一株產(chǎn)靈菌紅素菌的篩選及其等離子體誘變

張德偉，薛正蓮，王 洲，蘇燕南，何陽登，張國鋒（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000）

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一株產(chǎn)靈菌紅素菌的篩選及其等離子體誘變

張德偉，薛正蓮＊，王 洲，蘇燕南，何陽登，張國鋒
（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000）

摘要：為獲得能高效合成靈菌紅素的菌株，首先對土壤中的微生物進(jìn)行分離，篩選得到一株優(yōu)勢菌株．分別采用形態(tài)學(xué)、生理生化實驗以及16SrDNA測序分析，鑒定該菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌屬，命名為Serratiamarcescens ZX－01．對該菌株分別采用常壓室溫等離子體（Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP）誘變，并進(jìn)行平板初篩和搖瓶復(fù)篩．經(jīng)多輪誘變后，得到一株靈菌紅素優(yōu)勢菌株ZX－3－10，其產(chǎn)量可達(dá)128．7mg／L，比誘變前提高123%．五代產(chǎn)量穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，該菌株具有良好的產(chǎn)量傳代穩(wěn)定性．

關(guān) 鍵 詞：粘質(zhì)沙雷氏菌；靈菌紅素；篩選鑒定

靈菌紅素（prodigiosins，PG）是一類具有多吡咯環(huán)的天然紅色素的總稱，由放線菌、細(xì)菌等微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物．1929年首次由Amak等在研究Serratia生長時發(fā)現(xiàn)，Harashima K等于1960年首次分離得到此類物質(zhì)．已有的研究表明，靈菌紅素具有廣泛的抗生效果以及抗腫瘤活性，具有重要的研究意義［1－3］．已報道［4］的可產(chǎn)靈菌紅素類色素的微生物主要包括沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬、交替單胞菌屬、皺紋單胞菌屬以及革蘭氏陽性的放線菌．目前，靈菌紅素的研究和生產(chǎn)主要以Serratia菌屬為主，其中最為常見的是以粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素．

韋鳳［5］等從淡水魚體中分離得到一株高產(chǎn)紅色色素的Sm－128菌株，鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌．李子武［6］等利用貧營養(yǎng)條件，從土壤中篩選獲得一株產(chǎn)紅色素菌株，經(jīng)形態(tài)生理及分子鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌，并對其所產(chǎn)紅色素進(jìn)行光譜分析確定為靈菌紅素．陳月琴［7］等從大亞灣表面海水中分離得到一株海洋產(chǎn)靈菌紅素細(xì)菌，對其進(jìn)行分子鑒定為假單胞菌屬．夏順翔［8］等用紫外誘變原生質(zhì)體，得到一株高產(chǎn)株靈菌紅素，產(chǎn)量達(dá)到了0．813g／L．吳歡歡［9］等通過對篩選的高產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌jx－1菌株的發(fā)酵工藝優(yōu)化，以補(bǔ)料方式和表面活性劑提高色素產(chǎn)量，最終使得紅色素產(chǎn)量提高到5．8g／L．

清華大學(xué)研發(fā)的新型常壓室溫等離子體（ARTP）生物誘變育種技術(shù)，具有射流溫度低（25～35℃）、活性粒子分布均勻、設(shè)備簡單及操作簡易等優(yōu)勢［10］．ARTP誘變育種技術(shù)可以快速有效地突變細(xì)菌、微藻、真菌、酵母等微生物［11－13］，已然成為生物誘變育種領(lǐng)域的一個研究熱點．目前，尚未有關(guān)于使用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變篩選靈菌紅素高產(chǎn)菌株的突變菌方法報道．

本研究從土壤中篩選出一株產(chǎn)靈菌紅素的菌株ZX－01，鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）．運用ARTP誘變技術(shù)對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，篩選得到一株高產(chǎn)靈菌紅素的突變株ZX－3－10，為靈菌紅素的開發(fā)及應(yīng)用提供了獲得優(yōu)良菌株的方法．

