正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選甘草總黃酮和總皂苷提取工藝*

趙　妮，鄧　毅△，劉　靚，董金香，曼　瓊甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000；甘肅省中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

?

正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選甘草總黃酮和總皂苷提取工藝*

趙妮1，鄧毅1△，劉靚2，董金香2，曼瓊2
1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000；2甘肅省中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

［摘要］目的：優(yōu)化甘草總黃酮和總皂苷的超聲提取工藝。方法：以提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比為考察因素，以總黃酮和總皂苷含量為綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選出最佳提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝：提取溫度為50℃，提取時(shí)間為45分鐘，乙醇濃度為60％，料液比為1∶10。結(jié)論：該提取工藝簡便、快捷，可用于甘草總黃酮、總皂苷的同時(shí)提取，為甘草進(jìn)一步研究與利用奠定基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］甘草；總黃酮；總皂苷；正交實(shí)驗(yàn)；提取工藝

Optimization of Extraction Technology of Total Flavonoids and Total Saponins from GanCao by Orthogonal Test

ZHAO Ni1,DENG Yi1△,LIU Liang2,DONG Jinxiang2,MAN Qiong2
1 Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;2 Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province

Abstract Objective:To optimize ultrasonic extraction technology of total flavonoids and total saponins from GanCao (Glycyrrhiza uralensis Fisch.).Methods:The best extraction technology was optimized by taking extraction temperature,extraction time,the concentrations of ethanol and solid-liquid ratio as the factors,the contents of total flavonoids and total saponins as evaluation indexes for comprehensive assessment.Results:The best extraction technology was:extraction temperature:50℃,extraction time:45 minutes,the concentrations of ethanol:60％,solid-liquid ratio:1:10.Conclusion:The extraction technology,simple,convenient and rapid,could be used for simultaneous extraction of total flavonoids and total saponins from GanCao,which could lay foundation for further study and utilization of GanCao.

Keywords GanCao;total flavonoids;total saponins;orthogonal test;extraction technology

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是豆科甘草屬(Glycyrrhiza)植物甘草的根和根莖，在中醫(yī)處方中占有重要地位，素有“十方九草”之稱［1-3］。甘草的活性成分主要包括三萜皂苷類和黃酮類，兩者都具有保肝、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等作用［4］。內(nèi)生菌(Endophyte)是指存活于健康植物組織內(nèi)部，而又不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物類群，包括真菌、細(xì)菌和放線菌。20世紀(jì)90年代，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)與植物長期共存的內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性成分后得到重視，并成為研究的熱點(diǎn)。有研究表明［5］，甘草內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物具有與甘草藥材相同或相似的生理活性，為此，筆者采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選甘草總黃酮、總皂苷的最佳提取工藝，較大程度地提取甘草中的總黃酮和總皂苷，為甘草總黃酮和總皂苷的純化，以及為后期研究甘草藥效成分和其內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物活性成分間的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

1　材料

1.1儀器723型紫外分光光度計(jì)(廈門分析儀器廠提供)；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司提供)；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇正基儀器有限公司提供)；臺(tái)式低速離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司提供)；BS-110S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司提供)。

1.2試藥甘草采自甘肅省酒泉市金塔縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)中心高級(jí)實(shí)驗(yàn)師林麗鑒定為正品；甘草酸銨鹽(江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：YJ-140227)；甘草苷(江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：YJ-150310)；無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、香草醛、冰乙酸、高氯酸均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1甘草總黃酮和總皂苷的含量測定

2.1.1提取方法精準(zhǔn)稱取甘草粉末0.2 g于50 mL錐形瓶中，加10倍量體積的60％乙醇，50℃超聲提取45分鐘，離心，得甘草提取液。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備精密稱定甘草苷和甘草酸銨鹽，分別定溶于10 mL容量瓶中，制得濃度為0.161 7、0.508 2 mg/mL的甘草苷和甘草酸銨鹽對(duì)照品溶液。

