大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型中PI3K/Akt信號(hào)通路參與誘導(dǎo)疼痛

袁翠堂　丁　罡　廖志軍　姜　峰　葉　品　陳思宇

200092 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院(袁翠堂，丁　罡，廖志軍，陳思宇)；202150 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院(袁翠堂，丁　罡，廖志軍，姜　峰，葉　品)

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·基礎(chǔ)研究·

大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型中PI3K/Akt信號(hào)通路參與誘導(dǎo)疼痛

袁翠堂丁罡廖志軍姜峰葉品陳思宇

200092 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院(袁翠堂，丁罡，廖志軍，陳思宇)；202150 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院(袁翠堂，丁罡，廖志軍，姜峰，葉品)

【摘要】目的探討骨癌痛大鼠模型中PI3K/Akt信號(hào)通路參與痛覺過敏的產(chǎn)生和維持及其脊髓機(jī)制。方法Wistar大鼠，體重在180～200 g，將大鼠隨機(jī)分為3組：癌痛模型組(A組)、假手術(shù)組(B組)、正常組(C組),A組大鼠左側(cè)脛骨髓腔內(nèi)單次注入 Walker256 乳腺癌細(xì)胞建立大鼠脛骨癌痛模型，B組大鼠左側(cè)脛骨注入等量生理鹽水，C組做不給藥處理。A組造模后第7天，評(píng)估篩選成模的大鼠，隨機(jī)分為3組：癌痛組(A1組)、癌痛+NS組(A2組)、癌痛+抑制劑組(A3組)。正常對(duì)照組(C組)隨機(jī)分為2組：空白對(duì)照組(C1組)、空白+抑制劑組(C2)。A3組和C2組分別在第13、14、21天鞘內(nèi)注射Akt抑制劑GSK690693，A2組在第13、14、21天鞘內(nèi)注射等量生理鹽水，A1組、B組、C1組均不給藥處理。在第0、7、14、21天，分別檢測(cè)大鼠機(jī)械性縮足閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和熱縮腿潛伏期(thermal withdrawal latency,MWT)。第21天行為學(xué)測(cè)試后處死大鼠，取大鼠脊髓L4～L6區(qū)段，用免疫組化及Western blot檢測(cè)大鼠脊髓的磷酸化Akt(p-Akt)水平。結(jié)果實(shí)驗(yàn)觀察到大鼠的MWT和TWL均顯著降低，第7天及14天A1組、A2組、A3組及B組分別與C1組比較，P<0.05，第21天A3組與A1組、A2組分別比較，P<0.05。與C1組比較，骨癌痛模型組大鼠脊髓背角p-Akt表達(dá)增強(qiáng)，鞘內(nèi)注射Akt抑制劑可降低脊髓背角p-Akt的表達(dá)。結(jié)論P(yáng)I3K/Akt信號(hào)通路參與了骨癌痛的中樞敏化，在大鼠骨癌痛發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

【關(guān)鍵詞】PI3K/Akt；脊髓；大鼠

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:349～352)

疼痛是是中晚期惡性腫瘤患者最常見的臨床癥狀之一，晚期癌癥患者疼痛的發(fā)生率為70%～90%[1]。癌癥疼痛從生理、心理、精神及社會(huì)等方面不同程度降低腫瘤患者的生活質(zhì)量[2]。PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是體內(nèi)重要的信號(hào)通路之一，研究表明，該信號(hào)通路參與了病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過程。PI3K-Akt信號(hào)通路激活后可以誘導(dǎo)和維持不同程度的痛敏反應(yīng)。通過研究這一信號(hào)通路，有望為病理性疼痛的臨床治療提供新的靶點(diǎn)，但是有關(guān)這一信號(hào)通路在大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛中的作用尚不明確。本研究通過觀察鞘內(nèi)注射Akt抑制劑GK690693對(duì)大鼠骨癌痛的影響，了解PI3K/Akt抑制劑在骨癌痛的脊髓機(jī)制中的作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

異氟烷(魯南貝特制藥有限公司)，水合氯醛(10%)、醫(yī)用碘伏、無(wú)菌棉簽、止血鉗等(上海新華醫(yī)院崇明分院骨科提供)，1 ml 注射器針頭、微量進(jìn)樣器、醫(yī)用骨水泥等(上海新華醫(yī)院崇明分院骨科提供)，Walker256 乳腺癌細(xì)胞株(受贈(zèng)于復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院王彥青教授)。Akt抑制GSK690693(美國(guó)Selleck公司)，Vonfrey 纖維絲(Stoelting公司,美國(guó))，小動(dòng)物麻醉機(jī)(美國(guó)matrx馬特)。

