酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子保護(hù)慶大霉素對(duì)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用的分裂原活化蛋白激酶通路機(jī)制①

沈　麗，黃巨恩，黃太萍，沈　慧，李校堃

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酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子保護(hù)慶大霉素對(duì)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用的分裂原活化蛋白激酶通路機(jī)制①

沈麗1，黃巨恩1，黃太萍1，沈慧1，李校堃2

[摘要]目的探討酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)對(duì)慶大霉素?fù)p傷的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)作用可能的機(jī)制。方法新生24 h Sprague-Dawley大鼠分離、純化海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光染色鑒定，傳3代細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)3 d，分為3組：對(duì)照組正常培養(yǎng)，損傷組以2.0 g/L慶大霉素培養(yǎng)24 h，保護(hù)組加入4.25 μg/L aFGF培養(yǎng)24 h后再加入2.0 g/L慶大霉素培養(yǎng)24 h。Western blotting檢測(cè)P38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1、ERK2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)1、JNK2的表達(dá)。結(jié)果成功培養(yǎng)細(xì)胞，純度>95％。與對(duì)照組比較，損傷組ERK1表達(dá)增加(P<0.05)；保護(hù)組與損傷組比較，P38表達(dá)增加(P<0.05)，ERK1表達(dá)減少(P<0.05)；其余兩兩比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論信號(hào)通路中的P38和ERK1可能在aFGF對(duì)抗慶大霉素誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷過(guò)程中發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞]酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；分裂原活化蛋白激酶；慶大霉素；星形膠質(zhì)細(xì)胞；海馬；大鼠

[本文著錄格式]沈麗，黃巨恩，黃太萍，等.酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子保護(hù)慶大霉素對(duì)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用的分裂原活化蛋白激酶通路機(jī)制[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2016,22(3):270-273.

CITED AS:Shen L,Huang JE,Huang TP,et al.Effects of acidic fibroblast growth factor on hippocampal astrocytes injury induced by gentamicin:role of mitogen-activated protein kinase signal pathway[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(3):270-273.

作者單位：1.廣西醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，廣西南寧市530021；2.溫州醫(yī)學(xué)院生物與天然藥物研究院，浙江溫州市325027。作者簡(jiǎn)介：沈麗(1987-)，女，漢族，湖北十堰市人，碩士研究生，護(hù)師，主要研究方向：創(chuàng)傷護(hù)理。通訊作者：黃巨恩，男，廣西南寧市人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：創(chuàng)傷護(hù)理。E-mail:hje5810@163.com。

酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)是一種具有多方面功能的活性蛋白，多存在于腎臟和腦組織中，是血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角膜細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞等生長(zhǎng)的刺激因子，對(duì)來(lái)源于中胚層和神經(jīng)外胚層的細(xì)胞具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[1]。

慶大霉素屬于氨基糖苷類(lèi)抗生素，能損害神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟；神經(jīng)元損傷前會(huì)使星形膠質(zhì)細(xì)胞受損[2-3]。本研究建立海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型，在之前研究的基礎(chǔ)上[4-6]，檢測(cè)分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路中的P38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1、ERK2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)1、JNK2的表達(dá)情況，研究MAPK信號(hào)通路在aFGF對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)作用過(guò)程中的機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料

新生24 h內(nèi)Sprague-Dawley大鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(桂)2012-0002。DMEM-HG、胎牛血清由維森特公司提供。胰蛋白酶由美國(guó)GIBCO公司提供?？鼓z質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體由ABCAM公司提供。抗兔二抗由中杉金橋公司提供。硫酸慶大霉素由廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司提供。aFGF由暨南大學(xué)生物工程研究所提供，批號(hào)20130401。磷酸酶抑制劑、BCA法蛋白含量檢測(cè)試劑盒由南京凱基生物發(fā)展有限公司提供。蛋白預(yù)染Marker由美國(guó)THERMO公司提供。RIPA裂解液、一抗稀釋液由碧云天公司提供。HRP標(biāo)記的GAPDH優(yōu)質(zhì)內(nèi)參(1∶10000)由上?？党缮锾峁?。顯影粉由天津市世紀(jì)奧博商貿(mào)有限公司提供。

酶標(biāo)儀為賽默飛世爾(上海)儀器有限公司產(chǎn)品。電泳儀為北京百晶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。高速離心機(jī)為珠江黑馬公司產(chǎn)品。超聲儀細(xì)胞破碎儀為寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。暗室燈、暗匣為廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

