VGX-1027對(duì)小鼠心臟移植物缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

戴駒驥，鄭祥韜，傅紅興，周蒙滔（.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　普外科，浙江　溫州　3505；.溫州醫(yī)科大學(xué)　藥學(xué)院，浙江　溫州35035）

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VGX-1027對(duì)小鼠心臟移植物缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

戴駒驥1，鄭祥韜1，傅紅興2，周蒙滔1
（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，浙江溫州325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州325035）

[摘 要]目的：探究VGX-1027對(duì)小鼠心臟移植物缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法：取40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組，分別為單純心臟移植組和心臟移植+VGX-1027治療組，每組各20只。移植術(shù)后24 h獲取供心，通過(guò)HE染色及CD3、CD4和CD8免疫組織化學(xué)觀察移植心臟的病理學(xué)改變；Western blot法檢測(cè)移植術(shù)后供心caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)移植術(shù)后小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)。結(jié)果：與單純心臟移植組相比，心臟移植+VGX-1027治療組炎癥浸潤(rùn)明顯減少，免疫組織化學(xué)顯示CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量明顯減少；Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示Bax和caspase-3的蛋白表達(dá)量顯著減少（P＜0.05），Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；ELISA法結(jié)果顯示血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論：VGX-1027可以通過(guò)抑制移植心臟的凋亡及炎性因子的釋放減輕對(duì)心臟移植物缺血再灌注的損傷。

[關(guān)鍵詞]心臟移植；缺血再灌注損傷；VGX-1027；C57BL/6小鼠

近二十年來(lái)，心力衰竭（簡(jiǎn)稱心衰）的發(fā)病率越來(lái)越高[1]。雖然目前有很多針對(duì)心衰的治療方法，但心臟移植依然是目前終末期心衰患者的最佳選擇，可明顯提高心衰患者的長(zhǎng)期生存率[2]。

心臟移植的療效與心臟移植過(guò)程中心肌組織的缺血再灌注密切相關(guān)，移植心臟缺血再灌注損傷可引起早期移植物功能不全及晚期并發(fā)癥從而導(dǎo)致移植失敗[3]，目前臨床上亦無(wú)有效的應(yīng)對(duì)方法。因此，尋找一種能特異有效地減少心臟移植后缺血再灌注損傷的藥物對(duì)臨床治療意義重大。VGX-1027是Toll樣受體4（TLR4）的特異性拮抗劑[4]，它能通過(guò)抑制TLR4的激活來(lái)降低T淋巴細(xì)胞的增殖及炎癥因子的表達(dá)[5]，具有安全性高、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。本研究將其應(yīng)用于近交系小鼠的心臟移植，考察其對(duì)心臟移植物缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1　材料和方法

1.1試劑 Western blot檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；CD3、CD4、CD8抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司；NP-40蛋白裂解液和VGX-1027試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康BALB/c小鼠作為供體，健康C57BL/6小鼠作為受體，各40只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分成2組，分別為單純心臟移植組和心臟移植+VGX-1027（濃度為70 mg/kg）治療組（術(shù)前1 h通過(guò)尾靜脈注射給藥），每組各20只。

1.3小鼠移植心臟缺血再灌注損傷模型建立 采用0.3%的戊巴比妥鈉（濃度為0.1 mL/kg）將供體小鼠麻醉，取供心置于4 ℃心臟保護(hù)液（含110 mmol/L NaCl、25 mmol/L KCl、22 mmol/L NaHCO3、16 mmol/L MgCl2、0.8 mmol/L CaCl2和40 mmol/L葡萄糖）中[8]，2 h后進(jìn)行心臟移植。

麻醉受體小鼠，應(yīng)用Cuff技術(shù)建立小鼠頸部異位心臟移植模型：游離右頸總動(dòng)脈，用血管夾夾閉近心端，結(jié)扎并切斷遠(yuǎn)心端，將近心端穿過(guò)預(yù)先準(zhǔn)備好的cuff管，并將穿出cuff管部分的動(dòng)脈翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)套在cuff管上并用8-0的絲線結(jié)扎固定，同樣方法將右頸外靜脈套在cuff管上，將供心肺動(dòng)脈與受體小鼠右頸外靜脈的cuff管進(jìn)行吻合，并結(jié)扎固定，同樣方法將供心主動(dòng)脈與受體小鼠右頸總動(dòng)脈的cuff管吻合，松開(kāi)夾閉右頸外靜脈和右頸總動(dòng)脈的血管夾，可見(jiàn)血管和心臟充血，檢查血管連接處有無(wú)血液滲漏，完成小鼠心臟移植手術(shù)。術(shù)后肌肉注射青霉素500 U/10 g，24 h后移植心臟仍有搏動(dòng)者標(biāo)志移植成功[9-10]。

1.4組織形態(tài)學(xué)分析 取供心標(biāo)本置于4%多聚甲醛里固定，梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，脫蠟后行HE染色，觀察移植心臟組織炎癥浸潤(rùn)情況。應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)移植心臟組織中的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)情況。石蠟切片脫蠟及水化后抗原修復(fù)，血清封閉，一抗過(guò)夜。第2天加二抗37 ℃孵育30 min，然后滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）37 ℃下作用30 min，最后加DAB顯色后復(fù)染，即可脫水封片觀察CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.5Western blot法考察心臟移植物凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取部分小鼠心肌組織在液氮中充分碾磨成粉狀后，加入到NP-40裂解液中超聲裂解，在4 ℃12 000×g下離心10 min，取上清液即為提取的心臟組織蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜2 h，5%牛奶室溫封閉2 h，加入二抗室溫下孵育1.5 h，滴加顯影底物，顯影和掃描膠片。

