膿毒癥患者血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平與機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的相關(guān)性研究

耿延青

[摘要] 目的 探討膿毒癥患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的水平與細(xì)胞免疫的關(guān)系。 方法 以2013年7月～2014年6月浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院收治的膿毒癥患者53例為觀察組。將觀察組患者按病情分為膿毒癥組（18例）、嚴(yán)重膿毒癥組（21例）、膿毒癥休克組（14例）；按28 d預(yù)后情況分為死亡組（16例）和存活組（37例）。另選取25名健康者為對照組。用流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Treg及T細(xì)胞亞群水平并進(jìn)行組間比較。 結(jié)果 CD4+CD25+Treg表達(dá)率：膿毒癥休克組>嚴(yán)重膿毒癥組>膿毒癥組>對照組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平：膿毒癥組>對照組>嚴(yán)重膿毒癥組>膿毒癥休克組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。CD8+水平各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。死亡組CD4+CD25+Treg表達(dá)率明顯高于存活組（P < 0.05）；CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明顯低于存活組（P < 0.05）；CD8+水平兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 膿毒癥患者Treg細(xì)胞水平增高，可能導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群水平降低，在預(yù)測患者預(yù)后方面有一定作用。

[關(guān)鍵詞] 膿毒癥；細(xì)胞免疫；CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

[中圖分類號] R392 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）01（c）-0007-05

膿毒癥（sepsis）是感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）。膿毒癥造成多器官功能衰竭是嚴(yán)重創(chuàng)傷患者死亡的主因之一。已往研究認(rèn)為，膿毒癥是過度炎性反應(yīng)的一系列綜合征，也就是機(jī)體自身滅活病原體的免疫機(jī)制被過度激活，導(dǎo)致炎性反應(yīng)失控，從而引起機(jī)體自身損傷，導(dǎo)致多器官功能衰竭甚至死亡。對膿毒癥發(fā)病機(jī)制的深入探索揭示，除了病原菌及其毒素對正常組織的侵害之外，機(jī)體自身免疫功能失衡也在膿毒癥的發(fā)病及進(jìn)展中也起著重要作用[1]。免疫亢進(jìn)與免疫抑制兩種病理狀態(tài)同時存在，加劇了膿毒癥的進(jìn)展。近年研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體中存在著CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）。膿毒癥患者Treg水平升高，從而啟動免疫抑制效應(yīng)，誘發(fā)T淋巴細(xì)胞過度凋亡，這正是膿毒癥患者免疫功能紊亂的發(fā)生機(jī)制[2]。本研究檢測了膿毒癥患者Treg細(xì)胞與T細(xì)胞亞群水平，分析兩者的相關(guān)性及與膿毒癥患者病情與預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)總結(jié)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年7月～2014年6月在浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）治療的膿毒癥患者53例為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合國際膿毒癥定義會議制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有自身免疫系統(tǒng)疾?。虎诩毙阅X卒中；③心肌梗死；④病毒性肝炎；⑤HIV感染；⑥入院前3個月內(nèi)使用過激素或免疫抑制劑者。入選患者男31例，女22例；年齡31～69歲，平均（58.52±13.46）歲。疾病構(gòu)成：消化道穿孔破裂術(shù)后21例；膽囊壞死及重癥膽管炎12例；腸梗阻術(shù)后9例；肺部感染11例。選取25名健康者為對照組，男15例，女10例；年齡32～65歲，平均（56.25±14.62）歲。將觀察組患者按疾病嚴(yán)重程度分為膿毒癥組（18例）、嚴(yán)重膿毒癥組（21例）、膿毒癥休克組（14例）；按28 d預(yù)后情況分為死亡組（16例）和存活組（37例）。

1.2 方法

1.2.1 一般監(jiān)測指標(biāo) 監(jiān)測記錄血乳酸水平、氧合指數(shù)；評估急性生理和慢性健康評分（APACHEⅡ評分）。血乳酸水平檢測儀器為美國雅培I-Stat血液分析儀。抽取動脈血1 mL，應(yīng)用電極法測定血乳酸值。氧合指數(shù)通過測定動脈氧分壓后計算得出（氧合指數(shù)=動脈氧分壓/吸入氧濃度）。APACHEⅡ評分包括急性生理評分、年齡評分、慢性健康評分三部分，總分0～71分。

