水稻開花時間基因OsDTH 10的過表達(dá)分析

李瑩瑩 熊煒 宋婷 曹振華 欒維江＊

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；＊通訊聯(lián)系人，E－mail：lwjzsq＠163.com）

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水稻開花時間基因OsDTH 10的過表達(dá)分析

李瑩瑩 熊煒 宋婷 曹振華 欒維江＊

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；＊通訊聯(lián)系人，E－mail：lwjzsq＠163.com）

李瑩瑩，熊煒，宋婷，等.水稻開花時間基因OsDTH10的過表達(dá)分析.中國水稻科學(xué)，2016，30（2）：121－126.

摘 要：開花時間（抽穗期）是農(nóng)作物一個重要的農(nóng)藝性狀，與農(nóng)作物的產(chǎn)量息息相關(guān)。調(diào)節(jié)農(nóng)作物的開花抽穗時間是提高農(nóng)作物產(chǎn)量的一條重要途徑。為了揭示水稻開花時間基因OsDTH10在水稻抽穗期調(diào)控中的功能，利用反向遺傳學(xué)方法構(gòu)建了水稻OsDTH10基因過量表達(dá)載體，獲得轉(zhuǎn)基因植株，分析目的基因在過量表達(dá)條件下的功能。結(jié)果表明，過量表達(dá)OsDTH10導(dǎo)致水稻的抽穗期推遲；RT－PCR檢測結(jié)果表明OsDTH10的表達(dá)量在晚抽穗的轉(zhuǎn)基因株系中明顯提高，但在沒有表型的轉(zhuǎn)基因株系及野生型中表達(dá)量較低，說明晚抽穗的表型是由于OsDTH10過量表達(dá)所致。組織特異性表達(dá)結(jié)果表明OsDTH10在植物的不同器官中都有表達(dá)，但在水稻的莖、葉鞘中表達(dá)量較高。分析OsDTH10在不同葉齡葉片中的表達(dá)，結(jié)果表明OsDTH10在未完全展開的劍葉葉片及倒2葉中的表達(dá)量較高，但在下部較老的倒3葉及倒4葉中的表達(dá)量下降。另外，分析OsDTH10在不同光周期條件下的晝夜節(jié)律性表達(dá)，結(jié)果表明無論在短日照還是長日照條件下，OsDTH10都在白天（光期）有表達(dá)高峰，在夜晚（暗期）表達(dá)降低，表明OsDTH10可能涉及光周期調(diào)控通路調(diào)節(jié)水稻的抽穗期。

