脫細胞真皮基質(zhì)對骨質(zhì)疏松大鼠骨缺損愈合影響

王曉晗，　趙志國，　王智明，　王文茉，　張力平

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 口腔頜面外科病房，遼寧 沈陽　110004

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·論著·

脫細胞真皮基質(zhì)對骨質(zhì)疏松大鼠骨缺損愈合影響

王曉晗，趙志國，王智明，王文茉，張力平

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 口腔頜面外科病房，遼寧 沈陽110004

摘要：目的觀察脫細胞真皮基質(zhì)(ADM)在骨質(zhì)疏松大鼠顱頂骨缺損修復(fù)中引導(dǎo)骨組織(GBR)再生的特點和能力，探討其生物相容性和對骨組織再生的作用。方法將26只SD雌性大鼠隨機分假手術(shù)組(Sham組)、去卵巢手術(shù)組(OVX組)，每組13只。手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)3個月，造模成功后，在大鼠的顱骨上，中線兩側(cè)制備2個約5 mm大小的洞型缺損，一側(cè)由脫細胞真皮基質(zhì)覆蓋，另一側(cè)為空白對照。Sham組中，空白對照一側(cè)為A組，脫細胞真皮基質(zhì)覆蓋一側(cè)為B組；OVX組中，空白對照一側(cè)為C組，脫細胞真皮基質(zhì)覆蓋一側(cè)為D組。術(shù)后6、12周，觀察骨缺損愈合情況，骨組織HE、Masson三色染色，比較各組新骨長度、礦化率，免疫組化法檢測不同時期骨痂骨鈣素的表達。結(jié)果2只大鼠因腹腔內(nèi)腸脹氣死亡；其他動物于1周左右愈合，無感染及傷口裂開，可見縫合線未脫落。骨缺損建立后6周A、C組缺損未見明顯縮小，缺損區(qū)由透明組織覆蓋，缺損邊緣明確，肉眼無明顯區(qū)別；B、D組ADM膜已被纖維結(jié)締組織包裹，缺損稍縮小，肉眼無明顯區(qū)別。骨缺損建立后12周，A、C組肉眼無明顯差別，缺損區(qū)由透明組織覆蓋，缺損略有縮??；B組ADM膜變薄，觸之較硬；D組ADM膜亦變薄，觸之較軟，缺損邊緣較圓鈍。組織形態(tài)學(xué)觀察6周時A、C組新生骨痂較少，缺損斷端被纖維組織包裹；B、D組ADM膜結(jié)構(gòu)保留，成骨細胞和成纖維細胞長入ADM膜；C、D組骨缺損斷端成骨密度較A、B組小。12周時A、C組新生骨痂較6周時稍多，但缺損仍未愈合；B組 ADM被成骨細胞改建為骨結(jié)構(gòu)，覆蓋于骨缺損上，但未與缺損斷端相連，膠原支架結(jié)構(gòu)部分降解；D組骨缺損未愈合，缺損斷端骨生成量較6周時多，ADM膜結(jié)構(gòu)仍在，未被成骨細胞改建。6、12周時，B、D組成骨情況均優(yōu)于A、C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；6周時B組與D組成骨情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；12周時B組成骨情況優(yōu)于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。6、12周時,新骨成熟度A組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；C組與D組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B組和D組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。B、D組6、12周新骨成熟度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論ADM能引導(dǎo)骨組織再生，形成機械屏障纖維組織的長入，并提供三維支架結(jié)構(gòu)，效果明顯。骨質(zhì)疏松時應(yīng)用GBR技術(shù)結(jié)合其他骨組織工程技術(shù)或適當(dāng)藥物治療可加速骨缺損的愈合，縮短愈合時間。