1.2動(dòng)物分組

Wistar大鼠，體重在180～200 g。將90只大鼠隨機(jī)分為3組：癌痛模型組(A組60只)、假手術(shù)組(B組10只)、正常組(C組20只)。A組大鼠左側(cè)脛骨髓腔內(nèi)注入20 μl Walker256 細(xì)胞(1×108/ml)，B組大鼠左側(cè)脛骨髓腔內(nèi)注入20 μl 生理鹽水，其余操作同A組。C組不做任何干預(yù)。

造模后第7天，評(píng)估癌痛動(dòng)物模型，再分組。 根據(jù)大鼠一般情況(生長(zhǎng)情況，體重變化)、行為學(xué)表現(xiàn)及影像學(xué)評(píng)估癌痛組大鼠造模是否成功：①造模術(shù)后第7天大鼠生長(zhǎng)情況良好，體重明顯增長(zhǎng)，與C組類似，甚至增長(zhǎng)體重超過對(duì)照組;②造模術(shù)后第7天MWT及TWL未出現(xiàn)下降，反而升高；③影像學(xué)X線攝片大鼠左后脛骨表現(xiàn)：局部骨質(zhì)透亮度減低，未見明顯骨質(zhì)破壞。同時(shí)滿足這3個(gè)條件中的兩個(gè)條件認(rèn)為大鼠造模失敗，將其剔除出癌痛模型組，剔除出本實(shí)驗(yàn)，第7天從造模所有60只大鼠中篩選出30只造模成功的大鼠。再分組：第7天后，將A組成膜的30只大鼠隨機(jī)分為3組：癌痛組(A1組)、癌痛+NS組(A2組)、癌痛+抑制劑組(A3組)，n=10。正常對(duì)照組(C組)隨機(jī)分為2組：空白對(duì)照組(C1組)、空白+抑制劑組(C2)，n=10。A3組和C2組分別在建模后第13、14、21 d鞘內(nèi)注射Akt抑制劑GSK690693 。A2組在建模后第13、14、21d鞘內(nèi)注射等量生理鹽水，A1組、B組、C1組均不給藥處理。

1.3骨癌痛模型制作

參考Medhurst 等[3]文獻(xiàn)中的方法，稍加改變，建立大鼠脛骨癌痛模型，用異氟烷氣體廂式麻醉以后，改用鼻吸入維持，暴露左側(cè)脛骨上段位置，取1 ml 注射器針頭，在脛骨粗隆處，與骨面呈30°～40°角，鉆孔，使用50 μl的微量注射器，抽取Walker 256 細(xì)胞懸液20 μl，細(xì)胞濃度為 1×108cells/μl，從穿刺針孔將懸液接種到骨髓腔內(nèi)，拔出后迅速用醫(yī)用骨水泥封住針孔，接下來(lái)用生理鹽水局部沖洗，縫合傷口，創(chuàng)口處涂抹金霉素眼膏注射液預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠左側(cè)脛骨的上段注入相同體積的生理鹽水，余操作同癌痛模型組。C1 、C2不做任何處理。

1.4鞘內(nèi)給藥

根據(jù) Mestre 等[4]描述的方法實(shí)施鞘內(nèi)給藥。A3組和C2組分別在建模后第13、14、21 d鞘內(nèi)注射Akt抑制劑GSK690693，A2組在建模后第13、14、21 d鞘內(nèi)注射等量生理鹽水，A1組、B組、C1組均不給藥處理。

1.5行為學(xué)測(cè)定

建模前、建模后第7、14、21天評(píng)估各組大鼠疼痛學(xué)行為：測(cè)大鼠左后足機(jī)械性縮足閾值和熱縮腿潛伏期，統(tǒng)計(jì)分析大鼠的MWT、TWL。第14、21天鞘內(nèi)注射抑制劑2h后測(cè)行為學(xué)并記錄行為數(shù)據(jù)。

