基于NGAL的模型在肝硬化急性腎損傷早期診斷和鑒別診斷中的意義

尹偉 李成忠

在國際腹水俱樂部《肝硬化患者急性腎損傷的診斷與管理專家共識(ICA2015)》[1]發(fā)布前，一些基于AKIN及KDIGO 標(biāo)準(zhǔn)的研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者并發(fā)急性腎損傷(AKI)可以涵蓋AKI的所有類型[2,3]，以腎前性氮質(zhì)血癥(pre renal azotemia，PRA)、急性腎小管壞死(acute tubular necrosis，ATN)和肝腎綜合征(hepatorenals yndrome，HRS)最為常見，其他類型發(fā)病率則相對較低。從這一角度看，2007年乃至以前指南的HRS診斷標(biāo)準(zhǔn)缺少針對性的鑒別。所以從臨床的實(shí)際情況和肝硬化的病理基礎(chǔ)出發(fā)，本次ICA診斷標(biāo)準(zhǔn)在以提高敏感性的同時，除了用肝硬化急性腎損傷的概念來代替狹義的HRS外，還將鑒別診斷和個體化治療放到同等重要的位置上。根據(jù)新指南建議，需對AKI 2期以上或1期經(jīng)過治療腎功能無恢復(fù)、且SCr>132.6 μmol/L的患者進(jìn)行鑒別診斷。由于1型HRS和ATN短期內(nèi)進(jìn)展的速度相當(dāng)快而治療方法卻截然不同，所以指南也希望在未來的研究中通過一些新的生物學(xué)標(biāo)志物提高早期診斷及鑒別診斷的敏感性以免延誤治療。

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)是人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的新成員。1993年由Kjeldsen發(fā)現(xiàn)并命名[4]。在生理狀態(tài)下，NGAL在中性粒細(xì)胞及腎臟上皮細(xì)胞有微量表達(dá)。當(dāng)腎臟發(fā)生局部缺血或損傷時，NGAL會由腎臟大量分泌，并進(jìn)入尿液及血液中。既往的研究發(fā)現(xiàn)，腎損傷發(fā)生2 h后，血、尿NGAL濃度即可明顯升高，這一特性使得NGAL成為腎臟疾病尤其是AKI的早期標(biāo)志物[5]。

資料與方法

一、病例資料

收集2017年1月至2019年1月在海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院感染科住院的所有肝硬化(失代償期)的患者資料, 對住院期間的患者資料進(jìn)行登記，監(jiān)測住院期間的血肌酐變化，如符合肝硬化急性腎損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時進(jìn)行AKI分期。多次入院的患者僅記錄一次。

肝硬化急性腎損傷及肝腎綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考2015年國際腹水俱樂部修訂推薦的《肝硬化患者急性腎損傷的診斷和管理共識》。

急性腎小管壞死的診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考文獻(xiàn)[6]。由于肝硬化(失代償期)患者存在長期利尿、低血鈉等情況，所以濾過鈉排泄分?jǐn)?shù)，尿鈉等指標(biāo)的參考意義較差，診斷需要綜合病因及以上指標(biāo)判斷。

排除標(biāo)準(zhǔn)：肝癌或罹患其他惡性腫瘤的患者；嚴(yán)重的其他心肺系統(tǒng)疾??；既往患有不同原因慢性腎臟病的患者和結(jié)構(gòu)性腎損傷患者；沒有肝硬化基礎(chǔ)的慢加急性肝功能衰竭患者；妊娠期或哺乳期患者；慢性代謝性疾病如原發(fā)性醛固酮增多癥等患者。

二、研究方法

患者的資料采集：住院ID，年齡、性別、原發(fā)病病因、血壓(入院及并發(fā)AKI時)、肝功能指標(biāo)(TBil、Alb、ALT、AST、血清鈉)、腎功能指標(biāo)(SCr)、凝血功能(PT、INR)、醛固酮及血管緊張素Ⅱ、是否合并感染、感染類型、PCT、是否有AKI、AKI的類型。