關(guān)鍵詞：脫細胞真皮基質(zhì)；骨質(zhì)疏松；骨缺損；骨再生

DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2016.02.02

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的一種，是由于激素水平的下降骨微結(jié)構(gòu)改變，骨量丟失，并且導(dǎo)致骨脆性增加而易發(fā)骨折的一種骨代謝疾病[1]。在生理情況下，骨代謝的平衡主要依靠破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成來維持[2]。而骨質(zhì)疏松時，由于破骨細胞活動的相對增強，平衡被打破，而出現(xiàn)了骨愈合遲緩。骨缺損的修復(fù)方法包括自體骨或異種骨移植和骨組織工程技術(shù)。由于自體骨移植時，會對自身供區(qū)造成更多傷害，并可能引發(fā)出血感染等并發(fā)癥；異種骨移植還會引發(fā)免疫排斥等反應(yīng)，目前應(yīng)用較少[3]。Buser等[4]提出類似引導(dǎo)組織再生術(shù)(guied tissue regeneration，GTR)也可應(yīng)用于引導(dǎo)骨組織(guide bone regeneration，GBR)的再生，是一種有效的方法能夠促進骨缺損的愈合，保存或增加骨量。GBR膜是利用物理屏障作用，將骨缺損區(qū)與周圍組織隔離，阻止成纖維細胞長入骨缺損，并能夠誘導(dǎo)成骨細胞聚集分化，使成骨細胞有足夠的空間遷移生長，達到促進骨缺損愈合的目的[5]。應(yīng)用于GBR的屏障膜主要分為兩種：可吸收膜和不可吸收膜。脫細胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix,ADM)是GBR膜的一種。

本研究應(yīng)用去卵巢手術(shù)法模擬女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，對骨質(zhì)疏松大鼠的骨缺損應(yīng)用ADM膜修復(fù)，觀察其成骨效果及誘導(dǎo)成骨的能力，探討ADM在骨質(zhì)疏松骨缺損治療中的影響。

1材料與方法

1.1材料與試劑3個月雌性大鼠26只，體質(zhì)量(200±10)g，SPF級。由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。大鼠均飼養(yǎng)于金屬籠內(nèi)，5只/籠，自由飲食飲水，環(huán)境溫度為(24±2)℃，濕度40%～60%，12h交替光照，定期通風(fēng)消毒。實驗過程中對動物的處置參照國家科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。海奧膠原膜(煙臺正海生物技術(shù)有限公司)；Masson三色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；骨鈣素免疫組化試劑盒(艾博抗上海貿(mào)易有限公司)；二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)圖像采集軟件：NIS-Elements F 3.0；圖像分析軟件：NIS-Elements Br 3.0。

1.2研究方法

1.2.1實驗動物分組將26只大鼠隨機分假手術(shù)組(Sham組)、去卵巢手術(shù)組(OVX組)。造模成功后，在大鼠的顱骨上，中線兩側(cè)制備2個約5 mm大小的洞型缺損，一側(cè)由ADM膜覆蓋，另一側(cè)為空白對照。Sham組中，空白對照一側(cè)為A組，脫細胞真皮基質(zhì)覆蓋一側(cè)為B組；OVX組中，空白對照一側(cè)為C組，脫細胞真皮基質(zhì)覆蓋一側(cè)為D組。

1.2.2模型建立根據(jù)大鼠體質(zhì)量腹腔注射10%的水合氯醛溶液(0.3 ml/100 g)麻醉約5 min，俯臥位固定于實驗臺上。打開腹腔，切口約1 cm，小號止血鉗在子宮末端與卵巢之間的最細處夾閉，0號手術(shù)線結(jié)扎后用眼科剪將卵巢全部切除，松開止血鉗，將子宮輕輕放回入腹，分層縫合切口，同樣方法切除對側(cè)卵巢。見圖1。術(shù)后給予肌肉注青霉素3 d，復(fù)蘇后飼養(yǎng)于原環(huán)境。常規(guī)飼養(yǎng)3個月，OVX組即達到骨質(zhì)疏松標準[6]。Sham組方法同OVX組，但不切除卵巢，只切除等體積大小的脂肪組織。

圖1　切除的大鼠卵巢

1.2.3骨缺損的建立根據(jù)大鼠體質(zhì)量腹腔注射10%的水合氯醛溶液(0.3 ml/100 g)麻醉。將大鼠俯臥位固定于實驗臺上，在顱骨正中取一長約2 cm切口，分離筋膜，暴露骨皮質(zhì)。在正中線的兩側(cè)，用骨鉆在生理鹽水冷卻下分別制成兩個直徑約5 mm的洞型骨缺損。左側(cè)骨缺損完全覆蓋ADM膜，且超過缺損2～3 mm，右側(cè)為空白對照。見圖2。術(shù)后肌肉注射慶大霉素3 d，8萬U/d，分籠飼養(yǎng)，觀察動物活動及進食情況。