1.6ELISA法檢查血清炎性相關(guān)因子表達(dá) 取外周血離心后收集血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，2組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.12組小鼠移植心臟的HE染色結(jié)果比較 單純心臟移植組心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，可以看到大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有大量心肌細(xì)胞壞死，而心臟移植+ VGX-1027治療組心肌組織中結(jié)構(gòu)也有紊亂，但較單純心臟移植組輕，且心肌細(xì)胞壞死得到顯著改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯降低，見(jiàn)圖1。

圖1　移植心臟組織HE染色（×400）

2.22組小鼠移植心臟的T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)比較 心臟移植+VGX-1027治療組小鼠CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況明顯少于單純心臟移植組，見(jiàn)圖2。計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞后顯示，心臟移植+VGX-1027治療組小鼠CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量明顯少于單純心臟移植組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖2　移植心臟組織免疫組織化學(xué)染色（×400）

2.32組小鼠移植心臟的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與單純心臟移植組相比，心臟移植+VGX-1027治療組小鼠心肌組織中的凋亡蛋白caspase-3和Bax的表達(dá)量顯著減少，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量顯著增加，見(jiàn)圖4。

2.42組小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)比較 ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，VGX-1027治療組小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度較單純心臟移植組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖3　移植心臟組織中細(xì)胞浸潤(rùn)水平分析結(jié)果

圖4　移植心臟組織中caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

圖5　小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)

3　討論

心臟移植物缺血再灌注損傷本質(zhì)上是一種多因素參與的炎癥性損傷[11-12]，雖然具體的作用機(jī)制和信號(hào)通路尚未得到完整的解釋，但在已有的發(fā)現(xiàn)中，TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路在其中扮演了非常重要的角色，激活TLR4可使MAPK磷酸化，隨后激活NF-κB和AP1，最終影響T淋巴細(xì)胞的增殖活化及炎癥介質(zhì)的表達(dá)，主要表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞活化、促炎因子的表達(dá)增加和抗炎因子的表達(dá)減少，從而引起心臟移植物功能不全或移植失敗[5]。VGX-1027是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的小分子化合物，可通過(guò)拮抗TLR4[6-7]，在各種急性及慢性免疫炎癥性疾病中發(fā)揮保護(hù)作用，這已經(jīng)在多種動(dòng)物模型中得到了證實(shí)[6]。

在本研究中，VGX-1027明顯抑制移植心臟組織中的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，減少全身炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，對(duì)移植心臟缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。另外，VGX-1027可使移植心臟促凋亡蛋白caspase-3和Bax的表達(dá)降低以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)升高。本研究證實(shí)了VGX-1027可以通過(guò)抑制相關(guān)炎癥因子的釋放和抗凋亡作用，來(lái)減輕心臟移植物缺血再灌注損傷。

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（本文編輯：吳昔昔）

·論著·

The protection of VGX-1027 on myocardial ischemia-reperfusion injury in mice cardiac transplantation

DAI Juji1,ZHENG Xiangtao1,FU Hongxing2,ZHOU Mengtao1.1.Department of General Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.School of Pharmacy,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035

Abstract:Objective:To explore the effect of VGX-1027 on myocardial ischemia-reperfusion (MI/R) injury in mice cardiac transplantation.Methods:Forty mice were randomly divided into 2 groups:cardiac transplantation group and cardiac transplantation+VGX-1027 group (70 mg/kg).The grafts were collected at 24 h after cardiac transplantation.Histopathology was observed with haematoxylin-eosin staining.CD3+T cell,CD4+T cell and CD8+T cell infiltrated into cardiac grafts were detected by immunohistochemistry.Expression of caspase-3,Bax and Bcl-2 were determined with Western blotting,and cytokines expression of TNF-α,IL-1β and IL-6 were measured with ELISA.Results:Compared with cardiac transplantation group,mice treated with VGX-1027 exhibited significantly lower degree of leukocyte and myocyte necrosis.The infiltration of CD3+T cell,CD4+T cell and CD8+T cell in grafts were reduced with the treatmet of VGX-1027.The expression of caspase-3 and Bax was inhibited in cardiac transplantation+VGX-1027 group while the expression of Bcl-2 was increased.Furthermore,VGX-1027 pretreatment resulted in a decrease in serum cytokines of TNF-α,IL-1β and IL-6.Conclusion:VGX-1027 can significantly reduce ischemia-reperfusion injury in mice cervical cardiac transplantation model.

Key words:heart transplantation; ischemia-reperfusion injury; VGX-1027; C57BL/6 mice

通信作者：周蒙滔，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，Email：zmt 0417@hotmail.com。

作者簡(jiǎn)介：戴駒驥（1990-），男，浙江瑞安人，碩士生。

基金項(xiàng)目：溫州市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(Y20140147）。

收稿日期：2015-08-16

[中圖分類號(hào)]R654.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.03.006