關(guān)鍵詞：水稻；OsDTH10；過量表達(dá)；表達(dá)分析

植物開花轉(zhuǎn)變受其內(nèi)部基因及外界環(huán)境因素共同影響。光周期（日照長短）是植物開花轉(zhuǎn)變和開花時間的主要環(huán)境決定因素。植物通過內(nèi)部基因網(wǎng)絡(luò)識別和測量日照長短，并對光周期作出反應(yīng)來調(diào)控植物開花的時間［1－3］。根據(jù)光周期對植物開花的影響將其劃分為短日照植物、長日照植物和日中性植物［4］。水稻是典型的短日照植物，短日照條件下水稻的抽穗期提早，而長日照條件下水稻的抽穗期延遲?，F(xiàn)已明確短日照條件下水稻抽穗提早主要通過兩條途徑實現(xiàn)：一條是與模式植物擬南芥CO－FT途徑保守的Hd1－Hd3a途徑；另一條是水稻所特有的Ehd1－Hd3a途徑［5－7］。在這兩條途徑中，有幾個調(diào)控基因起重要作用。Hd1編碼一個鋅指蛋白，通過調(diào)控其下游的Hd3a基因，在短日條件下促進(jìn)水稻的開花，但在長日條件下Hd1通過抑制Hd3a的表達(dá)延遲水稻的開花［8－9］。Hd3a是水稻抽穗開花的激活子，它可以促進(jìn)水稻成花，是水稻的成花素［10］，Hd3a在短日照條件下有較高的水平，但在長日照條件下表達(dá)水平很低。RFT1是Hd3a的同源基因，也是水稻開花的激活子。在短日照條件下與Hd3a功能冗余，但在長日照條件下可以促進(jìn)水稻開花，是水稻在長日照條件下的成花素［11］。Ehd1編碼一個B型的應(yīng)答效應(yīng)因子，在短日照條件下通過誘導(dǎo)FT－like基因（如Hd3a、RFT1等）的表達(dá)而促進(jìn)水稻開花［12］。而在長日照條件下水稻開花延遲主要通過兩條途徑實現(xiàn)：一條途徑是通過Hd1的抑制作用，負(fù)向調(diào)控Hd3a的表達(dá)從而推遲水稻的抽穗開花時間；另一條途徑是通過開花的抑制子Ghd7在長日照條件下抑制Ehd1的表達(dá)，進(jìn)而抑制Hd3a和RFT1的表達(dá)，從而推遲水稻的抽穗［13］。這兩條途徑最終都通過成花素基因Hd3a和RFT1的表達(dá)調(diào)控調(diào)節(jié)水稻抽穗開花。成花素基因編碼一個磷酯酰乙醇胺結(jié)合蛋白（Phosphatidylethanolaminebinding protein，PEBP）家族［14］，擬南芥中已發(fā)現(xiàn)該家族成員在功能上已有了分化，除了促進(jìn)擬南芥成花的FT基因外，還發(fā)現(xiàn)一個與FT基因同源但功能卻完全相反的TFL1家族成員，它能夠抑制擬南芥開花［15］。水稻中該家族有13個成員［16］，Hd3a和RFT1是兩個功能明確的成員，但其他成員功能仍然未知。為了進(jìn)一步研究水稻中成花素家族成員的功能，我們對其他未知的家族成員進(jìn)行反向遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中一個家族成員OsDTH10（Os06g35940）與Hd3a和RFT1在水稻抽穗開花上具有相反的功能，過量表達(dá)Os－DTH10延遲了水稻抽穗。另外還揭示了Os－DTH10的表達(dá)規(guī)律，表明OsDTH10可能涉及光周期調(diào)控通路調(diào)控水稻的抽穗期。

1 材料與方法

1.1 材料

粳稻品種中花11（Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Zhonghua 11）及其轉(zhuǎn)基因植株用于本實驗，材料種植于天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田。田間常規(guī)管理。

1.2 OsDTH10過表達(dá)載體的構(gòu)建

OsDTH10目的基因用RT－PCR方法獲得，總RNA從40d的水稻葉片中提取，用M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以它為模板，用基因特異性引物OsDTH10F（5′－ATTggtaccGCTTAGCTTCA GCTCACACC－3′，小寫字母為酶切位點）和OsDTH10R（5′－ATTgtcgacGCTGGCTAGACACA CACTGCAT－3′，小寫字母為酶切位點）進(jìn)行PCR擴增，獲得目的基因完整的ORF（開放閱讀框）。PCR運行程序如下：95℃下1 min；95℃下30s，60℃下30s，72℃下30s，35次循環(huán)；之后72℃下延伸5min。凝膠檢測后回收純化目的片段，將獲得的目的片段用相應(yīng)酶切位點連入空載體pCAMBIA2300中，獲得過表達(dá)融合載體。對融合載體進(jìn)行測序驗證，正確無誤后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)基因植株，并用空載體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株作對照，具體程序參照文獻(xiàn)［17］。

1.3 DNA的提取及轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

用CTAB法［18］從水稻葉片中提取基因組DNA。然后用載體中的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗性基因（NPTⅡ）對獲得的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測。所用引物為NPTⅡF（5′－TTCTCACTGAA GCGGGAAGGG－3′）和NPTⅡR（5′－GCGATACC GTAAAGCACCAGG－3′）。反應(yīng)條件如下：94℃下4min；94℃下30s，57℃下30s，72℃下30s，30次循環(huán)；之后72℃下延伸5min。

1.4 目的基因的表達(dá)分析

在過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)分析中，總RNA 從60d水稻植株的葉片中提?。辉谒窘M織特異性表達(dá)分析中，總RNA分別從水稻根、莖、不同部位的葉片、莖頂端分生組織、不同時期的幼穗中提取。提取的總RNA用DNaseⅠ進(jìn)行處理，消化基因DNA后用M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行RT－PCR。引物序列為OsDTH10F（5′－CTGT GATGTATGATGGGAGG－3′）和OsDTH10R（5′－AAGGTTGGGTTGCTGGGATT－3′）。運行程序如下：94℃下4min；94℃下30s，58℃下30s，72℃下30s，32次循環(huán)；之后72℃下延伸5min。并以水稻OsActin1為內(nèi)參進(jìn)行相對定量分析。引物為OsActin1F（5′－GACTCTGGTGATGGTGTCAGC－3′）和OsActin1R（5′－GGCTGGAAGAGGACCTC AGG－3′）。反應(yīng)條件為94℃下4min；94℃下30s，60℃下30s，72℃下30s，24次循環(huán)；之后72℃下延伸5min。