圖2　骨缺損模型的建立

1.2.4HE染色骨缺損的建立后6、12周每組分別隨機處死3只大鼠，分離出顱頂骨，置于4%多聚甲醛溶液，4℃固定12～48 h。按中線分離顱頂骨左右兩側(cè)，經(jīng)EDTA脫鈣后，制備5 μm石蠟切片，行HE染色。HE染色鏡下觀察新生骨質(zhì)的長度，按照編號順序每隔10張切片選取一張進行計算，每個標本共選取6張切片，測量新生骨質(zhì)的長度。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對新骨長度進行計量分析。

成骨長度比=新生骨長度/骨缺損長度×100%

1.2.5Masson染色Masson三色染色與HE染色切片脫蠟處理至脫水方法相同，Masson復(fù)合染色劑染色，95%乙醇、100%乙醇脫水，透明，固封。Masson三色染色能夠反映骨質(zhì)成熟程度，新生骨呈藍色，成熟為紅色。逐漸成熟的骨質(zhì)為紅藍相間，即骨質(zhì)越成熟，紅染區(qū)域越大。每個樣本隨機選取切片3張，每張切片隨機選取3個(×200)視野，采用Imagepro plus 4.5軟件對新骨進行半定量分析。

1.2.6免疫組化染色5μm石蠟切片，脫蠟至水同HE染色,3% H2O2去離子水室溫孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加血清封閉，室溫孵育30 min，傾去，滴加一抗，4℃過夜；滴加酶標抗兔聚合物，室溫20 min；滴加聚合物增強劑，室溫15 min；DAB顯色劑顯色1 min，自來水充分沖洗。各步驟之間用PBS緩沖液5 min×3次沖洗。蘇木素復(fù)染2 min，流水沖洗40 min。脫水，透明，封片。

2結(jié)果

2.1各組大鼠骨缺損愈合情況所有實驗動物局部均未發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)，軟組織愈合未見異常，縫合線未見脫落。術(shù)后6周：各組大鼠顱頂骨缺損均未愈合，A、C組缺損未見明顯縮小，缺損上方有透明軟組織覆蓋；B、D組缺損稍縮小，邊緣有菲薄骨質(zhì)形成，ADM膜仍在，較剛植入時薄，質(zhì)軟。術(shù)后12周：A、C組缺損未愈合，缺損稍縮小，缺損邊緣變圓鈍，上方由透明組織覆蓋。B組可見骨樣組織于缺損內(nèi)，觸之稍硬，ADM膜更??；D組缺損未愈合，但缺損明顯縮小，上方覆蓋的ADM膜較第6周更薄，接近透明。

2.2HE染色第6周A組可見缺損區(qū)被纖維組織占據(jù)，缺損邊緣可見少量與成熟骨質(zhì)不同的類骨質(zhì)形成，內(nèi)外骨膜無增厚，新骨中可見散狀骨細胞，成骨不活躍，只有少量成骨細胞圍繞骨膜與斷端周圍，但骨密度較高，無明顯的骨髓腔結(jié)構(gòu)。缺損中心未見大量疏松的纖維結(jié)締組織和小血管生成。C組與A組類似，但新骨密度較A組小，中央可見散在的小血管。見圖3。B組可見骨缺損斷端有骨基質(zhì)生成，骨細胞位于骨基質(zhì)內(nèi)，大量成骨細胞包繞新生骨質(zhì)，ADM為膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有成骨細胞和成纖維細胞長入，ADM膜內(nèi)可見大量血細胞，未見板層骨形成。D組可見骨缺損斷端有骨基質(zhì)生成，可見到骨內(nèi)膜增厚，骨細胞排列在新骨周圍，ADM膜結(jié)貼新生骨面，有大量細胞長入，其中可見散在的血管，ADM膜已被血管化。見圖4。第12周A組骨斷端仍被纖維組織包繞，只有少量成骨細胞排列在新骨表面，成骨長度與6周時差異不明顯，骨密度較高。C組可見骨內(nèi)外膜均增厚，但成骨長度并不明顯，只有少量成骨細胞排列在新骨表面，斷端被纖維組織包裹。見圖5。B組可見缺損被新骨覆蓋，新生骨與骨缺損斷端未融合，成骨細胞圍繞新骨排列，新骨內(nèi)可見降解的ADM膜膠原成分，部分新骨已開始礦化，新骨內(nèi)可見小血管；ADM膜開始降解，但仍可見膠原排列。D組可見缺損未完全被新骨充填，斷端可見新骨形成，部分新骨開始礦化，缺損中間可見大量成骨細胞和破骨細胞以及小骨島，ADM膜降解變薄，但仍可見到膠原纖維，ADM未被成骨細胞改建為骨結(jié)構(gòu)，降解較B組多，膠原纖維變纖細。6、12周時，B、D組成骨情況均優(yōu)于A、C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明ADM膜能起到明顯的引導(dǎo)骨再生的作用；6周時B組與D組成骨情況比較(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；12周時B組成骨情況優(yōu)于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6，表1。

