系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血漿miRNA-23a表達的檢測及意義

葉璐璐，范超凡，黃茜茜，郭剛強，章慧娣，張麗芳，林巧愛，薛向陽（.溫州醫(yī)科大學　微生物學與免疫學教研室，浙江　溫州　505；.溫州醫(yī)科大學　臨床醫(yī)學系，浙江　溫州　505；.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院　腎內(nèi)科，浙江　溫州　505）

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系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血漿miRNA-23a表達的檢測及意義

葉璐璐1，范超凡2，黃茜茜2，郭剛強1，章慧娣3，張麗芳1，林巧愛1，薛向陽1
（1.溫州醫(yī)科大學微生物學與免疫學教研室，浙江溫州325035；2.溫州醫(yī)科大學臨床醫(yī)學系，浙江溫州325035；3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江溫州325015）

[摘 要]目的：分析miR-23a在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者血漿中的表達及臨床意義。方法：收集54例SLE患者、16例類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者和20例健康對照血漿標本，抽提血漿小RNA，反轉(zhuǎn)錄后，以celmiR-39為外參，通過定量PCR檢測血漿miR-23a的表達，統(tǒng)計分析miR-23a表達水平與臨床資料的相關(guān)性。結(jié)果：miR-23a在SLE患者、健康對照和RA患者血漿中的相對表達量差異具有統(tǒng)計學意義（x2=39.199，P＜0.001）。與RA患者及健康對照比較，SLE患者血漿中miR-23a表達水平明顯下調(diào)（P＜0.05）。受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析顯示，血漿miR-23a區(qū)分SLE患者和健康對照以及RA患者的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.931和0.884。血漿miR-23a表達水平以19.22臨界值區(qū)分SLE患者和健康對照的特異性和敏感性達74.5%和88.9%；以30.98臨界值區(qū)分SLE與RA患者的特異性和敏感性達73.3%和86.3%。血漿miR-23a的表達水平與SLE臨床檢測指標的相關(guān)性分析顯示，血漿miR-23a的表達水平與抗核抗體（ANA）滴度水平及血白細胞計數(shù)（P＜0.05）相關(guān)。結(jié)論：SLE患者血漿中下調(diào)表達的miR-23a可能與其發(fā)病和病情進展相關(guān)，是SLE臨床診斷一個新的生物學指標。

[關(guān)鍵詞]系統(tǒng)性紅斑狼瘡；微小RNA；miR-23a

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，其發(fā)病機制尚未明確。目前認為，具有遺傳背景的個體在環(huán)境、性激素及感染等因素的共同作用或參與下，引起機體免疫功能異常，致使自身反應性B細胞活化，產(chǎn)生大量自身抗體，這些自身抗體與自身抗原形成的免疫復合物對機體產(chǎn)生損傷[1-2]。SLE臨床表現(xiàn)復雜、多樣，尚缺乏穩(wěn)定而準確的實驗室檢測指標用以診斷早期SLE。目前常用的臨床檢測指標，如抗dsDNA抗體、補體C3、C4、SLE病情活動指數(shù)（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）評分等，很難做到對SLE的準確診斷和病情的確切評估[3-4]。雖然已有研究提出了一些有潛在臨床檢測價值的生物標記物，如抗C1q抗體、血漿CD27陽性細胞、單核細胞趨化因子-1（MCP-1）等等[5-6]，但是這些指標并沒有確切的臨床價值。為此尋找能夠在SLE患者體內(nèi)特異表達的生物學指標，將為輔助診斷疾病、評估病情、判斷治療效果和預后提供基礎(chǔ)。

microRNAs（miRNAs）是一種小的（～21 nt）、內(nèi)源性的、非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的非編碼區(qū)（3’-UTR）完全或不完全匹配，降解mRNA或抑制翻譯，負性調(diào)控基因表達[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs與機體免疫功能和自身免疫耐受有關(guān)[9]，許多自身免疫性疾病，如類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、干燥綜合征、硬皮病和SLE等的發(fā)病都可能與miRNAs有關(guān)[10-13]。有學者認為，miRNAs的作用與SLE的發(fā)病、復發(fā)和特定器官的自身免疫性損傷存在一定聯(lián)系[14]，miRNAs與SLE的發(fā)病機制密切相關(guān)[15]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，除了細胞內(nèi)，血清（血漿）、淚液、唾液、母乳、氣管灌洗液、腦脊液、羊水等體液均存在miRNAs[16-17]。這些miRNAs具有抵抗RNA酶的能力，在體外可以長時間存在而不降解，這一特性使循環(huán)miRNAs非常適合作為疾病的血清標志物[18-22]。