標(biāo)本收集和保存：患者首次診斷為肝硬化急性腎損傷后，取24 h內(nèi)晨起中段尿，用無菌管收集，離心20 min(2000～3000 r/min)。收集上清-80℃凍存。

人uNGAL的檢測：試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司，Human Lipocalin-2/NGAL Quantikine ELISA Kit(R&D System,批號：20180106，20180604，20181219)，按照試劑說明書操作。

三、治療方法

一般治療：積極治療原發(fā)疾病，保肝、利尿、抗感染、抗病毒、營養(yǎng)支持等，白蛋白低于35 g/L補(bǔ)充白蛋白等。

AKI的鑒別診斷和治療：根據(jù)ICA2015診治共識的建議流程進(jìn)行，根據(jù)患者的不同情況進(jìn)行調(diào)整，對白蛋白正?；虼嬖诨顒有陨舷莱鲅幕颊卟l(fā)AKI，白蛋白的劑量酌減。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、uNGAL在肝硬化急性腎損傷患者中的表達(dá)

共納入肝硬化(失代償期)患者804例，住院期間并發(fā)AKI或入院即存在AKI的患者216例，其中資料齊全的病例127例，納入10例肝硬化失代償?shù)床l(fā)AKI的患者為對照。結(jié)果顯示，肝硬化AKI患者的uNGAL為(462.72±265.42) ng/mL；未發(fā)生AKI的患者的uNGAL為(108.40±63.07) ng/mL。兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.439,P=0.000)。

二、uNGAL在不同AKI類型患者中的表達(dá)

不同的AKI類型uNGAL的表達(dá)水平不同，PRA為(323.08±106.93)ng/mL; HRS為(486.27±164.67)ng/mL；ATN為(882.43±440.92)ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=48.774,P=0.000)；不同AKI類型uNGAL水平的組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(PRA比HRS：標(biāo)準(zhǔn)誤為38.16；PRA比ATN：標(biāo)準(zhǔn)誤為56.98；HRS比ATN：標(biāo)準(zhǔn)誤為57.09，均P<0.01)。

由于不同AKI分期的AKI類型分布不同，根據(jù)AKI分期進(jìn)行的亞組分析(表1)， AKI 1期診斷PRA 50例，HRS 14例，ATN 0例，NGAL分別為(306.79±70.88)、(331.81±67.73) ng/mL和0，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=，P=0.243)。AKI 2期診斷PRA、HRS、ATN的NGAL分別為(358.84±64.11)、(512.74±148.85)和(747.94±239.20) ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=，P<0.01)。AKI 3期診斷PRA 0例，HRS 7例，ATN 6例，NGAL分別為0、(640.10±159.70)和(1136.71±593.18) ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=，P=0.046)。未發(fā)現(xiàn)ATN患者，兩項比較尿NGAL的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；AKI 2期患者整體分析uNGAL的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但從組間比較看類似1期的結(jié)果，PRA和HRS的uNGAL差異無統(tǒng)計學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)誤：73.86，P=0.125)，而HRS、PRA和ATN比較差異有均統(tǒng)計學(xué)意義(PRA vs ATN：標(biāo)準(zhǔn)誤：84.46，P=0.000；HRS vs ATN，標(biāo)準(zhǔn)誤：57.94，P=0.000)；3期無PRA的患者，結(jié)果顯示ATN的uNGAL比HRS明顯升高，但由于3期的患者病例數(shù)較少(HRS 7例；ATN 6例)，差異的結(jié)果雖有統(tǒng)計學(xué)意義但在0.05附近(P=0.046)。綜合分析：對于AKI 2期以上的患者，uNGAL對鑒別診斷ATN和非ATN型急性腎損傷意義較大；在AKI 1期和2期，早期通過uNGAL的水平，難以鑒別HRS和PRA。

