CAR-T細(xì)胞的作用機(jī)制及其在B淋巴細(xì)胞血液惡性腫瘤治療中的研究進(jìn)展

張?zhí)焐?，鄭小麗，?芳， 姬新

1. 河南大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，河南 開封 475001； 2. 河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 抗體藥物河南省國際聯(lián)合實驗室，河南 開封 475004

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CAR-T細(xì)胞的作用機(jī)制及其在B淋巴細(xì)胞血液惡性腫瘤治療中的研究進(jìn)展

1. 河南大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，河南 開封 475001； 2. 河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 抗體藥物河南省國際聯(lián)合實驗室，河南 開封 475004

摘要：〔結(jié)論〕 應(yīng)用嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)治療急性和慢性淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤,在近期已取得了快速進(jìn)展。CAR-T細(xì)胞是將T細(xì)胞受體基因和抗CD19抗體基因嵌合，轉(zhuǎn)染至T細(xì)胞，在體外擴(kuò)增后回輸給患者來治療B淋巴細(xì)胞血液惡性腫瘤的新型靶向治療方法。經(jīng)過基因改造后的CAR-T細(xì)胞的表面具有特異性位點，可以識別B淋巴細(xì)胞血液惡性腫瘤中B細(xì)胞表面的CD19抗原。CD19抗原的持續(xù)刺激可使CAR-T細(xì)胞不斷增殖活化，有效殺傷腫瘤細(xì)胞。本文就嵌合抗原受體(CAR)的結(jié)構(gòu)、CAR-T細(xì)胞抗腫瘤作用的機(jī)制,及其對B淋巴細(xì)胞血液惡性腫瘤的臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：CAR-T；急性淋巴細(xì)胞白血病； B細(xì)胞淋巴瘤；細(xì)胞免疫；生物治療

B淋巴細(xì)胞血液惡性腫瘤主要包括急性淋巴細(xì)胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia，ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)及B細(xì)胞淋巴瘤。長期以來，血液系統(tǒng)惡性腫瘤以放療、化療及手術(shù)等作為傳統(tǒng)的抗腫瘤治療模式，復(fù)發(fā)和難治常常是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。利妥昔單抗(美羅華)的問世使表達(dá)CD20的成熟B細(xì)胞淋巴瘤、白血病的生存率有了大幅度的提升，然而仍然有20%-30%患者因復(fù)發(fā)和難治而死亡[1-2]。近幾年來，隨著特異性識別B細(xì)胞表面CD19的嵌合抗原受體的T細(xì)胞(CAR-T)的研究及其在B淋巴細(xì)胞血液惡性腫瘤治療中的應(yīng)用，該類疾病的生存率和治愈率有望進(jìn)一步提高。

1CAR的結(jié)構(gòu)

CAR是由T細(xì)胞受體的胞外抗原結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)信號區(qū)三部分組成。胞外區(qū)具有抗體單鏈可變區(qū)片段，能特異性識別特定腫瘤抗原，將其轉(zhuǎn)染至T細(xì)胞所制備的CAR-T，便具有了抗體的特異性和效應(yīng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。且利用該胞外區(qū)單鏈的可變性,可以制備出與不同的腫瘤抗原結(jié)合的CAR-T，因此胞外區(qū)決定了CAR的特異性。而近幾年來通過對胞內(nèi)信號區(qū)設(shè)計的改造，CAR-T經(jīng)歷了從1代到4代的變遷。

