜0.01）；溶劑對(duì)照組額葉皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)與戒斷組相比差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)Fig 1。

Tab 1 Effects of CCK-8 and its receptor antagonist on body weight loss and Gellert-Holtzman scores of morphine withdrawal rats（±s，n＝6）

Tab 1 Effects of CCK-8 and its receptor antagonist on body weight loss and Gellert-Holtzman scores of morphine withdrawal rats（±s，n＝6）

▲▲P＜0.01 vs Mor group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs Nal group

Croup Weight loss/g Gellert-Holtzman score Control 0.97±0.26 3.33±1.53 Morphine 2.14±1.03 5.32±2.08 Naloxne 11.49±3.89▲▲ 46.29±4.04▲▲CCK-8 6.21±1.82* 26.00±2.65**L-364，718 6.50±3.70* 26.30±4.04**LY-288，513 7.86±3.34** 18.60±2.52**Vehicle 10.12±3.11 42.67±1.53

Fig 1 Effects of CCK-8 and its receptor antagonist on expression of CaMKⅡin prefrontal cortex（PFC）of morphine withdrawal rats by Western blot

2.3 CCK-8及其受體拮抗劑對(duì)海馬細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)的影響 慢性嗎啡處理后，大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較明顯升高（P ＜0.01）；納洛酮催促戒斷后，海馬細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)與嗎啡依賴組比較明顯降低（P＜0.01）；CCK-8及其受體拮抗劑預(yù)處理使嗎啡戒斷大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白較戒斷組明顯升高（P＜0.01），溶劑對(duì)照組海馬細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)與戒斷組相比差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Effects of CCK-8 and its receptor antagonist on expression of CaMKⅡin hippocampus（Hip）of morphine withdrawal rats by Western blot

Tab 2 Effect of CCK-8 and its receptor antagonist on expression of CaMKⅡin prefrontal cortex（PFC），hippocampus（Hip）and cauduate putamen（CPu）of morphine withdrawal rats（±s，n＝6）

Tab 2 Effect of CCK-8 and its receptor antagonist on expression of CaMKⅡin prefrontal cortex（PFC），hippocampus（Hip）and cauduate putamen（CPu）of morphine withdrawal rats（±s，n＝6）

△△P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs Mor group；**P＜0.01 vs Nal group.

Group Prefrontal cortex Hippocampus Cauduat e putamen Control 1±0 1±0 1±0 Morphine 1.475±0.109△△1.943±0.071△△1.303±0.167△△Naloxne 1.005±0.011＃＃1.276±0.147＃＃1.008±0.176＃＃CCK-8 1.306±0.069**2.029±0.182**1.358±0.012**L-364，718 1.297±0.021**2.278±0.136**1.368±0.098**LY-288，513 1.194±0.171**2.345±0.057**1.223±0.146**Vehicle 0.874±0.082 1.329±0.158 1.058±0.050

2.4 CCK-8及其受體拮抗劑對(duì)紋狀體細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)的影響 慢性嗎啡處理后，大鼠紋狀體細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較明顯升高（P＜0.01）；納洛酮催促戒斷后，紋狀體細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)與嗎啡依賴組比較明顯降低（P＜0.01）；CCK-8及其受體拮抗劑預(yù)處理使嗎啡戒斷大鼠紋狀體細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白較戒斷組明顯升高（P＜0.01），溶劑對(duì)照組紋狀體內(nèi)細(xì)胞CaMKⅡ蛋白表達(dá)與戒斷組相比差異無(wú)顯著性（P＞ 0.05）。見(jiàn)Tab 2、Fig 3。

Fig 3 Effects of CCK-8 and its receptor antagonist on expression of CaMKⅡin cauduate putamen（Cpu）of morphine withdrawal rats by Western blot

3 討論

CaMKⅡ廣泛分布于全身，腦內(nèi)含量尤為豐富，作為一種多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在神經(jīng)遞質(zhì)的合成、受體的調(diào)節(jié)、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)及基因表達(dá)等多方面均起到重要作用［6］。慢性嗎啡處理的小鼠脊背神經(jīng)元CaMKⅡ的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)［7］。郭慶民等［8］研究發(fā)現(xiàn)，DPDPE長(zhǎng)時(shí)程作用NG108-15細(xì)胞后胞質(zhì)CaMKⅡ活性明顯升高，其作用可被CaMKⅡ特異性抑制劑KN-62所拮抗。向海馬微注射CaMKⅡ抑制劑能夠抑制嗎啡耐受和鎮(zhèn)痛及納洛酮所引起的促戒斷癥狀［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡依賴大鼠額葉皮質(zhì)、海馬和紋狀體細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，而納洛酮促戒斷則使CaMKⅡ蛋白表達(dá)明顯下降，提示CaMKⅡ參與了阿片類藥物的成癮。其機(jī)制可能是阿片類物質(zhì)通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋通道的數(shù)目及增強(qiáng)突觸的Ca2＋攝取能力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2＋的增多，增多的Ca2＋與CaM相結(jié)合，藉此激活CaMKⅡ。溶劑組大鼠皮質(zhì)、海馬及紋狀體細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)同戒斷組相比無(wú)明顯變化，這表明溶劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白的表達(dá)無(wú)影響，進(jìn)一步說(shuō)明拮抗劑組細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)的變化與溶劑無(wú)關(guān)。