圖3　鏡下觀察大鼠顱頂骨HE染色結(jié)果

2.3Masson染色原骨組織，新生骨組織和纖維結(jié)締組織的顏色，形態(tài)均清晰可辨。新骨為藍色，范圍與HE染色新骨形成的區(qū)域相一致，且隨時間增加骨基質(zhì)開始礦化，紅染區(qū)域開始增多。6、12周時A組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明應(yīng)用ADM膜能夠加速新骨礦化。6、12周時，C組與D組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明ADM膜對于加速骨質(zhì)疏松的新骨礦化作用并不明顯。6、12周時，B組與D組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明骨質(zhì)疏松能夠阻礙新骨的礦化，延緩骨愈合。B、D組6、12周骨愈合情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明隨著時間的增長，新骨逐漸開始礦化，趨于成熟。見圖7、表2。

圖4　鏡下觀察大鼠顱頂骨HE染色結(jié)果

圖5　鏡下觀察大鼠顱頂骨HE染色結(jié)果

圖6　鏡下觀察大鼠顱頂骨HE染色結(jié)果

組別6周12周A組12.93±1.7817.78±3.77B組39.70±4.8386.51±6.58C組14.45±1.7514.74±1.44D組47.62±5.8361.83±6.89

圖7鏡下觀察大鼠顱頂骨Masson染色結(jié)果(a.A組6周；b.B組6周；c.C組6周；d.D組6周；e.A組12周；f.B組12周；g.C組12周；h.D組12周)

表2　各組大鼠骨缺損建立6、12周新骨成熟度

2.4免疫組化染色A、B組中骨缺損斷端成骨細胞最多，成骨最活躍，分泌骨鈣素最多；C、D組破骨細胞數(shù)量較多，骨鈣素分泌較A、B組較少，這與其他結(jié)果相一致。圖8鏡下觀察大鼠顱頂骨免疫組化染色結(jié)果(a.A組6周；b.C組6周；c.B組6周；d.D組6周；e.A組12周；f.C組12周；g.B組12周；h.D組12周；)

3討論

GBR屏障膜中不可吸收膜分為聚四氟乙烯膜和鈦膜，骨缺損再生的效果較理想，但不能降解，需要二次手術(shù)取出。可吸收膜分為帶蒂筋膜、可吸收膠原膜、異種可吸收膜及合成膜。在兔的極限骨缺損的修復(fù)中應(yīng)用帶蒂筋膜，其穩(wěn)定性提高后，能夠很好的維持膜下空間和植骨區(qū)，有利于超臨界骨缺損的修復(fù)[7]，但來源較少，臨床應(yīng)用較少?？晌漳z原膜生物相容性好，傷口顯露率較不可吸收膜低，成功率高，其缺點是機械強度低，有時會向骨缺損方向塌陷，影響骨再生效果。異種可吸收膜臨床上常應(yīng)用于燒傷，乳房重建，修復(fù)和再生牙周組織等，很少涉及引導(dǎo)骨組織再生。合成膜包括殼聚糖膜，是目前發(fā)現(xiàn)唯一帶正電荷的天然堿多糖，生物相容性好，廣泛存在于甲殼動物的甲殼中[8]。臨床上應(yīng)用于透析膜，促進傷口愈合，血液抗凝劑等。殼聚糖還能抑制牙齦卟啉單胞菌的活性，效果隨濃度的增加而增加[9]。有研究將氧化鋅與電紡絲膜結(jié)合，觀察其對細胞生物活性的影響，發(fā)現(xiàn)其可以促進牙周細胞的增殖、分化以及牙周組織再生[10]。

