頭頸鱗癌靶向放射治療敏感性lncRNA的初步篩選*＊?

葉惠平，易燭光，龔正鵬

(1.貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院耳鼻咽喉科，貴州貴陽　550004; 2.貴州醫(yī)科大學附院耳鼻咽喉科，貴州貴陽　550004; 3.貴州省人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，貴州貴陽　550001)

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頭頸鱗癌靶向放射治療敏感性lncRNA的初步篩選*＊?

葉惠平1，2，易燭光3，龔正鵬1，2

(1.貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院耳鼻咽喉科，貴州貴陽550004; 2.貴州醫(yī)科大學附院耳鼻咽喉科，貴州貴陽550004; 3.貴州省人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，貴州貴陽550001)

［摘要］目的:初步探討長鏈非編碼RNA(lncRNA)在研究頭頸鱗癌(HNSCC)放療中的作用。方法:將HNSCC-SCCⅦ細胞分為對照組(不予放療)和實驗組(予放療干預)，應用芯片技術，篩選出放療干預后HNSCCSCCⅦ細胞中差異表達的lncRNA及mRNA，通過Cis和Trans法對靶基因進行預測，應用DAVID軟件進行KEGG通路篩選，得到對應的靶基因富集的KEGG通路包括腫瘤相關通路、Wnt信號通路及軸突導向通路，分析這3條通路上對應的靶基因，并找到與這些靶基因?qū)膌ncRNA。結果:篩選出1 280條放療差異表達的lncRNA，對照組相對實驗組高表達5倍以上的共15條，低表達5倍以上的共8條;篩選發(fā)現(xiàn)表達差異的mRNA有1 087條，對照組相對實驗組高表達的528條，對照組相對實驗組低表達559條; KEGG通路信息分析lncRNA對應的靶基因富集于腫瘤相關通路、Wnt信號通路和軸突導向通路; Wnt信號通路中靶基因PRKCA和STAT5B對應的lncRNA與mRNA是共表達的，對應的16203－3lncRNA在對照組的表達為實驗組的3.176倍(P＜0.05)，對應的31238－3lncRNA在實驗組中的表達量為對照組中的2.037倍(P＜0.05)。結論: PRKCA和STAT5B可能是控制HNSCC放療反應敏感性的靶基因，對應的16203－3lncRNA和31238－3lncRNA可作為調(diào)控HNSCC放療敏感性的候選lncRNA。

［關鍵詞］RNA，腫瘤;芯片;頭頸部腫瘤; KEGG通路;放療

網(wǎng)絡出版時間: 2016－02－23網(wǎng)絡出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.1839.008.html

頭頸鱗癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)是世界第6大惡性腫瘤，全球每年新增大概645 000病例［1］。放療是HNSCC的主要治療手段之一［2－3］，52%的HNSCC患者在抗腫瘤治療過程中至少接受過1次放療［4］，但臨床療效卻沒有明顯的提高，其主要原因是HNSCC具有放療抵抗性。如何提高它的放療敏感性，最大程度的殺傷腫瘤細胞，是HNSCC治療研究中的重點。非編碼RNA是近年備受關注的一類在細胞發(fā)育、分化和代謝等多個生物學過程發(fā)揮重要調(diào)控作用的分子，包括miRNA、siRNA等為代表的短小RNA和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)［5］。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA和惡性腫瘤的發(fā)生有密切的關系，惡性腫瘤往往存在異常lncRNA表達譜，失調(diào)的lncRNA可通過多種途徑調(diào)節(jié)DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構和作為miRNA的前體。lncRNA在HNSCC的異常表達與腫瘤抵抗放療關系的研究尚未見報道。本研究應用lncRNA芯片尋找HNSCC放療相關的lncRNA，為研究候選lncRNA奠定基礎。

1　材料和方法

1.1材料

HNSCC-SCCⅦ細胞株由四川大學華西醫(yī)學院生物工程國家重點實驗室惠贈，采用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期HNSCC-SCCⅦ細胞懸液接種于6孔板，每孔2×103個，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分為2組。(1)對照組，不予放療; (2)實驗組，給予6 MV X線4 Gy照射，劑量率200 cGy/min，距靶源100 cm。

1.2總RNA提取及芯片雜交

放療結束24 h后，采用TRIZOL試劑根據(jù)其標準操作流程抽提2組樣品的總RNA，所得總RNA 經(jīng)Agilent 2 100電泳質(zhì)檢合格后，純化提取mRNA。按照Agilent表達譜芯片配套提供的雜交標準流程和配套試劑盒，在滾動雜交爐中65℃、10 r/min滾動雜交17 h，雜交cRNA上樣量1.65 μg，并在洗缸中洗片，洗片所用試劑為基因表達洗滌緩沖液試劑盒。完成雜交的芯片采用Agilent微陣列掃描儀掃描，用Feature Extraction software 10.7讀取數(shù)據(jù)。