2.1.3甘草苷標(biāo)準(zhǔn)曲線［6］精密吸取甘草苷對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL依次置于10 mL的容量瓶中，各加入70 ％甲醇溶液1 mL搖勻后，再加10 ％ NaOH溶液2.5 mL顯色，10分鐘后用70％甲醇溶液定容，在410 nm波長下分別測定吸光度值，并以甘草苷質(zhì)量(Y)為自變量，吸光度(X)為因變量，得回歸方程：Y=0.3898X－0.0133，r2=0.999 4，甘草苷在0.025～0.407 mg線性關(guān)系良好。

2.1.4甘草酸銨鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線［7］精密吸取甘草酸銨對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2、3 mL于試管中，揮干溶劑，加5％香草醛-冰醋酸溶液0.25 mL，搖勻，加0.8 mL高氯酸，搖勻，在56℃水浴反應(yīng)20分鐘，取出自來水冷至室溫，用不含對(duì)照品的溶劑作為空白，在589 nm波長處測定吸光度，并以甘草酸銨質(zhì)量(Y)為自變量，吸光度(X)為因變量，得回歸方程：Y=0.655 7X-0.042 7，r2=0.999 4甘草酸銨鹽在0.016～0.485 mg線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取甘草苷和甘草酸銨鹽對(duì)照品溶液0.4 mL、1.5 mL分別定溶于10 mL錐形瓶中，分別按“2.1.3”和“2.1.4”項(xiàng)下方法測定吸光度，平行操作5次。結(jié)果RSD甘草苷=0.16％，RSD甘草酸銨鹽=0.14 ％。表明儀器精密度良好。

2.1.6加樣回收率實(shí)驗(yàn)［8］精密吸取9份甘草提取液各5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，分別加入甘草苷對(duì)照品溶液2.0、4.0、6.0 mL，配成低、中、高濃度溶液各3份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別顯色后測定其吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為101.7 ％，RSD=1.62 ％(n=9)。另精密吸取9份甘草提取液各5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，分別加入甘草酸銨鹽對(duì)照品溶液2.0、4.0、6.0 mL，配成低、中、高濃度溶液各3份，按“2.1.4”項(xiàng)下方法分別顯色后測定其吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均加樣回收率為99.8％，RSD=1.23 ％(n=9)。

2.1.7含量測定精密吸取甘草提取液適量，分別按“2.1.3”和“2.1.4”項(xiàng)下方法分別測定總黃酮和總皂苷的吸光度，代入各自回歸方程，計(jì)算二者含量。

2.2甘草總黃酮和總皂苷最佳工藝優(yōu)選

2.2.1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為尋求最佳提取組合，本實(shí)驗(yàn)中選用提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比作為考察對(duì)象，每個(gè)因素3個(gè)水平，以總黃酮和總皂苷含量為綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。因素表見表1。

2.2.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照L9(34)正交設(shè)計(jì)表的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別測定甘草總黃酮和總皂苷的含量。采用信息熵權(quán)重分析法確定總黃酮(A)和總皂苷(B)的權(quán)重系數(shù)分別為0.5，根據(jù)各指標(biāo)的權(quán)重，計(jì)算綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。綜合評(píng)分=(0.5A/17.285 3+0.5B/12.927 2)×100％。方差分析結(jié)果見表2，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表1　甘草總黃酮及總皂苷提取工藝水平因素

表2　綜合評(píng)分方差分析結(jié)果

表3　甘草總黃酮、總皂苷提取工藝正交

由表2和表3可知B＞D＞A＞C，即提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度＞乙醇濃度，4個(gè)因素對(duì)提取率都有極顯著性影響。最佳提取工藝條件為：A3B3C2D1，即提取溫度為50℃，提取時(shí)間為45分鐘，乙醇濃度為60％，料液比為1∶10。