從表2的結(jié)果看醛固酮和血管緊張素Ⅱ在不同類型的AKI患者中整體表達(dá)水平不同，但組間比較提示醛固酮的水平僅對PRA鑒別ATN有意義(標(biāo)準(zhǔn)誤：35.03，P=0.001)，PRA和HRS組的差異接近0.05(標(biāo)準(zhǔn)誤：22.77，P=0.051)；血管緊張素Ⅱ水平在鑒別PRA及非PRA型AKI有意義(PRA vs HRS：標(biāo)準(zhǔn)誤17.72，P=0.002；PRA vs ATN:標(biāo)準(zhǔn)誤：27.27，P=0.000)。在HRS組和ATN組，醛固酮(標(biāo)準(zhǔn)誤：35.03，P=0.113)和血管緊張素Ⅱ(標(biāo)準(zhǔn)誤：27.27，P=0.063)的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

三、以uNGAL為基礎(chǔ)的早期鑒別診斷系統(tǒng)

將基線SCr、初次AKI分期、uNGAL、醛固酮、血管緊張素Ⅱ納入二元logistic回歸，得到鑒別ATN的預(yù)測方程，通過ROC曲線計算約登指數(shù)確定閾值。

表1 醛固酮和血管緊張素Ⅱ在不同AKI類型患者中的表達(dá)

表2 HRS和ATN的鑒別診斷的多因素分析

圖1 NGAL診斷ATN的ROC曲線

結(jié)果顯示：uNGAL是鑒別診斷ATN和HRS的獨(dú)立因素。ROC曲線分析(圖1)：uNGAL診斷ATN的ROC曲線下面積(AUC)為0.857，約登指數(shù)為522.72 ng/mL，敏感度為0.938，特異度為0.655。但此時特異度較低，如將特異度確定為0.800，則閾值為621.73 ng/mL，此時的敏感度為0.750，更符合臨床的需要。

討 論

國際腹水俱樂部對本次的指南進(jìn)行了重大更新，在擴(kuò)大概念的同時也強(qiáng)調(diào)了鑒別AKI類型的重要性，其中ATN和HRS的鑒別仍是待解決的關(guān)鍵問題之一。由于肝硬化(失代償期)患者常合并低蛋白血癥、低鈉血癥或同時使用高滲性利尿劑，ATN的診斷較為困難，所以指南中也建議通過新的生物學(xué)標(biāo)志物輔助鑒別診斷。結(jié)合國外前期的部分探索，選擇了uNGAL作為早期鑒別診斷的關(guān)鍵因子。

以往的研究中顯示，NGAL的升高和AKI及AKI進(jìn)展有關(guān)，比SCr更為敏感[7,8]。Kim等[9]證實(shí)了NGAL與sCr在診斷和分期中的敏感性，對于疑似敗血癥的重癥患者，pNGAL與序貫器官衰竭評估的腎亞組明顯相關(guān)性明顯優(yōu)于sCr。而Hekmat等[10]對單側(cè)腎臟切除的器官捐獻(xiàn)者的評估顯示，一半的患者出現(xiàn)AKI， NGAL隨著AKI的進(jìn)展而升高，其敏感性優(yōu)于胱抑素C。NGAL的表達(dá)水平與AKI的進(jìn)展相關(guān)，但作為診斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于肝硬化AKI的患者仍存在很多需要解決的問題，除了目前檢測方法還不統(tǒng)一，閾值的確定和檢測的時機(jī)是需要重點(diǎn)考慮的。