2CAR-T細(xì)胞抗腫瘤作用的原理

細(xì)胞毒T細(xì)胞(cytotoxic T cell，CTL)是經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞激活的CD8+ T淋巴細(xì)胞，該活化過程需要雙信號途徑。第一信號途徑為抗原遞呈細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)分子-抗原肽復(fù)合體與T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)結(jié)合，第二信號為抗原遞呈細(xì)胞上的共刺激分子B7與T細(xì)胞上的CD28分子結(jié)合，在這兩種信號的共同作用下，T細(xì)胞會活化增殖為CTL細(xì)胞。當(dāng)CTL細(xì)胞再次遇到攜帶有相同MHC分子-抗原肽復(fù)合體的腫瘤細(xì)胞時，就會通過同樣的機(jī)制與之結(jié)合，并分泌穿孔蛋白、粒酶及細(xì)胞因子,協(xié)同作用殺死腫瘤細(xì)胞。早期設(shè)計的第一代CARs比較簡單，僅有一個胞內(nèi)信號區(qū)，信號主要通過CD3ζ上的免疫受體酪氨酸激酶活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM) 傳導(dǎo)，缺乏T細(xì)胞增殖的第2信號，T細(xì)胞在結(jié)合腫瘤抗原后很難進(jìn)一步增殖，因此只有較弱的抗瘤作用[3]。

第二代CARs是在第一代的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改造，將傳遞第2信號的CD28或4-1BB分子的活性域這些共刺激分子與CD3ζ串聯(lián)起來整合到CAR中，從而提高了T細(xì)胞的效應(yīng)功能[4]。當(dāng)在體內(nèi)遇到腫瘤抗原后， 第 2 代CAR-T細(xì)胞在殺死腫瘤細(xì)胞的同時，還能完成自身的擴(kuò)增。在CAR-T細(xì)胞中加入共刺激信號4-1BB可增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的存活時間、 腫瘤定位的CAR-T細(xì)胞增多以及抗腫瘤能力提高[5]。因其表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤作用，目前二代CAR-T用于臨床研究中輸注。

第三代CARs的胞內(nèi)信號區(qū)含有兩個共刺激分子(如CD28與CD137/CD134嵌合體與CD3-ζ串聯(lián)組成)，在這種外源性共刺激分子的作用下，這些轉(zhuǎn)基因CAR-T細(xì)胞可產(chǎn)生足夠的白介素2(IL-2)促進(jìn)其增殖。與2代CAR相比，3代CAR具有較強(qiáng)的細(xì)胞溶解作用， 且其體內(nèi)擴(kuò)增能力及產(chǎn)生細(xì)胞因子能力更強(qiáng)。從CAR-T細(xì)胞胞內(nèi)信號區(qū)和活化區(qū)結(jié)構(gòu)及功能來推論其體內(nèi)抗腫瘤活性的話， 2代CAR優(yōu)于1代CAR， 3代CAR優(yōu)于2代CAR， 但最近研究表明CAR-T細(xì)胞的功能活性除與其胞內(nèi)的信號序列有關(guān)外， 還與靶細(xì)胞提供的內(nèi)源性受體有關(guān)[6]。 3代CARs是否優(yōu)于第2代,CARs還有待于臨床驗證。

第四代CAR-T是基于1-3代CAR-T在輸注前需對患者進(jìn)行預(yù)處理而設(shè)計的。Pegram[7]設(shè)計了具有分泌IL-12且靶向CD19的CAR-T細(xì)胞，可以在患者缺乏預(yù)處理的情況下具有抗CD19+腫瘤作用，使患者免受預(yù)處理治療的毒副反應(yīng)，拓寬了CAR-T細(xì)胞的臨床應(yīng)用范圍。

3CAR-T對B淋巴細(xì)胞血液惡性腫瘤的臨床應(yīng)用

3.1抗CD19 CAR-T細(xì)胞相關(guān)臨床研究

CAR-T在B淋巴細(xì)胞血液惡性腫瘤的研究中已取得了令人矚目的成就，因為B淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞表面常穩(wěn)定表達(dá)CD19分子，所以針對CD19的CAR-T靶向治療顯示出良好的應(yīng)用前景。