1.2.2 試驗指標(biāo) 符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者于入選當(dāng)天采肘靜脈血10 mL，4 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Treg及T細(xì)胞亞群水平。另25名例健康者作為對照組同期進(jìn)行試驗。

試劑與儀器：異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的小鼠抗人CD25單抗，藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的CD4單抗，CD25同型陰性對照試劑，CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CYS試劑（美國Beckman-Coulter公司），細(xì)胞膜滲透性試劑盒（美國eBioscience公司）。流式細(xì)胞儀（美國Beckman-Coulter公司）。

CD4+CD25+Treg檢測：將25 μL抗凝全血加入試管中，再添加5 μL CD25-FITC與5 μL CD4-PE，混勻并在室溫環(huán)境下避光反應(yīng)15 min，添加500 μL溶血劑，放置于37℃水浴箱中保存10 min，然后上流式細(xì)胞儀檢測。T細(xì)胞亞群檢測：取100 μL全血，采用全血流式細(xì)胞儀三色標(biāo)記法（直接免疫熒光標(biāo)記法），確定CD3+、CD4+、CD8+并計算CD4+/CD8+。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般臨床資料比較

不同病情患者各指標(biāo)比較：血乳酸水平、APACHEⅡ評分，膿毒癥休克組>嚴(yán)重膿毒癥組>膿毒癥組（P < 0.05）；氧合指數(shù)，膿毒癥組>嚴(yán)重膿毒癥組>膿毒癥休克組（P < 0.05）。見表1。

不同預(yù)后患者各指標(biāo)比較：存活組血乳酸水平、APACHEⅡ評分低于死亡組（P < 0.05）；存活組氧合指數(shù)高于死亡組（P < 0.05）。見表2。

2.2 各組CD4+CD25+Treg表達(dá)率與T細(xì)胞亞群水平比較

不同病情患者各指標(biāo)比較：CD4+CD25+Treg表達(dá)率，膿毒癥休克組>嚴(yán)重膿毒癥組>膿毒癥組>對照組（P < 0.05）；CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平，膿毒癥組>對照組>嚴(yán)重膿毒癥組>膿毒癥休克組（P < 0.05）；CD8+各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

不同預(yù)后患者各指標(biāo)比較：死亡組CD4+CD25+Treg表達(dá)率明顯高于存活組（P < 0.05）；CD3+、CD4+、CD4+/CD8+明顯低于存活組（P < 0.05）；CD8+兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表4。

2.3 各指標(biāo)相關(guān)性分析

膿毒癥患者CD4+CD25+Treg表達(dá)率與APACHEⅡ評分呈正相關(guān)（r=0.793，P < 0.05）；與血乳酸水平呈正相關(guān)（r=0.627，P=0.01）；與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)（r=-0.623，P < 0.05）。

3 討論

3.1 促炎/抗炎反應(yīng)失衡促進(jìn)膿毒癥發(fā)病的機(jī)制

膿毒癥的本質(zhì)是機(jī)體對感染的過度免疫反應(yīng)。目前認(rèn)為促炎反應(yīng)/抗炎反應(yīng)動態(tài)失衡在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。促炎/抗炎反應(yīng)過程可分為兩個階段：

第一個階段是炎癥反應(yīng)綜合征期。此時期的顯著特征是細(xì)胞免疫狀態(tài)呈增高趨勢，主要為大量產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等前炎癥細(xì)胞因子，使機(jī)體的炎性反應(yīng)被充分激活，導(dǎo)致單核細(xì)胞急劇增殖，同時活性水平增高，分泌TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)抗原性T淋巴細(xì)胞活化。TNF-α、IL-1 和 IL-6也是膿毒癥早期的促炎因子，可以通過促進(jìn)自由基、緩激肽、組胺等產(chǎn)生，激活補(bǔ)體等，加重膿毒癥患者的組織損傷[3]。另外，在膿毒癥患者的促炎反應(yīng)還表現(xiàn)為前列腺素E2（PGE2）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）合成增多，對機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生了很大的影響[4]。