1.3數(shù)據(jù)分析及處理

采用Gene Spring Software 11.0進行歸一化處理，據(jù)倍數(shù)差異計算篩選差異lncRNA。通過基因組注釋的lncRNA及編碼基因的位置關聯(lián)鑒定lncRNA上下游10k可能的靶基因，進行Cis作用預測。根據(jù)lncRNA的序列與靶基因3’-UTR序列上的相關性，進行Trans作用預測可能的靶基因。采用DAVID軟件分別對篩選后的差異lncRNA對應的cis和trans靶基因進行KEGG數(shù)據(jù)庫做通路分析，通過P＜0.05的篩選，得到目標lncRNA。

2　結果

2.1差異lncRNA篩選

通過初步篩選及進一步數(shù)據(jù)挖掘，得到表達差異的lncRNA共1，280條，其中對照組相對實驗組高表達的lncRNA885條，對照組相對實驗組低表達的lncRNA395條。高表達5倍以上的共15條，低表達5倍以上的共8條，見表1。SEQ-ID為14201－1的lncRNA在對照組的表達量為實驗組的14.761倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，SEQID為32013－1的lncRNA在實驗組中的表達量為對照組中的12.948倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。通過倍數(shù)差異計算篩選發(fā)現(xiàn)表達差異的mRNA有1，087條(倍數(shù)變化絕對值≥2)，其中對照組相對實驗組高表達的mRNA528條，對照組相對實驗組低表達的mRNA559條。

表1　放射治療差異性表達5倍以上的lncRNATab.1　More than 5 folds differential expression of targeted lncRNA

表2　放射治療差異lncRNA與mRNA共表達靶基因Tab.2 The target gene of co-expressed lncRNA and mRNA

2.2 lncRNA靶基因預測KEGG-通路

對篩選后的差異lncRNA對應的cis和trans進行KEGG-通路分析，通過P＜0.05的篩選，得到KEGG-通路結果，數(shù)據(jù)檢索并篩選P＜0.01選擇出3條與腫瘤細胞放療相關的最密切的通路:腫瘤相關通路基因所占比例最大，其次是軸突導向通路和Wnt信號通路。

2.3靶基因?qū)膌ncRNA與mRNA共同表達

分析KEGG通路上對應的靶基因，找到對應的lncRNA及mRNA表達差異2倍以上的靶基因共篩選出2個，見表2。

3　討論

HNSCC-SCCⅦ細胞株對射線具有抵抗性，是研究HNSCC放療敏感性的重要實驗對象［6］。本實驗以HNSCC-SCCⅦ細胞作為研究對象，采用SBC小鼠lncRNA芯片，經(jīng)Agilent激光共聚焦掃描儀對雜交、洗滌、染色實驗后的芯片進行掃描得到原始信號值，進行歸一化處理取得對照組和實驗組的比較數(shù)值，篩選出放療干預后HNSCC-SCCⅦ細胞中差異表達的lncRNA及mRNA，再通過Cis和Trans法對靶基因進行預測。由于大部分靶基因功能不明，實驗借助信息學工具對其功能進行注解，預測出的靶基因列表，并通過DAVID軟件的KEGG通路分析功能，通過P＜0.05的篩選，得到KEGG通路結果。進一步對KEGG通路結果查詢及數(shù)據(jù)分析，篩選得出對應的靶基因富集的通路包括:腫瘤相關通路、Wnt信號通路及軸突導向通路。分別分析腫瘤相關通路、Wnt信號通路及軸突導向通路上對應的靶基因，并找到與這些靶基因?qū)膌ncRNA，結果顯示差異表達譜中的lncRNA富集于腫瘤相關通路，這一結果提示，放射治療后存活下來的細胞具有更強放療抵抗性。本次研究還發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路是具有富集意義的通路，Wnt信號轉(zhuǎn)導通路是經(jīng)典的放療相關通路，該通路涉及Wnts、APC、axin和TCFs等腫瘤相關蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)C0X-2通過Wnt通路促使細胞放療抵抗，Wnt/βcatenin信號轉(zhuǎn)導通路能夠提高乳腺癌干細胞對于放射治療的敏感性［7－8］。Kendziorra等［9］發(fā)現(xiàn)沉默Wnt轉(zhuǎn)錄因子TCF4能增加直腸癌細胞對于放射治療的敏感性。通過對Wnt信號通路里的靶基因進行篩選，發(fā)現(xiàn)在Wnt信號通路中，PRKCA和STAT5B這2個靶基因?qū)膌ncRNA與mRNA是共表達的，查詢得出SEQ-ID為16203－3的lncRNA在對照組的表達量為實驗組的3.176倍，差異有統(tǒng)計學意(P＜0.05)，SEQ-ID為31238－3的lncRNA在實驗組中的表達量為對照組中的2.037倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

綜上，本研究通過lncRNA芯片技術及對KEGG通路共同表達靶基因的分析，獲得與特定生物學過程相關靶基因PRKCA、STAT5B及對應的lncRNA，為尋找HNSCC放療敏感性的靶點lncRNA奠定了實驗基礎。

4　參考文獻

［1］Cripps C，Winquist E，Devries MC，et al.Epidermal growth factor receptor targeted therapy in stagesⅢandⅣhead and neck cancer［J］.Current Oncology，2010(3) :37－48.