2014年第56屆美國血液學(xué)會(American Society of Hematology，ASH)年會上，共收錄55篇有關(guān)CAR-T細(xì)胞的研究摘要，其中在口頭報告的14篇中就有11篇是抗CD19 CAR-T的相關(guān)研究。在本屆年會上，來自美國國家癌癥中心的Rosenbeng課題組口頭報告了30例難治性B細(xì)胞淋巴瘤患者在接受靶向CD19的第二代CAR-T細(xì)胞治療后，27例可評估病例中有22例獲得完全緩解(CR)或部分緩解(PR),最長的CR持續(xù)了37個月。該中心在本次ASH會議上報告了他們的最新進(jìn)展：通過減低化療劑量聯(lián)合CAR-T治療9例化療耐藥的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤，獲得1例CR、4例PR、2例預(yù)后差的臨床結(jié)果[8]，且9例患者均未產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)。提示低劑量化療聯(lián)合CAR-T對進(jìn)展性B細(xì)胞淋巴瘤有可能成為標(biāo)準(zhǔn)治療方案。該課題組還報告了第二代抗CD19 CAR-T細(xì)胞治療20例復(fù)發(fā)難治ALL后能取得67%的CR率，且61%的患者腦脊液中可以檢測到CAR-T細(xì)胞，提示了CAR-T細(xì)胞清除中樞系統(tǒng)白血病細(xì)胞的治療潛力。來自賓夕法尼亞大學(xué)的June課題組在本屆ASH會議上報告了第二代抗CD19的CAR-T細(xì)胞治療39例復(fù)發(fā)難治的兒童ALL的臨床研究結(jié)果，其中36例(92%)患兒達(dá)到CR，包括1例異常表達(dá)CD19的T-ALL；3例患者無應(yīng)答，10例在隨訪期間復(fù)發(fā)。他們發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞可在體內(nèi)富集擴(kuò)增，體內(nèi)存活時間可以維持2年以上[9]。在會議報告中，June還指出抗CD19的CAR-T細(xì)胞能夠識別低表達(dá)的抗原，在CD19弱表達(dá)的多發(fā)性骨髓瘤的小樣本研究中也顯示出較好的療效。

3.2抗CD19 CAR-T細(xì)胞臨床應(yīng)用中的不良反應(yīng)與潛在風(fēng)險

CAR-T細(xì)胞應(yīng)用過程與其他大多數(shù)細(xì)胞過繼輸入治療相類似，需要配合使用細(xì)胞因子及其他相關(guān)處理，常見的不良反應(yīng)有寒戰(zhàn)、發(fā)熱、白細(xì)胞減少、腫瘤溶解綜合征、細(xì)胞因子風(fēng)暴、B細(xì)胞缺乏引起的低免疫球蛋白血癥等[10]。Brentjens[11]等也有關(guān)于輸注CAR-T細(xì)胞后發(fā)生嚴(yán)重感染致死的報道。另外，在CAR-T細(xì)胞的制備過程中，需要將抗體序列及T細(xì)胞受體信號途徑的編碼分子相關(guān)的序列導(dǎo)入T細(xì)胞內(nèi)，盡管目前常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、轉(zhuǎn)座子、mRNA電轉(zhuǎn)入等方式導(dǎo)入外源基因進(jìn)行治療被認(rèn)為是安全的，但是由于外源基因是隨機(jī)整合至宿主基因組并在細(xì)胞內(nèi)長期存在且穩(wěn)定表達(dá)，存在不合適的插入位點突變就有可能會引起細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的潛在風(fēng)險[12]。

針對血液B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤的CAR-T細(xì)胞，目前已在全球范圍內(nèi)引起極大關(guān)注，不少國家和地區(qū)的醫(yī)療、科研機(jī)構(gòu)已進(jìn)行了大量的臨床試驗。在臨床使用過程中，因為其應(yīng)用時間較短，更多的不良反應(yīng)和并發(fā)癥尚不十分清楚。但是由于其在治療B細(xì)胞惡性腫瘤尤其是對復(fù)發(fā)、難治性B細(xì)胞惡性腫瘤中，還可作為補(bǔ)救治療并顯示出顯著的治療效果，因此CAR-T細(xì)胞免疫治療在臨床中的應(yīng)用和推廣非常值得期待。

參考文獻(xiàn)：

[1] Cheson B D, Leonar D J. Monoclonal antibody therapy for B-cell non-Hodgkin's lymphoma [J]. The New England Journal of Medicine, 2008,359(6):613-626.