采用黃太萍等星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法[7]。新生大鼠分離出海馬組織，剔除腦膜、血管，將海馬組織剪成小塊，轉(zhuǎn)入離心管中，加入37℃復(fù)溫30 min，終濃度為0.125％的胰蛋白酶，恒溫水浴15 min消化，含10％胎牛血清DMEM-HG培養(yǎng)液終止。1000 r/min離心5 min，棄上清。5×105/ml接種于含10％胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)液中。37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～9 d；待細(xì)胞70％～80％匯合時(shí)傳代純化，傳至第3代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

將傳3代的細(xì)胞接種在6孔板內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中24 h貼壁后，以4％多聚甲醛固定，PBS漂洗。加入1 ∶200兔抗GFAP多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，加入二抗，PBS洗3遍(按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)。加入DAPI染核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片后，共聚焦顯微鏡下觀察顯色結(jié)果，陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)呈綠色熒光。取5個(gè)不同的視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟相同。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)

將傳3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)3 d，分為對(duì)照組、損傷組和保護(hù)組。對(duì)照組正常培養(yǎng)；損傷組加入2.0 g/L慶大霉素培養(yǎng)24 h；保護(hù)組加入4.25 μg/L aFGF培養(yǎng)24 h后，再加入2.0 g/L慶大霉素培養(yǎng)24 h。

常規(guī)提取細(xì)胞蛋白。分別收集各組細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，去上清，向細(xì)胞沉淀中加入RIPA裂解液，4℃裂解；1000 r/min離心5 min，取上清液至新離心管中。BCA法測(cè)定蛋白濃度。80 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)至分離膠，120 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)剛出膠底部，4℃轉(zhuǎn)膜2 h，封閉2 h，加入兔抗大鼠P38、ERK1、ERK2、JNK1、JNK2一抗(1∶1000)，二抗(羊抗兔IgG，1∶20000)，37℃孵育，ECL染色，壓片曝光顯影，定影。采用Lab Works 4.6圖像分析軟件采集圖像，以HRP標(biāo)記的GAPDH為內(nèi)參，Quantity One記算各組目的蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度比值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK q檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2結(jié)果

2.1鑒定

培養(yǎng)24 h后可觀察到大部分細(xì)胞貼壁且折光性較好，部分細(xì)胞伸展并長(zhǎng)出細(xì)小突起。培養(yǎng)3～5 d后細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞胞體變大，分支增多且突起相互交織成網(wǎng)狀。培養(yǎng)7～10 d后細(xì)胞基本匯合并鋪滿(mǎn)瓶底。進(jìn)行傳代純化得到第3代細(xì)胞。GFAP免疫熒光染色可見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)呈綠色熒光，陽(yáng)性細(xì)胞比例>95％，可用于下一步實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 Western blotting檢測(cè)

對(duì)照組較損傷組ERK1表達(dá)增加(P<0.05)，保護(hù)組較損傷組P38表達(dá)增加、ERK1表達(dá)減少(P<0.05)。其余蛋白兩兩比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　Western blotting檢測(cè)各組蛋白的表達(dá)(相對(duì)灰度)

3討論

大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)受很多因素的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)之前的方法[8-11]培養(yǎng)的細(xì)胞質(zhì)量不高，采用黃太萍等[7]胰蛋白酶消化組織塊分離培養(yǎng)法獲得純度高、生長(zhǎng)狀態(tài)好且成本較低的星形膠質(zhì)細(xì)胞。我們既往的研究[4-6]證明，4.25 μg/L aFGF能保護(hù)慶大霉素誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞操作，因此本實(shí)驗(yàn)亦采用4.25 μg/L aFGF。

星形膠質(zhì)細(xì)胞廣泛存在于哺乳動(dòng)物腦內(nèi)，能調(diào)節(jié)神經(jīng)元代謝，參與腦損傷后的修復(fù)過(guò)程以及記憶的形成過(guò)程，具有營(yíng)養(yǎng)、支持神經(jīng)元的功能，在脊髓損傷早期起修復(fù)作用，晚期對(duì)損傷修復(fù)有抑制作用[12-16]。星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的相互作用對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、可塑性以及神經(jīng)信息傳遞、誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化有較大影響[17-19]。

aFGF是強(qiáng)促有絲分裂原，具有促有絲分裂和非促有絲分裂兩大類(lèi)型生物學(xué)活性，不僅可促進(jìn)組織細(xì)胞分裂、增殖，還能促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)，舒張血管，保護(hù)神經(jīng)、心肌、局部缺血等[20-24]。