1.5.1大鼠左后足機(jī)械性縮足閾值測(cè)定將大鼠放在鋼絲網(wǎng)格(1 cm×1 cm)上的有機(jī)玻璃盒(20 cm×20 cm×30 cm)中。用 Von Frey 纖維測(cè)量大鼠的機(jī)械縮足反射閾值。當(dāng)大鼠左后足接觸地面并正常負(fù)重時(shí)即可測(cè)量。從網(wǎng)格下刺激動(dòng)物左后肢足底部中心皮膚，每根纖維彎曲至適當(dāng)程度停留2～3 s，兩次測(cè)量時(shí)間間隔10 s。von Frey 纖維的刺激強(qiáng)度順序?yàn)橛尚〉酱?。如果沒有縮足反射，使用更大克數(shù)的纖維繼續(xù)測(cè)量，測(cè)量最大值為26 g。取能引起50%縮足反應(yīng)的最小克數(shù)值為機(jī)械縮足反射閾值。

1.5.2大鼠左后足熱縮腿潛伏期參考并略加改進(jìn) Hargreaves 等的方法。將一個(gè)20 cm×20 cm×30 cm 有機(jī)玻璃罩放置在一塊厚度為2 mm的玻璃板上，大鼠置于其中，玻璃下方是熱痛刺激儀的紅外光熱探頭。熱刺激直接施加在雙側(cè)后足的足心部位。測(cè)量自動(dòng)切斷時(shí)間為 25 s，以免導(dǎo)致組織的實(shí)質(zhì)性損傷。同一位點(diǎn)重復(fù)測(cè)量 5 次，測(cè)量每?jī)纱伍g隔至少10 min，不同位點(diǎn)測(cè)量每?jī)纱伍g隔5 min。測(cè)3次，取平均值作為熱縮足反射閾值。

1.6免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)脊髓p-Akt水平

建模后第21天取大鼠脊髓L4-L6 段，采用免疫組化染色法觀察脊髓中p-Akt的表達(dá)情況。具體方法：大鼠腹腔注射水合氯醛(10%) 300 mg/kg深度麻醉，沿著大鼠肋弓剖開胸腔，曝露心臟，經(jīng)左心室升主動(dòng)脈根部灌注 200 ml 生理鹽水，沖洗凈血管內(nèi)血液，后改用 400 ml 固定液(含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸緩沖 液，pH 7.4，4 ℃)灌注1 h。迅速剝?nèi)〈笫笱?L4～L6 節(jié)段脊髓，將L4～L6脊髓迅速放到4%多聚甲醛中固定,采用常規(guī)石蠟包埋,切片厚4 μm。脊髓切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟,然后加入3% H2O2孵育10 min,接著在枸櫞酸緩沖液(pH=7.2)中煮沸10 min,血清封閉10 min后,移去多余的血清,加p-Akt 一抗(批號(hào):KC-5A04,上?？党缮锕こ逃邢薰?,在4 ℃條件下孵育15 h，15 h后依次加入二抗(批號(hào):ZB-2010,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)及SP,接著DAB 顯色,蘇木精復(fù)染,應(yīng)用二甲苯透明,最后中性樹膠封片。光鏡下觀察p-Akt 的陽(yáng)性反應(yīng)，并采像。

1.7Western blot法檢測(cè)脊髓p-Akt水平

在實(shí)驗(yàn)開始的第21天，給大鼠腹腔注射水合氯醛(10%) 300 mg/kg深度麻醉后斷頸處死。迅速剝離腰椎 L4-L6 節(jié)段對(duì)應(yīng)的脊髓，在冰浴條件下將組織勻漿,提取總蛋白進(jìn)行蛋白定量(BCA法)。10%SDS-PAGE 電泳,低壓半干轉(zhuǎn)膜3 h，進(jìn)行免疫反應(yīng),接著加入p-Akt 一抗，4 ℃下孵育12 h，然后加入HRP標(biāo)記的二抗(產(chǎn)品批號(hào):ZB-2301,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，在室溫下孵育2 h后,DAB 顯色10 min后再采集圖像。應(yīng)用圖像分析軟件Image pro plus 6.0測(cè)定目標(biāo)條帶,以目標(biāo)條帶的積分光密度值(IOD) 作為p-Akt 的表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