由于牙周炎，根尖病變，腫瘤手術(shù)等原因造成的頜骨缺損一直是口腔科的常見疾病，發(fā)生于中老年人群的頜骨缺損再又常伴隨著骨質(zhì)疏松，這種情況延緩了骨缺損愈合的時間和效果。去勢造模法是通過動物的雙側(cè)卵巢造成雌激素缺乏，模擬臨床上絕經(jīng)期后婦女的骨質(zhì)疏松，兩者的共同點都與雌激素水平的下降有直接關(guān)系。雌激素可以通過調(diào)節(jié)受體機制來抑制破骨細胞的活性，誘導(dǎo)破骨細胞凋亡，因此雌激素的降低導(dǎo)致破骨細胞數(shù)目增多，功能活性加強，骨缺損愈合速度減慢。去勢法處理因素單一，成模效果確定，可較快的復(fù)制出骨質(zhì)疏松模型。

顱骨缺損模型與頜面部相似：(1)從組織胚胎學(xué)角度來看，顱骨都以膜內(nèi)成骨的方式成骨，膜內(nèi)成骨是由間葉組織和骨母細胞等分化而成的成骨細胞形成編織骨的成骨過程。成骨初期，內(nèi)外骨膜不斷增生，鈣化成骨分別形成內(nèi)骨痂和外骨痂，隨時間延長骨痂礦化，逐漸成熟。(2)從解剖學(xué)上來說，顱骨與頜面部骨骼都是由內(nèi)外兩層骨皮質(zhì)包繞內(nèi)部的骨松質(zhì)組成。因此，可以由顱骨代替頜骨進行研究[11]。去勢后大鼠顱骨的骨密度和骨量也有明顯的下降，可應(yīng)用去勢后大鼠顱骨進行骨質(zhì)疏松骨相關(guān)的研究。以往研究中發(fā)現(xiàn)，骨缺損的大小也影響骨缺損的愈合，因此臨界骨缺損，即在大鼠生命周期不給予治療且不能痊愈的最小骨缺損直徑，有研究發(fā)現(xiàn)，全厚5 mm顱蓋骨缺損為大鼠的骨缺損臨界標準。近年來，有學(xué)者應(yīng)用大鼠顱骨直徑4 mm全厚骨缺損作為生物材料對骨缺損愈合影響進行研究，也達到了預(yù)期效果[12]。本研究取5 mm全厚骨缺損，12周時，發(fā)現(xiàn)A、C組均未愈合且成骨量遠低于B、D組；B組新骨覆蓋骨缺損之上，但未完全改建和礦化成熟；D組缺損未完全愈合。這說明5 mm全厚骨缺損可以達到實驗比較的目的。

成骨細胞的成骨過程主要分為4個階段：成骨細胞的增殖，骨基質(zhì)的成熟，骨基質(zhì)的礦化，成骨細胞凋亡。成骨細胞是骨形成及骨重建及修復(fù)中的主要功能細胞，負責(zé)骨基質(zhì)的合成分泌和礦化。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松時，成骨細胞加速增殖，但同時成骨細胞的增殖周期也相對延長，成骨細胞數(shù)量相對減少，骨形成慢于骨吸收，因此絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松也成為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松[13]。雌激素缺乏時破骨細胞內(nèi)的硫醇氧化劑的濃度降低，增強破骨細胞對破骨細胞基因信號的敏感性，從而使活性氧介導(dǎo)的細胞因子過度分泌，增加了破骨細胞的活性，骨吸收水平快于骨形成，骨轉(zhuǎn)換能力增強，骨缺損的愈合時間延長，新生骨痂減少且強度較差[14]。Arslan等[15]研究表明，骨質(zhì)疏松可抑制膜內(nèi)成骨去骨基質(zhì)的礦化，并阻礙骨痂的成熟。本研究發(fā)現(xiàn)，在成骨6周時，B、D組成骨長度，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可能在成骨早期，雖然骨質(zhì)疏松對成骨速度造成一定影響，在破骨細胞活性增強的同時，成骨細胞成骨能力也加強，且ADM膜起到屏障的作用，阻止纖維組織長入骨缺損斷端。但B組新骨成熟度明顯高于D組，說明成骨早期ADM膜雖能促進成骨長度，但并不能影響新骨的成熟度，新骨的礦化程度仍然低于正常情況，導(dǎo)致了骨缺損愈合延緩。