1.5 光周期材料的處理及表達(dá)分析

田間生長40d、健壯一致的野生型中花11移入大型人工氣候箱中，分別用兩個光周期條件進(jìn)行處理，即長日照（LD，15h光照／9h黑暗）和短日照（SD，11h光照／13h黑暗）。溫度為28℃。處理25 d后，按24h節(jié)律性，每隔3h取樣提取總RNA，并用DNaseⅠ進(jìn)行處理，消化基因DNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用qRT－PCR分析目的基因在不同光周期條件下的表達(dá)模式。qRT－PCR按照SYBR Green PCR master mix（Vazyme，南京）試劑盒說明操作，在7500Fast實時PCR System（ABi－7500，美國）熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴增反應(yīng)，并用2－△△Ct方法進(jìn)行相對定量分析，每個反應(yīng)重復(fù)3次。所用引物同1.4所述。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsDTH10過表達(dá)載體的構(gòu)建

用RT－PCR方法從水稻葉片中獲得OsDTH10的全長ORF，目的片段符合預(yù)期設(shè)計（圖1－B）。純化回收后用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ對目的片段和空質(zhì)粒pCAMBIA2300進(jìn)行酶切，純化回收后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，獲得重組載體。對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測，發(fā)現(xiàn)切出了預(yù)期的目的片段（圖1－C），表明目的片段已成功連入空載體中，獲得最終的過表達(dá)載體（圖1－A）。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序驗證后，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灐?/p>

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的表型分析

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，將重組載體pCAMBIA2300－Os DTH10導(dǎo)入野生型中花11中，最終獲得了11個獨立株系的98株T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株。我們選取了5個株系種植到大田里，獲得T1代轉(zhuǎn)基因株系。并檢測了轉(zhuǎn)基因植株中目的基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中3個株系目的基因表達(dá)水平明顯提高（3～5號株系；圖2－B），其他兩個株系與野生型相比沒有明顯差異（1號和2號株系；圖2－B），表明所構(gòu)建的過表達(dá)載體正常工作。表型觀察發(fā)現(xiàn)這3個表達(dá)量明顯提高株系（3～5號株系）的抽穗期比野生型對照分別推遲了4、7和16d（圖2－A，C），而1號和2號株系的抽穗期與野生型沒有明顯差異，說明轉(zhuǎn)基因植株延遲抽穗是由OsDTH10基因過量表達(dá)所致（圖2－C）。

A－過表達(dá)載體結(jié)構(gòu)；LB為T－DNA左邊界；NPTⅡ－新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗性篩選標(biāo)記；p2×35S－2個串連的花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子；RB為T－DNA右邊界。B－OsDTH10全長開放閱讀框的PCR擴增。C－過表達(dá)載體的酶切鑒定。1～3為3個不同單克??；M－DNA標(biāo)記。A，Constructure of overexpression vetor；LB，Left border of TDNA；NPTⅡ，Neomycin phosphotransferaseⅡ；p2×35S，Double cauliflower mosaic virus（CaMV）35Spromoter；RB，Right border of T－DNA；B，PCR amplification of OsDTH10 full open reading frame；C，Digesting identification of recombinant plasmid；1 －3，Three independent clones of recombinant plasmid；M，DNA marker.圖1 過表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1.Construction of overexpression vetor.

2.3 OsDTH10基因的組織特異性表達(dá)分析

為了確定OsDTH10在不同組織器官中的表達(dá)，分別提取了野生型水稻中花11的莖頂端分生組織、根、葉片、葉鞘、莖和不同時期幼穗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過RT－PCR檢測目的基因在水稻不同器官中的表達(dá)差異。結(jié)果顯示OsDTH10在水稻各個組織器官中均有表達(dá)，但表達(dá)量有差異。比較而言，在莖和葉鞘中的表達(dá)量最高（圖3－A），在莖頂端分生組織、14cm長幼穗及葉片中次之。我們進(jìn)一步分析了OsDTH10在同一株水稻上不同葉齡葉片中的表達(dá)。結(jié)果顯示，OsDTH10在最上部還未完全展開葉片和倒2葉中的表達(dá)量較高，但在較老的倒3葉和倒4葉中表達(dá)量比較低（圖3－B）。