1 材料與方法

1．1 材料

（1）樣品．從安徽蕪湖山林、池邊和居民生活區(qū)隨機(jī)取土樣20份．

（2）主要試劑．酵母膏、胰蛋白胨、甘氨酸、甘油、乙醇、鹽酸、瓊脂、NaCl等．

（3）培養(yǎng)基．分離培養(yǎng)基：K2HPO40．1g／L，酪氨酸0．5g／L，（NH4）2SO41g／L，MgSO4·7H2O 0．02g／L，瓊脂2g／L，pH 7．0～7．2；LB培養(yǎng)基：酵母膏5g／L，胰蛋白胨10g／L，NaCl 5g／L，pH 7．0～7．2；初篩培養(yǎng)基：酵母膏5g／L，胰蛋白胨10g／L，NaCl 5g／L，葡萄糖5～13g／L，瓊脂2g／L，pH 7．0～7．2；發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油20mL／L，胰蛋白胨13g／L，NaCl 5g／L，MgSO41．2g／L，甘氨酸2g／L，pH 6．5．

1．2 方法

（1）分離篩選．制備土樣懸液，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，用10倍稀釋法將培養(yǎng)物稀釋到10－5；取10－4、10－5兩個稀釋度的樣品，分別涂布在分離培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)，觀察菌落顏色和形態(tài)．挑取紅色菌落進(jìn)行劃線，分離出單菌落．

（2）生理生化鑒定．

①形態(tài)觀察：將純化得到的菌株在LB培養(yǎng)基中活化，然后轉(zhuǎn)接到LB固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)48h，觀察菌體生長狀況及形態(tài)．

②生理生化實驗：取28℃培養(yǎng)48h的菌株進(jìn)行生理生化實驗，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》．

（3）分子生物學(xué)鑒定．

①16SrDNA測序：提取菌體的全基因組DNA，經(jīng)電泳驗證后作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其引物如下：27F（5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’）及1492R（5’－ACGGTTACCTTGT TACGACTT－3’）．反應(yīng)體系為：重蒸水37．75μL，dNTP 4μL，10×Buffer 5μL，上游引物2μL，下游引物2μL，DNA模板1μL，exTaq酶0．25μL；反應(yīng)總體系50μL．反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性10s，98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s，總共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min．產(chǎn)物經(jīng)電泳驗證后，用生工生物工程（上海）股份有限公司SanPrep DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測后，送公司進(jìn)行測序．

②系統(tǒng)發(fā)育分析：將所得16SrDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST比對，確定與實驗菌株親緣關(guān)系相近的種屬，并從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種屬模式菌株的16SrDNA基因序列，使用Clustal X軟件和MEGA軟件進(jìn)行分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹．

（4）菌株ARTP誘變．

①誘變處理［14］：取已培養(yǎng)8h的菌液鏡檢，離心，用生理鹽水重懸至菌濃度為108CFU／mL．取10μL菌懸液滴于等離子體誘變小鐵片上，置入誘變儀中，分別處理0、30s、60s、90s、120s、150s、180s．誘變后將樣品小鐵片取出，放入裝有990μL生理鹽水的2mL的離心管中培養(yǎng)2h．分別取10－4、10－5和10－63個稀釋度的菌液0．1mL涂布于篩選平板上，每個稀釋度設(shè)3個平行，以ARTP處理0為對照組，28℃培養(yǎng)36h后，記錄每皿菌落數(shù)，計算出誘變致死率，以等離子處理時間為橫坐標(biāo)，致死率和正突變率分別為縱坐標(biāo)，繪制致死率和正突變率曲線．其中：

注：正突變菌落為在初篩平板上呈紅色的菌落．

②平板初篩：取0．1mL稀釋后的菌懸液，涂布在初篩平板上，28℃培養(yǎng)，挑取生長快、顏色較深的單菌落．每一輪誘變后，根據(jù)梯度平板實驗提高葡萄糖添加量．

③搖瓶復(fù)篩：將初篩得到的菌株分別接種與LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃發(fā)酵48h后，測定靈菌紅素產(chǎn)量，篩選靈菌紅素產(chǎn)量較高的菌株．