［2］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2008 ［J］.CA Cancer J Clin，2008(58) : 71－96.

［3］Cripps C，Winquist E，Devries MC，et al.Epidermal growth factor receptor targeted therapy in stagesⅢand Ⅳhead and neck cancer［J］.Current Oncology，2010 (3) : 37－48.

［4］Delaney G，Jacob S，F(xiàn)eatherstone C，et al.The role of radiotherapy in cancer treatment: estimating optimal utilization from a review of evidence based clinical guidelines ［J］.Cancer，2005(104) : 1129－1137.

［5］Stein LD.Human genome: end of the beginning［J］.Nature，2004(7011) : 915－916.

［6］West WH，Tauer KW，Yannelli JR.Constant infusion of recombinant interleukin-2 in adoptive immunotherapy of advanced cancer［J］.N Engl J Med，1987(316) :898－905.

［7］Chang HW，Roh JL，Jeong EJ，et al.Wnt signaling controls radiosensitivity via cyclooxygenase-2-mediated Ku expression in head and neck cancer［J］.Int J Cancer，2008(1) : 100－107.

［8］Vaira S，F(xiàn)riday E，Scott K，et al.Wnt/beta-catenin signaling pathway and thioredoxin-interacting protein (TXNIP) mediate the " glucose sensor" mechanism in metastatic breast cancer-derived cells MDA-MB-231［J］.J Cell Physiol，2012(2) : 578－586.

［9］Kendziorra E，Ahlborn K，Spitzner M，et al.Silencing of the Wnt transcription factor TCF4 sensitizes colorectal cancer cells to (chemo-) radiotherapy［J］.Carcinogenesis，2011(12) : 1824－1831.

(2015－10－20收稿，2015－12－30修回)

中文編輯:戚璐;英文編輯:劉華

A Preliminary Screening of lncRNA That Regulates the Radiosensitivity of Head and Neck Squamous Carcinoma Cell

YE Huiping1，2，YI zhuguang3，GONG zhengpeng1，2
(1.Department of Otorhinolaryngology，the Affiliated Baiyun Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China;
2.Department of Otorhinolaryngology，the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China;
3.Department of Otorhinolaryngology，Guizhou Provincial People＇s Hospital，Guiyang 550001，Guizhou，China)

［Abstract］Objective: To preliminarily explore the function of long non-coding RNA (lncRNA) in radiotherapy of head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC).Methods: HNSCC-SCCⅦcell strains were divided into control group(no radiotherapy) and experimental group(radiotherapy intervention).Chip technology was adopted to screen out the lncRNA and mRNA of differential expression from HNSCC-SCCⅦcells after radiotherapy intervention.CIS and Trans methods were used to predict target gene.DAVID analyzing software were used for KEGG pathway screening.Then，the corresponding KEGG pathway with target gene enrichment was obtained，including tumor related pathway，Wnt signal pathway and axon guidance pathway.The corresponding target genes in the three pathway were analyzed and the lncRNAs corresponding to the target genes were found.Results: 1 280 differentially expressed lncRNAs were screened out from HNSCC-SCCⅦcell strains after radiotherapy intervention.Compared with experimental group，in control group there were totally 15 lncRNAs above 5 times high expression while there were 8 lncRNAs above 5 times low expression.There were 1 087 mRNAs of differential expression，of which there were 528 mRNAs relatively high expression in control group com-book=207,ebook=88pared with experimental group while there were 559 mRNAs relatively low expression in control group compared with experimental group.KEGG signal pathway analysis showed that the target genes corresponding to lncRNAs were enriched in tumor related pathway，Wnt signal pathway and axon guidance pathway.The lncRNAs and mRNAs corresponding to target gene PRKCA and STAT5B in Wnt signal pathway were co-expressed.The expression level of 16203－3 lncRNA in control group was 3.176 times as much as in experimental group while the expression level of 31238－3 lncRNA in experimental group was 2.037 times as much as in control group.Conclusion: PRKCA and STAT5B might be the sensitive target gene controling HNSCC radiotherapy reaction.The two lncRNA corresponding to them，16203－3 lncRNA and 31238－3 lncRNA can be taken as candidate lncRNA regulating the radiosensitivity.

［Key words］RNA，carcinoma; chip; head and neck carcinoma; KEGG pathway; radiotherapy

*［基金項目］貴州省科學技術基金［黔科合LG(2012－068)號］

［中圖分類號］R73－36

［文獻標識碼］A

［文章編號］1000-2707(2016) 02-0206-03