[2] Brentjens R J, Davila M L, Riviere I, et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia [J]. Science Translational Medicine, 2013,5(177):177ra38.

[3] Jensen M C, Popplewell L, Cooper L J, et al. Antitransgene rejection responses contribute to attenuated persistence of adoptively transferred CD20/CD19-specific chimeric antigen receptor redirected T cells in humans[J]. Biology of Blood and Marrow Transplant, 2010,16(9):1245-1256.

[4] Kalos M , Levine B L, Porter D L, et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia[J]. Science Translational Medicine, 2011,3(95):95ra73.

[5] Song D G, Ye Q , Carpenito C , et al. In vivo persistence, tumor localization, and antitumor activity of CAR-engineered T cells is enhanced by costimulatory signaling through CD137 (4-1BB)[J]. Cancer Research, 2011,71(13):4617-4627.

[6] Cheadle E J, Rothwell D G, Bridgeman J S, et al. Ligation of the CD2 co-stimulatory receptor enhances IL-2 production from first-generation chimeric antigen receptor T cells[J]. Gene Therapy, 2012,19(11):1114-1120.

[7] Pegram H J, Lee JC, Hayman E G, et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning [J]. Blood, 2012,119(18):4133-4141.

[8] Kochenderfer JN, Somerville R, Lu LL, et a1. Anti-CD19 CAR T cells administered after low-dose chemotherapy can induce remissions of chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma [J]. Blood, 2014,124(21):550

[9] Grupp SA, Maude SL, Shaw P, et a1. T cells engineered with a chimeric antigen receptor (CAR) targeting CD19 (CTL019) have long term persistence and induce durable remissions in children with relapsed, refractory ALL[J]. Blood (ASH annual meeting abstracts)，2014,124(21):380．

[10] Brentjens R J, Riviere I, Park J H, et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias[J]. Blood, 2011,118(18):4817-4828.

[11] Brentjens R, Yeh R, Bernal Y, et al. Treatment of chronic lymphocytic leukemia with genetically targeted autologous T cells: case report of an unforeseen adverse event in a phase I clinical trial[J]. Mol Ther, 2010,18(4):666-668.

[12] Hoyos V, Savoldo B, Dottl G. Genetic modification of human T lymphocytes for the treatment of hematologic malignancies [J]. Haematologica, 2012,97(11):1622-1631.

[責(zé)任編輯李麥產(chǎn)]

Antitumor mechanism of CAR-T cells and their advances in the treatment of hematologic malignancies in B lymphocytes

1. The First Affiliated Hospital of Henan University, Henan Kaifeng 475001, China; 2. Medical College of Henan University, Henan International Union Laboratory of antibody drugs, Henan Kaifeng 475004, China

Abstract:Application of chimeric antigen receptor T CAR-T chimeric receptor T (antigen cell) in the treatment of acute and chronic lymphocytic leukemia, B cell lymphoma in the near future has made rapid progress. CAR-T cell is the T cell receptor gene and anti CD19 antibody gene chimeric, transfected to T cells, in vitro amplification of the patient after the return to the treatment of B lymphocytes in the blood of malignant tumors of the new targeted therapy. After the transformation of the CAR-T cell surface with specific sites, you can identify the B lymphocytes in the blood of malignant tumor B cell surface CD19 antigen. The continuous stimulation of CD19 antigen can activate CAR-T cells to proliferate and activate, and kill the tumor cells effectively. in this paper, we reviewed the structure of chimeric antigen receptor (CAR), the mechanism of anti tumor action of CAR-T cells and the clinical application of B lymphocytes in the treatment of hematological malignancies.

Key words:CAR-T; acute lymphoblastic leukemia; B cell lymphoma; cellular immunity; biological therapy

中圖分類號：R967

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡介：張?zhí)焐?1980-)，男，河南人，河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，從事血液病臨床工作。 通信作者：姬新穎(1963-)，男，河南新安人，河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授，從事細(xì)胞免疫研究與治療工作。

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目(81270142，81470545)

收稿日期：2015-10-16

文章編號：1672-7606(2016)01-0071-03