2.4 OsDTH10基因在不同光周期條件下晝夜節(jié)律性表達(dá)

A－過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的表型；WT為空載體轉(zhuǎn)基因植株對照，OsDTH10－OV為過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；B－轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)分析；1～5分別為5個獨立的轉(zhuǎn)基因株系；C－轉(zhuǎn)基因株系的抽穗期（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n≥15）。A，Phenotype of transgenic plants；WT，Transgenic plants with empty vector；OsDTH10－OV，OsDTH10－Overexpressing transgenic plants.B，qRT－PCR and RT－PCR analysis of OsDTH10 expression level in different OsDTH10－OVlines；1to 5are five independent OsDTH10－OV lines；C，Heading date of OsDTH10－OVline（mean±SD，n≥15）.圖2 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的表型及表達(dá)分析Fig.2.Phenotype and expression analysis of OsDTH10－overexpressing transgenic lines（OsDTH10－OV）.

A－OsDTH10組織特異性表達(dá)；M－莖頂端分生組織；R－根；L－葉片；LS－葉鞘；S－莖；P1－14cm長幼穗；P2－4cm長幼穗；P3－25 cm長幼穗。B－OsDTH10在不同葉齡葉片中的表達(dá)。L1－未完全展開的劍葉葉片，L2－倒2葉，L3－倒3葉，L4－倒4葉。A，Tissue－specific expression of OsDTH10；M，Shoot apical meristem；R，Root；L，Leaf；LS，Leaf sheath；S，Stem；P1，14cm panicle；P2，4cm panicle；P3，25cm panicle.B，Expression of OsDTH10in leaves at various leaf－ages.L1，The unexpanded flag leaf；L2，The second leaf from the top；L3，The third leaf from the top；L4，The fourth leaf from the top.圖3 OsDTH10的組織特異性表達(dá)分析Fig.3.Tissue－specific expression of OsDTH10.

A－短日照條件下OsDTH10的表達(dá)水平；B－長日照條件下OsDTH10的表達(dá)水平。A，Expression level of OsDTH10in short－day conditions；B，Expression level of OsDTH10in long－day conditions.圖4 OsDTH10基因在不同光周期條件下的晝夜節(jié)律性表達(dá)Fig.4.Circadian rhythm expression of OsDTH10 under different photoperiods.

由于過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)延遲抽穗，我們推測OsDTH10基因可能與光周期途徑相關(guān)，為此我們進(jìn)一步分析了目的基因在不同光周期下的表達(dá)。結(jié)果表明，無論在長日照還是短日照條件下，Os－DTH10在白天（光期）的表達(dá)量較高，而在晚上（暗期）表達(dá)量較低（圖4－A，B）。短日照條件下，Os－DTH10 mRNA水平從早上6：30開始積累到下午15：30達(dá)到峰值，在凌晨降到最低（圖4－A）。長日照條件下，OsDTH10 mRNA積累表現(xiàn)為雙峰，分別在9：30和15：30達(dá)到峰值，在凌晨3：30降到最低（圖4－B）。

3 討論

植物開花是環(huán)境因素與控制植物開花的基因網(wǎng)絡(luò)相互作用的結(jié)果，目前已明確水稻的成花主要是由成花素負(fù)責(zé)［6－7］。短日照條件下起主要作用的成花素是Hd3a，在長日照條件下起主要作用的成花素是RFT1［11］。這兩個成花素都是FT－like家族基因［16］。模式植物擬南芥中FT和TFL1是FT－like家族中的兩個成員，但它們的功能完全相反［15］，F(xiàn)T促進(jìn)擬南芥開花，而TFL1則抑制擬南芥開花，維持其營養(yǎng)生長，充當(dāng)反成花素的作用［19－20］。水稻中FT－like家族共有13個成員［16］，除了已經(jīng)報道的RFT1和Hd3a分別履行水稻長日照及短日照成花素的功能外，其他成員的功能仍不清楚。本研究揭示了該家族另一成員OsDTH10在水稻中的功能，即過量表達(dá)OsDTH10推遲了水稻的抽穗開花時間。這與Hd3a及RFT1有所不同，Hd3a及RFT1是水稻開花的激活子，過量表達(dá)Hd3a及RFT1導(dǎo)致水稻提早抽穗。OsDTH10是水稻開花的抑制子，這與擬南芥TFL1基因的功能相似，是水稻中的反成花素。這一結(jié)果充分說明了水稻FT－like家族的成員在進(jìn)化中功能有了很大的分化，因此弄清該家族中每個成員的功能，揭示哪些成員在功能上是冗余的，哪些成員在功能上已有分化，對于揭示水稻成花素基因的進(jìn)化及功能具有重要的意義。