MAPK是一組能被不同的細(xì)胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。哺乳動(dòng)物細(xì)胞MAPK通路主要包括P38 MAPK通路、ERK通路和JNK通路[25]。ERK蛋白條帶分為ERK1和ERK2兩個(gè)亞帶，JNK蛋白條帶也分為JNK1和JNK2兩個(gè)亞帶。研究表明，P38通路和JNK通路在炎癥反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性病變和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[26]。ERK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)有絲分裂、增殖、分化和哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程[27]。MAPK通路參與調(diào)節(jié)多種重要的細(xì)胞生理、病理過(guò)程，促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)[28]。

aFGF的生物學(xué)功能與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及受體的結(jié)合有著密切關(guān)系。aFGF促進(jìn)大鼠腸上皮細(xì)胞增殖，與其激活MAPK信號(hào)通路有關(guān)[29]。aFGF通過(guò)ERK途徑將信號(hào)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，引起特定的生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[30-31]。aFGF啟動(dòng)的MAPK信號(hào)通路對(duì)多種細(xì)胞趨化應(yīng)答、分化、分裂起重要作用，尤其在神經(jīng)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育方面，是細(xì)胞增殖、分化等信息傳遞途徑的交集點(diǎn)和共同通路[32]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞建立藥物損傷模型，研究aFGF對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷保護(hù)作用過(guò)程中的機(jī)制，為臨床上安全有效使用氨基糖苷類(lèi)藥物奠定基礎(chǔ)。本研究顯示，慶大霉素可能通過(guò)激活ERK1損傷海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞；aFGF可能通過(guò)P38和ERK1途徑對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。ERK2、JNK1、JNK2途徑意義不明顯。

aFGF的保護(hù)作用是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，本研究未進(jìn)一步研究不同濃度下aFGF的保護(hù)作用機(jī)制有無(wú)變化，以及aFGF是否通過(guò)其他的信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用。有待在今后的研究中做更深入的探討。

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Effects of Acidic Fibroblast Growth Factor on Hippocampal Astrocytes Injury Induced by Gentamicin:Role of Mitogen-Activated Protein Kinase Signal Pathway

SHEN Li1,HUANG Ju-en1,HUANG Tai-ping1,SHEN Hui1,LI Xiao-kun2
1.School of Nursing,Guangxi Medical University,Nanning,Guangxi 530021,China;2.Institute of Biological and Natural Medicine of Wenzhou Medical College,Wenzhou,Zhejiang 325027,China

Correspondence to HUANG Ju-en.E-mail:hje5810@163.com

Abstract:Objective To explore the mechanism of the protection of acidic fibroblast growth factor(aFGF)for hippocampal astrocytes from injury induced by gentamicin.Methods Hippocampal astrocytes were isolated from newborn(24 hours)Sprague-Dawley rats,purified,and identified with glial fibrillary acidic protein(GFAP)immunofluorescence.The third generations were cultured for 3 days and divided into 3 groups:control group was cultured routinely,injury group was cultured with 2.0 g/L gentamicin for 24 hours,and protection group was cultured with 4.25 μg/L aFGF for 24 hours and then cultured with 2.0 g/L gentamicin for 24 hours.Western blotting was adopted to detect the expressions of P38,extracellular signal-regulated kinase(ERK)1/2 and c-Jun N-terminal kinase(JNK)1/2.Results Hippocampal astrocytes were culturated successfully with the purity above 95％.The ERK1 increased in the injury group compared with the control group(P<0.05).Compared with the injury group,the p38 increased(P<0.05)and the ERK1 decreased(P<0.05)in the protection group.There was no significant difference among others(P>0.05).Conclusion The mitogen-activated protein kinase signal pathway,especially P38 and ERK1,may associate with the protection of aFGF for hippocampal astrocytes from injury induced by gentamicin.

Key words:acidic fibroblast growth factor;mitogen-activated protein kinase;gentamicin;astrocytes;hippocampus;rats

(收稿日期：2015-11-08修回日期：2016-01-06)

基金項(xiàng)目：1.國(guó)家“863”計(jì)劃課題(No.2004AA2Z3C60)；2.廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題(No.2011046)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.03.006

[中圖分類(lèi)號(hào)]R595.4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1006-9771(2016)03-0270-04