本課題組前期利用miRNAs芯片分析SLE患者血漿miRNAs表達情況時發(fā)現(xiàn)，與健康對照者比較，SLE患者血漿中的miR-23a表達明顯下調(diào)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a可以參與調(diào)節(jié)巨噬細胞分泌炎癥因子[23-24]。此外，有人提出將miR-23a作為特發(fā)性肺動脈高壓的一個檢測指標[25]。但是目前鮮見血漿miR-23a與SLE的相關(guān)性報道。因此，本研究通過定量PCR檢測SLE患者血漿miR-23a的表達，并分析其表達與臨床資料的相關(guān)性，探討血漿miR-23a表達與SLE的關(guān)系。

1　對象和方法

1.1研究對象 外周血樣本共90份，來源于54例SLE患者、20例健康對照者和16例RA患者。SLE患者為2014年6月-2015年4月間在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院風濕免疫科、腎內(nèi)科收治確診者，其中男10例，女44例，年齡21～63歲，中位年齡34歲，均符合美國風濕病學會（American College of Rheumatology，ACR）1997年修訂的SLE分類標準，采用SLEDAI評分評估疾病活動度。20例健康對照者為同期健康體檢者，排除心血管、腫瘤，以及其他自身免疫性疾病，其中男10例，女10例，年齡18～56歲，中位年齡32歲。16例RA患者為同期在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院風濕免疫科收治確診者，其中男7例，女9例，年齡25～72歲，中位年齡46歲，均符合2010年ACR和歐洲抗風濕病聯(lián)盟（European League Against Rheumatism，EULAR）提出的分類標準。

1.2主要試劑 Tri-Reagent BD試劑購自美國Sigma公司；miScript II RT kit及miScript SYBR Green PCR Kit均購自德國QIAGEN公司；DEPC處理水購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3方法

1.3.1標本收集及保存：取EDTA抗凝的外周血標本（當天抽?。? ℃，3 000 r/min離心10 min，收集血漿，進一步經(jīng)4 ℃，12 000 r/min離心10 min，去除殘留的細胞碎片。血漿標本置-80 ℃冰箱保存。1.3.2 血漿RNA抽提：按Tri-Reagent BD試劑說明書步驟抽提血漿RNA。為增加RNA獲得率，在抽提時加入1 μL糖原，并采用80%乙醇洗滌RNA沉淀。以DEPC處理水溶解RNA，-80 ℃冰箱保存。為消除血漿RNA抽提的誤差，每份標本均取200 μL，而且抽提前加入1 nmol/μL與人miRNAs無同源性的celmiR-39外參照（由上海吉瑪公司合成）。

1.3.3miR-23a表達的檢測：按照miScript II RT kit說明書，取5 μL血漿RNA，以miR-23a的RT引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得miR-23a的cDNAs。反轉(zhuǎn)錄的反應條件為：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱。由QIAGEN公司設(shè)計合成引物miScript Primer Assay，以20 μL反應體系進行熒光定量PCR，檢測miR-23a的表達量。PCR反應條件為：95 ℃預變性15 min后，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，循環(huán)40次。外參照cel-miR-39的檢測按照QIAGEN公司熒光定量PCR檢測試劑盒進行，每個樣品做2個復孔。采用ABI StepOne Plus實時熒光定量PCR儀進行檢測，記錄每個孔中熒光信號到達設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)（Ct值）。根據(jù)待測標本的Ct值，以cel-miR-39作為外參照，采用定量PCR中的相對定量法，以N=2-△Ct表示標本中miR-23a相對表達量，其中△Ct=Ct（miR-23a）-Ct（cel-miR-39）。為方便數(shù)據(jù)計算，所有數(shù)值均放大10 000倍。PCR產(chǎn)物采用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4統(tǒng)計學處理方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析。以中位數(shù)及四分位間距表示miR-23a的表達數(shù)據(jù)，2組獨立樣本間比較采用Mann-Whitney U檢驗，2組以上獨立樣本間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。采用ROC曲線分析敏感性和特異性。對于定量的臨床資料，用Pearson相關(guān)分析法分析2組間的相關(guān)性，對于定性的臨床資料，用卡方檢驗/Fisher精確檢驗比較相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1血漿miR-23a表達檢測特異性分析 血漿標本抽提的miRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用定量PCR檢測。圖1顯示，miR-23a及外參照cel-miR-39定量PCR的溶解曲線為單峰。圖2顯示，其PCR產(chǎn)物經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳顯示為單一條帶，而未反轉(zhuǎn)錄的RNA對照及空白對照均無擴增產(chǎn)物，說明定量PCR體系可以特異檢測血漿標本中miR-23a。