④遺傳穩(wěn)定性的分析：將誘變獲得高產(chǎn)菌株在平板上進(jìn)行活化，并作為第一代菌株，傳代5次，搖瓶發(fā)酵測其產(chǎn)量，考察菌株的遺傳穩(wěn)定性，每組設(shè)3個平行．

（5）靈菌紅素的測定方法．取5mL發(fā)酵液，10 000r／min離心10min，棄去上清液，加入5mL酸性乙醇（pH 3．0），28℃、180r／min搖床振蕩提取60min后，10 000r／min離心10min，收集上清液，紫外－可見分光光度計535nm處測定吸光度．

2 結(jié)果與分析

2．1 粘質(zhì)沙雷氏菌的鑒定

（1）形態(tài)特征．以產(chǎn)紅色素菌株為目的菌株進(jìn)行篩選，經(jīng)劃線分離、純化后得到一株產(chǎn)紅色素穩(wěn)定的菌株，命名為ZX－01．菌株ZX－01為革蘭氏陰性桿菌，生長較快，在LB平板上菌落呈圓形、邊緣整齊、不透明，表面隆起、光滑粘稠、易挑取，且有輕微異味，篩選菌株的菌落形態(tài)及革蘭氏染色如圖1所示．

圖1　ZX－01平板菌落形態(tài)圖和革蘭氏染色圖

（2）生理生化實驗．目的菌株ZX－01的生理生化實驗結(jié)果如表1所示．

表1　菌株ZX－01生理生化特征

（3）16SrDNA的序列分析．提取篩選菌株ZX－01基因組后，利用通用引物對其16SrDNA區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段回收純化后由生工生物工程（上海）有限公司完成測序，得到ZX－01的16SrDNA序列，經(jīng)序列拼接后，上傳至GenBank，經(jīng)過同源性比對，提交序列與已知粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）同源性達(dá)99%以上．ZX－01菌株的基因組DNA電泳圖和16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖2所示．利用MEGA 4以Neighbor－Joining算法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示．由圖3可知，篩選菌株ZX－01屬于一株變形菌門，與一株γ－變形細(xì)菌同源性較高，同時，與多株粘質(zhì)沙雷氏菌具有較高同源性，結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征，最終鑒定該ZX－01菌株屬于沙雷氏菌屬的粘質(zhì)沙雷氏菌．

圖2　ZX－01菌株的基因組DNA電泳圖和16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2．2 ARTP誘變

（1）粘質(zhì)沙雷氏菌ZX－01的生長曲線．從平板上接種培養(yǎng)物于LB液體培養(yǎng)管中培養(yǎng)過夜，按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量轉(zhuǎn)接至50mL的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、180r／min搖床振蕩培養(yǎng)，每隔2h取樣測定一次菌懸液的OD600，并繪制菌株的生長曲線如圖4所示．由圖4可知，菌株在接種后2h進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)14h后進(jìn)入穩(wěn)定期．

圖3　ZX－01菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

（2）ARTP誘變處理．菌株ZX－01等離子誘變致死率及正突變率如圖5所示．由圖5可知，菌株ZX－01經(jīng)過ARTP誘變處理后，誘變致死率隨著菌株誘變時間的增長而增，90s時致死率已到達(dá)97．78%，且此時的正突變率為37．78%，明顯高于其他誘變時間的正突變率，故實驗最終確定最佳誘變時間為90s，以期獲得高產(chǎn)菌株．

圖4　ZX－01菌株的生長曲線　

圖5　菌株ZX－01等離子誘變致死率及正突變率

（3）突變株的初篩．分解代謝物的調(diào)節(jié)對許多抗生素的生物合成起著重要作用，如青霉素發(fā)酵過程中的葡萄糖效應(yīng)，靈菌紅素的生產(chǎn)同樣存在葡萄糖效應(yīng)［15］．葡萄糖濃度對靈菌紅素產(chǎn)量的影響如圖6所示．由圖6可知，隨著葡萄糖濃度的增加，靈菌紅素的產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢．葡萄糖濃度梯度平板實驗如圖7所示．由圖7可知，高葡萄糖濃度會抑制靈菌紅素的產(chǎn)生．盡管發(fā)酵過程中可應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)來克服葡萄糖效應(yīng)，但如果能選育出抗分解代謝物阻遏的突變株，則更能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要．