第二個階段是代償性抗炎反應(yīng)期。激發(fā)炎癥反應(yīng)綜合征之后，隨著膿毒癥促炎反應(yīng)發(fā)展，在膿毒癥的后期，機(jī)體啟動代償性抗炎反應(yīng)，進(jìn)入免疫抑制狀態(tài)，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)免疫麻痹，其典型表現(xiàn)是CD4+ T淋巴細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞不斷出現(xiàn)凋亡，而且增殖能力明顯降低，其造成的免疫抑制是膿毒癥病理生理機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，使機(jī)體對病原體的易感性明顯增加。同時，在機(jī)體的負(fù)向調(diào)控機(jī)制中，細(xì)胞因子也發(fā)揮了重要的作用。IL-10是由多種細(xì)胞（如單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞等）分泌的抗炎細(xì)胞因子，是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)因子，作為抗炎因子主要對單核/巨噬細(xì)胞發(fā)揮影響，抑制巨噬細(xì)胞的黏附、激活。隨著IL-10等抗炎細(xì)胞因子水平升高以拮抗過度產(chǎn)生的前炎癥細(xì)胞因子，而前炎癥細(xì)胞因子水平明顯降低，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下，尤其是抗感染的功能嚴(yán)重受損，成為病情進(jìn)一步惡化的主要原因。研究證實，IL-10水平升高被認(rèn)為與膿毒癥時免疫功能紊亂相關(guān)[5]。有報道顯示，應(yīng)用相應(yīng)的抗原和IL-10反復(fù)刺激可以抑制細(xì)胞因子，誘導(dǎo)特異性調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞增殖、克隆，從而發(fā)揮免疫抑制作用。

3.2 Treg細(xì)胞對膿毒癥免疫功能的影響

在動物和人類膿毒癥患者中，均被證實發(fā)生了大量CD4+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞凋亡。秦慶華[6]指出，大約1/2由于膿毒癥致死的患者表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞的凋亡增加，雖然未發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞等的數(shù)量出現(xiàn)明顯減少，但CD4+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞濃度均顯著降低。由于淋巴細(xì)胞的大量凋亡，使活化的T淋巴細(xì)胞不斷被清除，這誘導(dǎo)了T淋巴細(xì)胞的克隆無反應(yīng)性，導(dǎo)致其對抗原刺激失去反應(yīng)，無法對抗病原體的侵襲，并且分泌細(xì)胞因子的能力也明顯受到抑制。伴隨著淋巴細(xì)胞大量凋亡的還有樹突狀細(xì)胞，后者是功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，其凋亡使細(xì)胞的抗原遞呈能力明顯受損，進(jìn)而引起CD4+T淋巴激活功能障礙，進(jìn)一步加劇了機(jī)體的免疫功能異常反應(yīng)。