uNGAL的檢測結(jié)果顯示肝硬化AKI患者中表達(dá)水平明顯升高，相較于普通肝硬化失代償期患者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示早期檢測uNGAL對于發(fā)現(xiàn)肝硬化AKI也有診斷價值。NGAL對AKI的診斷價值在多種疾病中已被證實(shí)[11-14]，在肝硬化AKI患者中也有過早期的探索。Verna等[15]曾使用2007年ICA肝腎綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)來驗證尿NGAL的表達(dá)，結(jié)果顯示HRS患者的uNGAL水平在PRA患者和固有急性腎損傷(intrinsic acute kidney injury，iAKI)患者之間。Fagundes等[16]比較了肝硬化代償期，失代償期以及肝硬化合并腎損傷患者(包括PRA,HRS,ATN,CKD)uNGAL的水平，結(jié)果顯示，ATN患者的uNGAL表達(dá)要高于PRA、HRS和CKD的患者。Belcher等[17]在此基礎(chǔ)上應(yīng)用KIDGO標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計了一項多中心的前瞻性研究，測量了多種標(biāo)志物(NGAL,KIM-1,IL-18,L-FABP)診斷ATN和非ATN型AKI的水平，結(jié)果顯示NGAL、IL-18、KIM-1、L-FABP和白蛋白的表達(dá)在ATN和非ATN患者中均有明顯的差異。ROC曲線顯示NGAL的曲線下面積最大(AUC=0.78)。基于此項研究，ICA在發(fā)布新指南中也對建議通過新的生物學(xué)標(biāo)志物來加強(qiáng)鑒別診斷的特異性。Ariza等[18]檢測了肝硬化和慢加急性肝衰竭患者的多種標(biāo)志物(AKI診斷采用AKIN標(biāo)準(zhǔn)，HRS診斷采用ICA2007標(biāo)準(zhǔn))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PRA、1型肝腎綜合征和ATN的患者中NGAL的表達(dá)水平有差異，其他對診斷ATN有意義的標(biāo)志物有IL-18、白蛋白、TFF-3和GST-π，而KIM-1、β2微球蛋白等準(zhǔn)確性較差。

本研究根據(jù)不同的AKI類型進(jìn)行分組，uNGAL的表達(dá)水平各不相同。發(fā)現(xiàn)uNGAL隨著AKI進(jìn)展持續(xù)升高，而3期患者多入院即存在AKI，缺失了早期的觀察，因此對于AKI 2期的鑒別診斷更為重要，尤其ATN的確定是重中之重。對AKI 2期患者的分析發(fā)現(xiàn)uNGAL在PRA、HRS和ATN的表達(dá)水平各有差異，但PRA和HRS的差異不明顯。說明uNGAL對鑒別ATN和非ATN型AKI有重要的意義。本研究還設(shè)計了血管緊張素Ⅱ和醛固酮的檢測作為輔助鑒別診斷HRS的預(yù)選因素，但結(jié)果顯示醛固酮和血管緊張素Ⅱ雖然在三種AKI類型的患者存在表達(dá)差異，但進(jìn)一步分析顯示這兩種激素的水平僅對鑒別PRA和非PRA的患者有意義，其中醛固酮的意義更低。多因素分析也顯示以上兩種激素水平對鑒別HRS和ATN意義不大， uNGAL是鑒別診斷ATN的獨(dú)立因素。以約登指數(shù)確定的診斷ATN的uNGAL閾值為522.72 ng/mL，但此時敏感度較高，但特異度不足。Jaques等[19]一項前瞻性研究納入了105例肝硬化(失代償期)患者，其中55例確診AKI，分別在3個時間點(diǎn)監(jiān)測了SCr、胱抑素C，NGAL(血液和尿液)、尿鈉、腎阻力指數(shù)(RRI)。結(jié)果顯示，PRA患者顯示比較低的SCr、NGAL和RRI；ATN患者有最高水平的NGAL、尿蛋白和尿鈉，HRS位于二者之間，所有生物學(xué)標(biāo)志物均和AKI的嚴(yán)重程度平行。

綜上所述，雖然uNGAL可以早期輔助診斷肝硬化AKI，而且對ATN和非ATN型AKI有較高的鑒別診斷價值，但在臨床上仍需要綜合判斷。遺憾的是由于ATN的患者病例數(shù)較少，且集中于2、3期，在AKI 1期的鑒別診斷意義仍然需要在未來的研究中進(jìn)一步探討。