2.2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)精密稱取0.2 g甘草藥材粉末，按上述最佳提取工藝條件提取，按“2.1.3.1”和“2.1.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測定，平行提取3次，測定總黃酮和總皂苷的吸光度。結(jié)果綜合評(píng)分：1.017 1、1.009 1、0.995 3 mg/g，RSD=1.09％(n=3)。表明提取工藝可靠、穩(wěn)定、可行。

3　討論

以蘆丁作為對(duì)照品來測定總黃酮含量是最普遍、最常用的方法。蘆丁屬于黃酮醇類化合物，但是，甘草中黃酮類成分以二氫黃酮類(甘草苷、甘草素)和查耳酮類(異甘草苷、異甘草素)為主。因此，選用甘草中含量較高的甘草苷為對(duì)照品比選用蘆丁更合理，誤差更小。二氫黃酮類成分在10％氫氧化鈉堿性條件下可以轉(zhuǎn)化成查耳酮，利用這一的特性來測定甘草總黃酮的含量，可使測定結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。

香草醛在放置過程中易氧化而使顏色加深［9］，因此，在測定總皂苷含量時(shí)，香草醛-冰醋酸溶液需現(xiàn)配先用，并應(yīng)盡量保證測量條件的一致性，以免引起誤差。顯色反應(yīng)過程中，吸光度隨著時(shí)間、溫度、顯色劑用量的改變而改變，本實(shí)驗(yàn)在測定甘草總皂苷的過程中嚴(yán)格控制了顯色時(shí)間、反應(yīng)溫度、顯色劑用量等條件，以防這些因素的改變而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選總黃酮和總皂苷可以同時(shí)提取的最佳提取工藝，并以總黃酮(甘草苷、甘草苷元、異甘草苷等)和總皂苷(甘草酸、甘草次酸、異甘草次酸等)為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)甘草進(jìn)行提取工藝研究，為甘草藥效成分的純化以及研究甘草內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物與甘草藥材活性成分間的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。在處理數(shù)據(jù)時(shí)，為了便于比較分析，對(duì)各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用的是Ci/Cmax，即數(shù)據(jù)除以該組最大數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］劉仁俊.淺談甘草化學(xué)成分及藥理作用［J］.中國中醫(yī)藥，2011，9(19):74-75.

［2］馮月，吳文夫，魏建華，等.甘草酸及甘草苷的提取純化方法和藥理作用研究進(jìn)展［J］.人生研究，2012，24(3):46-50.

［3］王偉明，朱文全，張志波.甘草有效成分提取分離方法的研究進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2010，23(1):93-94.

［4］高雪巖，王文全，魏勝利，等.甘草及其活性成分的藥理活性研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，2009，34(21):2695-2700.

［5］鄧毅，王艷，丁仁偉，等.甘肅甘草內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物抑菌活性初步研究［J］.中藥材，2013，36(2):181-184.

［6］馬子?jì)桑S穎，劉佳，等.甘草廢渣中甘草黃酮提取工藝研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，16(15):15-19.

［7］朱中佳，熊富良，張雪瓊，等.甘草總皂苷的提取純化工藝研究［J］.中成藥，2011，33(2):341-343.

［8］馬俊鵬，韓海霞，郭喜紅，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選啤酒花總黃酮提取工藝［J］.中藥材，2010，21(11):994-996.

［9］張中偉，謝明勇，王遠(yuǎn)興，等.比色法測定苦瓜總皂苷［J］.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，29(5):447-449．

通訊作者：△鄧毅(1964—)，男，碩士研究生導(dǎo)師，教授，中藥學(xué)科學(xué)術(shù)帶頭人。研究方向：中藥學(xué)教學(xué)、中藥性能與配伍應(yīng)用及中藥不良反應(yīng)的研究。

作者簡介：趙妮(1988—)，女，在讀碩士研究生。研究方向：中藥及復(fù)方應(yīng)用研究。

*基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)81360633）。

收稿日期：2015-07-20

［中圖分類號(hào)］R284.2

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1004-6852(2016)02-0034-03