GBR技術(shù)中對引導(dǎo)膜的要求主要包括：(1)良好的生物相容性，無排斥反應(yīng)；(2)可在體內(nèi)降解，且降解速度與組織愈合時間平衡，降解產(chǎn)物無不良反應(yīng)或有利于傷口愈合；(3)良好的選擇性細胞屏障功能；(4)具有良好的物理性，便于操作，且有一定的機械強度，能形成三維結(jié)構(gòu)和支持再生空間[16]。本研究中應(yīng)用的ADM膜來源為牛皮，經(jīng)處理脫去了真皮和表皮中的細胞成分，保留了真皮中不溶性基質(zhì)而成的材料，具有低免疫原性。ADM為三維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)，主要成分為Ⅰ型膠原，Ⅲ型膠原只有原來真皮層的一半，Ⅳ型和Ⅶ性膠原幾乎消失[17]。膠原成分可以促進止血，刺激血小板附集，支架結(jié)構(gòu)可以使成骨細胞附著在表面，并促進新血管的形成，增加成纖維細胞的趨化性。Ⅰ型膠原能夠能夠促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞，并且促進成骨細胞的成骨活動，增加成骨細胞分泌骨基質(zhì)的能力[18]。本研究中6、12周時，ADM膜均體現(xiàn)出了良好的屏障作用，阻止了纖維結(jié)締組織長入骨缺損，并給新骨的形成提供了一定的生長空間，6周時開始有成骨細胞和成纖維細胞長入ADM膜，并開始血管化，12周時ADM膜依然沒有完全降解，但B組ADM膜起到了良好的三維支架結(jié)構(gòu)，供成骨細胞長入、定植、增殖、成骨，新骨覆蓋了幾乎全部骨缺損，加速了成骨過程；D組 ADM膜組成骨細胞沒有利用到其三維支架結(jié)構(gòu)成骨，只是在缺損端逐漸向中心成骨，可能在骨質(zhì)疏松的骨愈合過程中，成骨細胞的形態(tài)發(fā)生了成纖維細胞變，并開始形成表達非特異性的Ⅲ型膠原，呈現(xiàn)出了成纖維細胞的表型[19]。一方面成骨細胞活性下降，分泌骨基質(zhì)功能下降；另一方面ADM膜降解加速，不能夠起到三維支架的結(jié)構(gòu)，而骨缺損未達到愈合。

骨鈣素是由成熟的成骨細胞合成和分泌的一種特異的非膠原骨基質(zhì)蛋白，是骨形成和骨轉(zhuǎn)換的標志性物質(zhì)，成熟的骨鈣素分泌出成骨細胞后，大部分沉積在骨基質(zhì)當(dāng)中，占骨基質(zhì)非膠原蛋白質(zhì)成分的25%，小部分進入血循環(huán)，血清骨鈣素能夠反映骨密度的情況[20]。有研究表明，骨鈣素是骨形成的決定性因素[21]。骨質(zhì)疏松時，成骨細胞合成骨鈣素的能力下降，且骨轉(zhuǎn)換加強，能與羥基磷灰石結(jié)合的骨鈣素減少，骨痂礦化速率減慢。在本研究中，免疫組化可以觀察到，C、D組成骨細胞明顯較A、B組少，且新骨與骨鈣素結(jié)合較少，影響骨痂的成熟。本研究只設(shè)計6周和12周兩個觀察點，并不能明確觀察到骨愈合和礦化的晚期過程及愈合的確切時間，結(jié)果具有局限性。應(yīng)至少設(shè)計到24周，并增加新骨的應(yīng)力測試等測量骨痂的硬度，更全面的了解ADM膜對骨質(zhì)疏松骨缺損的影響，以指導(dǎo)臨床的應(yīng)用。