圖1　血漿miR-23a實時熒光定量PCR的溶解曲線圖

圖2　瓊脂糖凝膠電泳miR-23a PCR產(chǎn)物的結(jié)果

圖3　SLE患者、RA患者和健康對照者血漿中miR-23a表達水平

2.2miR-23a在SLE患者、健康對照者和RA患者血漿中的相對表達量 如圖3所示，miR-23a在SLE患者、健康對照者和RA患者血漿中的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（x2=39.199，P＜0.001）。SLE患者血漿中miR-23a相對表達量為4.13（1.41，11.94），明顯低于健康對照者的127.19（27.26，360.36）及RA患者的45.23（17.76，82.65）（P＜0.01）。與健康對照者比較，RA患者血漿中miR-23a相對表達水平也明顯降低（P＜0.01）。

2.3血漿miR-23a診斷SLE的敏感性和特異性 ROC曲線分析顯示，以miR-23a的相對表達量區(qū)分SLE患者與健康對照者的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.881（P＜0.001）。以19.22為臨界值（cutoff值）區(qū)別SLE患者和健康對照者的特異性和敏感性分別為74.5%和88.9%，見圖4A。以miR-23a的相對表達量區(qū)分SLE患者與RA患者的AUC為0.801（P＜0.001）。以30.98為臨界值區(qū)別SLE患者和RA患者的特異性和敏感性為73.3%和86.3%（見圖4B）。

圖4　血漿miR-23a作為SLE診斷的敏感性和特異性分析

2.4血漿中miR-23a表達水平與SLE患者臨床特征的關(guān)系 如表1所示，血漿miR-23a相對表達量與SLE患者性別、年齡、病情嚴重程度（SLEDAI評分）無明顯相關(guān)（P＞0.05）；SLE患者血漿中miR-23a的表達水平在不同抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）滴度水平組間差異有統(tǒng)計學意義，高抗ANA滴度的SLE患者血漿中miR-23a的表達水平明顯較低（P=0.041）；SLE患者血漿中miR-23a的表達水平與抗ds-DNA等其他常見臨床檢測的自身抗體間未見明顯相關(guān)性（P＞0.05）；與正常白細胞計數(shù)SLE患者比較，低白細胞計數(shù)SLE患者血漿miR-23a表達水平明顯降低（P=0.045），但血漿miR-23a的表達水平與淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞數(shù)間未見明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a可以抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，其主要機制是抑制了p21活化的cAMP依賴性蛋白激酶-6（cAMP-dependent protein kinase 6，PKA-6）及其下游分子LIM激酶-1（LIMK-1），發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞骨架的作用，而在前列腺癌患者中則發(fā)現(xiàn)miR-23a的表達顯著下調(diào)[26]。腫瘤特異性CD8+T淋巴細胞中的miR-23a表達下降與轉(zhuǎn)化生長因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）介導的免疫抑制有關(guān)[27]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a可以直接與端粒重復序列結(jié)合因子-2（telomere repeat binding factor 2，TRF-2）作用，導致TRF-2異常表達，影響端粒酶的活性，進而加速細胞衰老[28]。Peng等[23]發(fā)現(xiàn)在人的原始巨噬細胞中，miR-23a的表達量往往很高，并且在進一步研究后提出，miR-23a可以通過作用于A20基因，影響核因子-κB （nuclear factor kappa B，NF-κB）的活性，從而影響整條NF-κB信號通路，調(diào)節(jié)巨噬細胞合成和分泌炎癥因子。細胞外游離的miRNA作為疾病標志物是近年來研究的熱點。許多血漿miRNA已被證實是癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病等多種疾病的生物標志[21，23，29]。