圖6　葡萄糖濃度對靈菌紅素產(chǎn)量的影響　

圖7　菌落在梯度平板上的菌落長勢

因此，對出發(fā)菌株ZX－01進(jìn)行ARTP誘變，誘變時間為90s，誘變后涂布于含有高濃度葡萄糖的篩選平板上進(jìn)行初步篩選，28℃倒置培養(yǎng)24h后，從初篩平板上挑取紅色且顏色較深的單菌落（見圖8），進(jìn)行搖瓶復(fù)篩．經(jīng)過多輪誘變、篩選，通過平板初篩共篩選出14株突變株．

（4）突變株的搖瓶復(fù)篩．將初篩獲得的14株突變株菌經(jīng)活化后，按10%的接種量分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵培養(yǎng)48h，測定靈菌紅素產(chǎn)量，結(jié)果如圖9所示．由圖9可知，誘變后選育出高產(chǎn)靈菌紅素的突變菌株ZX－3－10，其靈菌紅素產(chǎn)量可達(dá)128．7mg／L，比誘變前初始菌株ZX－01的產(chǎn)量提高123%．

圖8　菌株ZX－01等離子體誘變的初篩　

圖9　菌株ZX－01等離子體誘變的復(fù)篩

（5）突變株遺傳穩(wěn)定性分析．將ZX－3－10菌株在LB培養(yǎng)基平板上連續(xù)傳代5次，再分別接種至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，每組設(shè)3個平行，測定傳代菌種的產(chǎn)靈菌紅素能力，試驗結(jié)果如表2所示．由表2可知，誘變高產(chǎn)株有較高的傳代穩(wěn)定性．

表2　高產(chǎn)菌株傳代穩(wěn)定性實驗

3 結(jié)論

土壤中篩選得到一株具有產(chǎn)紅色素能力的菌株，通過對菌落外觀特征、生理生化試驗以及16SrDNA序列分析，最終鑒定該菌為黏質(zhì)沙雷氏菌，并命名為Serratiamarcescens ZX－01．采用ARTP誘變篩選靈菌紅素生產(chǎn)菌突變株的育種新技術(shù)，獲得了一株靈菌紅素產(chǎn)量明顯提高的突變菌株ZX－3－10，其靈菌紅素產(chǎn)量達(dá)到128．7mg／L，比誘變前提高了123%．通過傳代培養(yǎng)，靈菌紅素產(chǎn)量能穩(wěn)定維持在高水平，表明經(jīng)ARTP誘變獲得的這株突變菌具有較高的遺傳穩(wěn)定性．后續(xù)將對突變菌株進(jìn)行基因測序，與出發(fā)菌進(jìn)行比對分析，研究突變菌的突變機(jī)理及靈菌紅素產(chǎn)量提高的原因．

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Screening of prodigiosins－producing strain and its plasma mutation

ZHANG De－wei，XUE Zheng－lian＊，WANG Zhou，SU Yan－nan，HE Yang－deng，ZHANG Guo－feng
（College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

Abstract：A strain was selected from soil for producing the natural pigment with bioactivity．The strain was identified as Serratiamarcescens by morphologic，biochemical test and sequence analysis of 16SrDNA，and named as ZX－01．The strain was mutated by using a novel mutagenic source－atmospheric and room temperature plasma（ARTP）．The yield of prodigiosins in the mutated cells reached 128．7mg／L，which increased by 123%compared to that of the wild strain．The mutant strain ZX－3－10was relatively stable in terms ofprodigiosins production through five successive transfers of culturesand batch fermentation．

Key words：Serratiamarcescen；prodigiosin；screening and identification

通訊作者：薛正蓮（1967－），女，安徽和縣人，教授，碩導(dǎo)．

作者簡介：張德偉（1991－），男，河南商城人，碩士研究生．

基金項目：安徽工程大學(xué)青年科研基金資助項目（2013YQ48）

收稿日期：2015－11－16

文章編號：1672－2477（2016）01－0010－06

中圖分類號：Q939、Q931

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A