ADM膜具有明確的引導(dǎo)骨再生的作用，但骨質(zhì)疏松時，雖成骨較不覆蓋膜時增快，但新骨長度和成熟度均未達到正常水平。在臨床應(yīng)用中，需聯(lián)合應(yīng)用骨組織工程其他方法或藥物治療方法對骨缺損進行修復(fù)，使骨質(zhì)疏松骨缺損在較短時間內(nèi)愈合。

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Effect of acellular dermal matrix on osteoporosis rats bone defect healing

WANG Xiao-han,ZHAO Zhi-guo,WANG Zhi-ming,WANG Wen-mo,ZHANG Li-ping

(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Abstract：ObjectiveTo observe the characteristics and capabilities of acellular dermal matrix(ADM)in osteoporosis rats cranial parietal bone defect repair guided bone regeneration(GBR),to explore the biocompatibility and effects on bone regeneration.MethodsA total of 26 SD female rats were randomly divided into the control group(Sham group:n=13)and the ovariectomized group(VOX group:n=13).Conventional breeding for 3 months after the surgery,after the success of the building,in skull of rats,there were 2 defective holes with 5 mm preparation on both sides of central line,one side was covered with ADM,the other side was control blank(CK).In Sham group,the CK side was Group A,the ADM cover side was Group B.In the CK side in OVX group was Group C,the ADM cover side was Group D.In 6 and 12 weeks postoperatively,the clinical features such as the bone defect healing,bone tissue HE and masson trichromatic dyeing,new bone lengths were compared,the mineralization rate,immunohistochemical method was to detect callus osteocalcin expression in different periods.ResultsAmong the gross observation experimental animals,there were 2 deaths caused by bowel bilges gas in.Other animals healed within a week without infection and wound dehiscence,visible sutures were not fallen off.6 weeks after surgery,the blank defects naked eye obvious difference between the two groups,the defect area was covered with transparency,defect edge was clear.ADM cover side was with visible white ADM,defect edge was clear.After 12 weeks,there was no naked eye obvious difference between two groups of blank defect,the defect area was covered with transparency,defect edge was clear.ADM cover side with visible white ADM film was thinner,harder to hit,defect edge was obtuse.The tissue morphology observation 6 weeks when two groups of new bone gap defect was not obvious,the broken end by fibrous tissue package.Sham group of bone defect end osteogenesis was dense,ADM retained membrane structure,osteoblast and fibroblast caused ADM membrane,ADM were rebuilt gradually.VOX group of bone defect end osteogenesis density was small,in the Sham group still in ADM membrane structure,osteoblast and fibroblast caused ADM membrane,ADM membrane was rebuilt.At the 12th week,two groups of blank new bone defect was a little more than 6 weeks,but still not healed.Sham group of ADM was converted into bone structure,osteoblast bracket structure degradation,covered on the bone defect,not connected to the end.VOX group of bone defect healing,bone defect broken end generation was more than four weeks,ADM was still in the structure,degradation became thinner,not converted into bone osteoblasts structure.Conclusionby experiment,ADM can be guided bone tissue regeneration,to be implanted in rats after skull surface,without rejection,can form the organization of fibrous tissue ingrowth,mechanical barrier and provide three framework for osteoblasts osteogenesis,absorption rate is moderate,12 weeks when not fully biodegradable.Normal condition ADM membrane can be osteoblast reconstruction,can be closed early bone defect,and osteoporosis due to osteoblast activity decline,ADM film has not been converted bone,mechanical barrier effect,only far slower and normal.Therefore,osteoporosis GBR technique should be combined with tissue engineering technology or other drug therapy to accelerate the healing of bone defect to shorten the healing time.

Key words:Acelullar dermal matrix;Osteoporosis;Bone defect;Bone regeneration

收稿日期：2016-03-24

文章編號：2095-5561(2016)02-0069-07

中圖分類號：R681

文獻標志碼：A

通信作者：張力平，E-mail：228830225@qq.com

基金項目：遼寧省科技攻關(guān)課題(2011225020)

第一作者：王曉晗(1990-)，女，遼寧遼陽人，醫(yī)師，碩士