本研究發(fā)現(xiàn)，SLE及RA患者血漿中miR-23a表達水平均明顯低于健康對照者，提示循環(huán)miR-23a下調(diào)表達可能是多種自身免疫性疾病的共同特征。此外，與RA患者相比，SLE患者血漿miR-23a表達水平也是明顯偏低。進一步的ROC曲線分析顯示，血漿miR-23a表達水平可以作為臨床上診斷SLE和區(qū)分SLE與RA的一個指標。最近，Sarrion等[24]針對循環(huán)miR-23a的研究發(fā)現(xiàn)，其與特發(fā)性肺動脈高壓患者的肺功能有關(guān)，可作為評價特發(fā)性肺動脈高壓患者病情的一個生物標記物。本研究中，血漿miR-

23a表達水平與SLE臨床特征的相關(guān)分析顯示，高抗ANA滴度及低白細胞計數(shù)的SLE患者循環(huán)miR-23a的表達水平明顯降低。已經(jīng)明確，自身抗體，尤其是ANA，是SLE發(fā)病的重要機制，而白細胞計數(shù)減少是SLE活動的重要指標。這些結(jié)果進一步提示，循環(huán)miR-23a下調(diào)表達可能參與SLE的發(fā)病過程，其具體作用機制有待于進一步研究。

表1　血漿中miR-23a表達與SLE臨床特征的相關(guān)性分析

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（本文編輯：丁敏嬌）

·論著·

Detection of the plasma miR-23a expression in systemic lupus erythematosus and its clinical significance

YE Lulu1,FAN Chaofan2,HUANG Xixi2,GUO Gangqiang1,ZHANG Huidi3,ZHANG Lifang1,LIN Qiaoai1,XUE Xiangyang1.1.Department of Medical Microbiology and Immunology,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035; 2.Department of Clinical Medicine,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035; 3.Department of Nephrology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015

Abstract:Objective:To explore miR-23a expression and its clinical significance in the plasma of systemic lupus erythematosus (SLE) patients.Methods:Plasma samples from 54 SLE patients,16 rheumatoid arthritis (RA) patients and 20 healthy controls were collected.The small RNAs in these plasma samples were isolated and reversely transcribed.Using cel-miR-39 as the external reference,the levels of miR-23a expression were detected with real-time polymerase chain reaction (PCR) method.The correlation between the levels of miR-23a expression and the clinical pathological features of SLE and biological significance of miR-23a expression in SLE were further analyzed with statistical methods.Results:Our data indicated that the levels of miR-23a expression in the plasma of SLE patients,RA patients and healthy controls were significantly different (x2=39.199,P＜0.001).The level of miR-23a in the plasma of SLE patients was statistically lower than that in RA patients and healthy controls (P＜0.05).The area under the ROC (receiver-operating characteristic) curve (AUC) was 0.931 for discriminating between SLE patients and normal subjects and 0.884 for discriminating between SLE and RA patients and patients.The levels of miR-23a expression were set the cutoff values of 19.22 for healthy control and 30.98 for RA patients,the diagnostic sensitivity and specificity were 74.5%,88.9%,and 73.3%,86.3%,respectively.The analysis of the correlation between miR-23a expression and the clinical pathological features of SLE shown that the levels of plasma miR-23a expression had positively correlated with anti-ANA titers and negatively correlatedbook=169,ebook=17with white blood cell count (P＜0.05).Conclusion:Down-regulated of miR-23a expression in plasma of SLE may be involved in the SLE disease occurrence or development and can be used as a novel potential diagnostic biomarker for SLE.

Key words:systemic lupus erythematosus; microRNA; miR-23a

通信作者：薛向陽，副教授，Email：wyxyy001@163.com。

作者簡介：葉璐璐（1989-），女，安徽安慶人，碩士生。

基金項目：浙江省自然科學基金資助項目（LY12H05003，LY15H100004）；浙江省科技廳科研基金資助項目（2012C 33126）；浙江省大學生新苗人才計劃（2014R413058，2015R413027，2015R413069）。

收稿日期：2015-09-14

[中圖分類號]R593．24

[文獻標志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.03.003