阿片類成癮是一種慢性、復(fù)發(fā)性腦病，涉及復(fù)雜的神經(jīng)機(jī)制。目前常用的治療方法為替代治療和對(duì)癥治療。所謂的替代治療是以另一種阿片類似物進(jìn)行替代來(lái)緩解成癮者的戒斷癥狀，但隨著替代藥物的應(yīng)用，會(huì)引起成癮的再次發(fā)生，因此并非真正意義上的治療；而對(duì)癥治療是應(yīng)用非阿片類物質(zhì)來(lái)進(jìn)行治療，避免了二次成癮的可能，為目前較為理想的治療方法。CCK-8作為迄今體內(nèi)最強(qiáng)的“抗阿片肽”［10］，在疼痛的調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶的形成、負(fù)面情緒的管理等多方面起著重要的作用［11］。內(nèi)源性CCK-8的釋放參與了阿片類成癮的形成，應(yīng)用CCK-8受體拮抗劑能減輕嗎啡戒斷癥狀［10］，對(duì)藥物依賴的治療具有重要價(jià)值［12］。本室前期研究也證實(shí)，CCK-8受體拮抗劑可減輕納洛酮引起的急性催促戒斷癥狀［13］。外源性CCK-8作為一種強(qiáng)效CCK受體激動(dòng)劑，其相關(guān)研究并未得到與CCK受體拮抗劑完全相反的結(jié)論。外源性給予CCK-8同樣可減輕戒斷癥狀［14］，抑制嗎啡精神依賴及復(fù)吸過(guò)程［15］，其機(jī)制可能與外源性CCK-8的劑量濃度、應(yīng)用方式及應(yīng)用時(shí)間有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)中我們也觀察到CCK-8、L-364，718、LY-288，513干預(yù)后翻轉(zhuǎn)了納洛酮戒斷引起的額葉皮質(zhì)、海馬及紋狀體細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)的下降，且與前期研究中CaM變化趨勢(shì)一致。由此可見(jiàn)，相關(guān)腦區(qū)細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)與嗎啡成癮、戒斷密切相關(guān)，而CCK-8及其受體拮抗劑可通過(guò)影響CaMKⅡ蛋白的表達(dá)及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路拮抗納洛酮引起的急性戒斷癥狀的發(fā)生，為將來(lái)戒毒治療提供新的策略。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)在河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)系所屬實(shí)驗(yàn)室完成。參與人員：張雅靜、文迪、楊勝昌、于峰、馬春玲、叢斌。在此對(duì)所有給予本實(shí)驗(yàn)支持和幫助的老師及同學(xué)表示衷心感謝。）

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Effects of CCK-8 and its receptor antagonists on CaMKⅡexpression of morphine withdrawal rats

ZHANG Ya-jing1，2，WEN Di1，YANG Sheng-chang1，Ma Chun-ling1，CONG Bin1
（1.Dept of Forensic Medicine，Hebei Medical University，Hebei Key Lab of Forensic Medicine，Shijiazhuang 050017，China；2.Dept of Medical Oncology，the First Hospital of Shijiazhuang，Shijiazhuang 050011，China）

Aim To observe the effects of CCK-8 and its receptor antagonists（L-364，718；LY288，513）on CaMKⅡexpression in prefrontal cortex（PFC），hippo-campus（Hip）and cauduate putamen（CPu）of mor-phine withdrawal rats.Methods A physical morphine-dependent model in rats was established by subcutane-ous injection of morphine in gradually increasing doses for 5 consecutive days.The expression of CaMKⅡin prefrontal cortex，hippocampus and striatum of rats was assayed by Western blot.Results ①CCK-8 and its receptor antagonists could relieve the morphine with-drawal symptoms of the rats.②Compared with control group morphine dependence increased CaMKⅡexpres- sion in prefrontal cortex，hippocampus and striatum.Following naloxone precipitation，CaMKⅡexpression significantly decreased.③CCK-8 and its receptor an-tagonists pre-treatment significantly increased CaMKⅡexpression in prefrontal cortex（PFC），hippocampus and striatum of morphine withdrawal rats.Conclusion The inhibitory effect of CCK-8 and its receptor an-tagonists on withdrawal syndrome of morphine-depend-ent rats may be related to the increase of CaMKⅡex-pression in specific brain regions.

cholecystokinin；L-364，718；LY 288，513；morphine dependence；morphine withdrawal；CaMKⅡ

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.014.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.007

A

1001－1978（2016）03－0327－05

R-332；R322.81；R341；R345.57；R347.923；R392.11；R749.61；R971.2

2015－11－24，修回時(shí)間：2015－12－26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81273337，30672355）；河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)研究項(xiàng)目（No 10966911D）

張雅靜（1982－），女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：物質(zhì)成癮，E-mail：zyjjkw＠126.com；馬春玲（1964－），女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：法醫(yī)毒理學(xué)，通訊作者，E-mail：chunlingma＠126.com；叢 斌（1957－），男，博士，中國(guó)工程院院士，博士生導(dǎo)師，研究方向：法醫(yī)物證學(xué)、法醫(yī)毒理學(xué)，通訊作者，E-mail：hbyd-congbin＠126.com