實時定量PCR結(jié)果表明，OsDTH10具有晝夜節(jié)律性表達(dá)，在白天表達(dá)量較高，而在夜晚表達(dá)量較低，這與Hd3a及RFT1表達(dá)模式一致。但Os－DTH10無論短日照還是長日照條件下都有較高的表達(dá)，這與Hd3a在短日照條件下表達(dá)量低有所不同。另外，現(xiàn)已明確成花素基因Hd3a及RFT1首先在葉片接受光的信號，然后運輸?shù)角o頂端分生組織中起作用。分子機理方面，Hd3a或RFT1首先在細(xì)胞質(zhì)中與水稻14－3－3基因（OsGF14b，OsGF14c）互作形成復(fù)合體，然后進(jìn)入細(xì)胞核中與水稻OsFD1結(jié)合形成復(fù)合體，最終調(diào)控開花身份基因OsMADS14和OsMADS15的表達(dá)水平來調(diào)控水稻抽穗的早晚［21－22］。OsDTH10是否有這樣的功能，能否和這些已知的基因相互調(diào)控還不清楚，因此，后期創(chuàng)建OsDTH10 RNAi轉(zhuǎn)基因植株，利用RNAi及過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，用不同的光周期條件處理，研究光周期調(diào)控通路中其他已知基因的表達(dá)，揭示目的基因與光周期通路中其他關(guān)鍵基因的調(diào)控關(guān)系，從而揭示OsDTH10在水稻抽穗開花時間上的功能。

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Overexpressing Analysis of the Flowering Time Gene OsDTH 10in Rice

LI Ying－ying，XIONG Wei，SONG Ting，CAOZhen－h(huán)ua，LUAN Wei－jiang＊
（College of Life Science，Tianjin Normal University／Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin 300387，China；＊Corresponding author，E－mail：lwjzsq＠163.com）

LI Yingying，XIONG Wei，SONG Ting，et al.Overexpressing analysis of the flowering time gene OsDTH10 in rice.Chin J Rice Sci，2016，30（2）：121－126.

Abstract：Flowering time（heading date）is an important agronomic trait of crops，and it is closely linked with the yield of crops.To reveal the function of rice flowering time gene OsDTH10in rice，we constructed an overexpressing vector of OsDTH10 and analyzed the function of OsDTH10 by the reverse genetics.The results showed that the OsDTH10－overexpressing（OsDTH10－OV）transgenic plants displayed a late heading phenotype，suggesting that the overexpression of OsDTH10delayed the heading－date of rice.RT－PCR expression analysis showed that the expression level of OsDTH10was increased obviously in OsDTH10－OVlines with phenotype compared with the transgenic lines without phenotype and wild type plants，indicating that late heading phenotype in OsDTH10－OVlines was caused by the overexpression of OsDTH10.The tissue－specific expression showed that OsDTH10 was expressed in different organs，with the higher expression levels in stem and leaf sheath.Also，we further analyzed the expression of OsDTH10 in leaves at various leaf－ages，and the result showed that OsDTH10 exhibited higher expression in unexpanded flag leaf and the second leaf from the top than these in the third and the fourth leaf from the top.In addition，we also analyzed the expression of OsDTH10 in different photoperiods，and the result indicated that OsDTH10displayed a higher expression during the day time（light stage）and a lower expression at night（dark stage）whatever short－day and long－day conditions，suggesting that OsDTH10 might be involved in the photoperiodic pathways to regulate the heading－date in rice.

Key words：rice；OsDTH10；overexpression；expression analysis

中圖分類號：Q786；S511.01

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001－7216（2016）02－0121－06

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（31171515）；天津市高校中青年骨干創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃資助項目（ZX110GG017）。

收稿日期：2015－09－21；修改稿收到日期：2015－12－17。