CD4+CD25+Treg是1995年Sakaguchi等在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其在正常人和小鼠外周血CD4+T細(xì)胞中的含量占1%～2%，主要特征性表達(dá)CD25（IL-2受體的A鏈），具有分泌IL-10與PGE2的功能，是一類重要的免疫抑制細(xì)胞，廣泛參與多種免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。近年來較多研究表明，CD4+CD25+Treg在膿毒癥復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著對細(xì)胞免疫的抑制作用，可影響機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫。盛志勇等[7]認(rèn)為，膿毒癥患者機(jī)體的免疫反應(yīng)傾向于Th2型，Th2型細(xì)胞因子生成增多而Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生減少，明顯損害了機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。Treg可以抑制CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞功能，介導(dǎo)Th1向Th2反應(yīng)漂移，調(diào)節(jié)促炎、抗炎介質(zhì)水平，下調(diào)樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)，影響免疫細(xì)胞如單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的凋亡和增殖，特別是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的凋亡[8]。研究表明，Treg細(xì)胞水平與膿毒癥的發(fā)病存在密切關(guān)系，膿毒癥發(fā)病時Treg水平明顯升高。在膿毒癥患者中，CD4+CD25+Treg升高在死亡者中多見，提示CD4+CD25+Treg在某種程度上能夠表現(xiàn)膿毒癥患者病情的嚴(yán)重程度，能夠為預(yù)測患者的預(yù)后提供依據(jù)[9]。Zhang等[10]從基因水平證實上述結(jié)論，其研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志Foxp3 mRNA明顯增多。Hein等[11]研究報道膿毒癥患者Treg水平與ASPs Ⅱ及乳酸水平存在負(fù)相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，CD4+CD25+Treg表達(dá)率：膿毒癥休克組>嚴(yán)重膿毒癥組>膿毒癥組>對照組；膿毒癥組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+明顯高于對照組，嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥休克組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+則顯著下降。相關(guān)性分析表明：膿毒癥患者CD4+CD25+Treg表達(dá)率與APACHEⅡ呈正相關(guān)，與乳酸水平呈正相關(guān)，與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)。T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+是機(jī)體的免疫功能狀態(tài)的重要指標(biāo)。Inoue等[12]研究發(fā)現(xiàn)，采用干預(yù)措施減少CD4+和CD8+的凋亡，能夠改善膿毒癥的生存率。這說明隨病情加重，膿毒癥患者Treg水平呈上升趨勢，從而加劇免疫無反應(yīng)狀態(tài)。有關(guān)Treg誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的機(jī)制，可能有以下多種不同的途徑：①IL-2是細(xì)胞增殖信號，在T淋巴細(xì)胞增殖過程中起著重要的激活作用。Treg細(xì)胞上的CD25能夠與效應(yīng)細(xì)胞競爭結(jié)合IL-2，使IL-2無法正常發(fā)揮增殖信號功能[13]。②Treg細(xì)胞能夠誘導(dǎo)IL-10水平的升高，從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。③Treg細(xì)胞能夠激活FAS和FASL，通過Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)T細(xì)胞彼此殺傷或直接凋亡。④Treg細(xì)胞經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號刺激活化后，能導(dǎo)致免疫亢進(jìn)轉(zhuǎn)向免疫抑制。隨著膿毒癥病情的加重，Treg數(shù)量增加，免疫抑制加劇，最終導(dǎo)致患者免疫麻痹，甚至死亡。已有研究表明，通過使用胸腺肽，誘導(dǎo)和促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分泌與成熟，能夠有效提高IL-2的活性及受體表達(dá)水平，從而對膿毒癥的免疫抑制產(chǎn)生刺激作用，逆轉(zhuǎn)其免疫抑制狀態(tài)，尤其是對于輕中度的免疫抑制狀態(tài)能夠通過上述治療取得良好效果，而重度免疫抑制者經(jīng)過較長時間持續(xù)治療也能夠獲益[14]。進(jìn)一步證明免疫抑制的形成與改善是影響患者預(yù)后的重要因素。

綜上所述，臨床上對膿毒癥患者檢測Treg水平能夠反映患者的細(xì)胞免疫狀態(tài)，對患者的預(yù)后有一定預(yù)測作用。但由于目前相關(guān)的臨床研究還較少，其確切的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討。由于膿毒癥患者的免疫失衡涉及各種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)，而且與神經(jīng)、內(nèi)分泌因素的調(diào)節(jié)作用存在密切關(guān)系，因此，僅分析某幾種細(xì)胞或細(xì)胞因子的相關(guān)性，不可能全面了解其根本的發(fā)病機(jī)制。隨著對Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能認(rèn)識的日益深化，對膿毒癥的臨床干預(yù)的切入點將會越來越多，從而為防治膿毒癥及其他感染性疾病提供可靠的新手段。

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（收稿日期：2014-09-30 本文編輯：程 銘）