觀察大鼠的MWT可以發(fā)現(xiàn)，C1、C2組表現(xiàn)相同，隨時(shí)間推進(jìn)機(jī)械縮足反射閾值輕度增大,變化幅度較小；B組術(shù)后MWT開始下降，第7天與C1組比較差異明顯(P<0.05),第14天增高，至21天MWT數(shù)值與C1組接近(第21天，B組與C1組比較，P>0.05)。癌痛模型組(A1、 A2 、A3組)術(shù)后至第7天均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，第14天，A1組、A2組、A3組分別與C1組比較，P<0.01。A3組與A1組比較，P<0.05，第21天，A3組MWT明顯增高，接近C1組(P>0.05)，A1組MWT仍較低，與A3組比較，P<0.05，見表1。

表1　鞘內(nèi)給予GSK690693對(duì)大鼠MWT的影響

注：第21天，A3組、B組、C2組分別與C1組比較，P均>0.05；A3組與A1組比較，P<0.05。

大鼠的TWL表現(xiàn)與MWT相似，癌痛模型組(A1、 A2 、A3組)術(shù)后至第7天均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，B組術(shù)后MWT開始下降，第7天與C1組比較差異明顯(P<0.05),之后逐漸增高，第14天，A1組、A2組、A3組分別與C1組比較，P<0.01。A3組與A1、A2組兩兩比較，P<0.05。第21天，A1組TWL較前縮短，A3組TWL明顯延長(zhǎng)，接近對(duì)照組C1水平，A3組與C1組比較P>0.05.A3組與A1組比較，P<0.05(表2)。

免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，p-Akt 主要分布在脊髓中神經(jīng)元的胞核內(nèi)及細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)中,A1組及A2組均有很強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá),A3組表達(dá)較弱。

Western blot半定量檢測(cè)結(jié)果可見,與對(duì)照C1組數(shù)據(jù)比較，C1組與C2組p-Akt水平相當(dāng)(P>0.05)，B組稍高(P>0.05)，A1組明顯高于B組(P<0.05)；A2組P-Akt水平高于C1組(P<0.05)，鞘內(nèi)注射GSK690693后，A3組p-Akt明顯下降，低于A1及A2組(P<0.05)(圖1)。

表2　鞘內(nèi)給予GSK690693對(duì)大鼠TWL的影響

注：第21天，A3組、B組、C2組分別與C1組比較，P均>0.05.；A3組與A1組比較，P<0.05；A2組與A1組比較，P>0.05。

圖1　p-Akt在大鼠脊髓中的免疫印跡半定量結(jié)果

3討論

PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞中,參與細(xì)胞代謝、有絲分裂、細(xì)胞分化等多種生理過程。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidy linositol 3-kinase,PI3K)是生長(zhǎng)因子受體超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要成員。PI3K在機(jī)體內(nèi)各種細(xì)胞中普遍存在,可被多種理化因素激活及細(xì)胞因子激活。絲/蘇氨酸激酶 (serine threonine kinase,Akt)位于PI3K信號(hào)通路的下游,主要負(fù)責(zé) PI3K始動(dòng)的信息傳導(dǎo),Akt位于此通路的中心環(huán)節(jié),是PI3K的直接靶基因,激活的PI3K在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3調(diào)節(jié)Akt的Ser473位點(diǎn)和Thr308位點(diǎn)的磷酸化，從而將Akt鎖定于活化狀態(tài)即為p-Akt[5-6]。GSK690693是Akt的特異性抑制劑,可抑制其信號(hào)向下游傳導(dǎo)，降低下游的 p-Akt 水平,阻斷p-Akt下游的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

本研究中骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾明顯下降,體重減輕，脛骨影像學(xué)表現(xiàn)異常，脛骨病理切片可見骨質(zhì)破壞，說(shuō)明骨癌痛模型制備成功。大鼠的機(jī)械縮足反射閾值結(jié)果提示手術(shù)創(chuàng)傷影響大鼠MWT數(shù)值，誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生痛覺過敏，待創(chuàng)傷修復(fù)后，MWT數(shù)值逐漸升高，趨于正常，鞘內(nèi)注射Akt抑制劑GSK690693后，MWT回升，提示GSK690693可以抑制PI3K/Akt

信號(hào)通路，抑制癌痛，降低機(jī)械痛覺過敏，改善疼痛。大鼠的熱縮足反射潛伏期(TWL)結(jié)果顯提示，手術(shù)創(chuàng)傷影響大鼠TWL數(shù)值，誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生熱痛覺過敏，待創(chuàng)傷修復(fù)后,TWL數(shù)值逐漸升高，趨于正常；鞘內(nèi)注射Akt抑制劑GSK690693后，TWL延長(zhǎng)，熱痛敏閾值升高，提示GSK690693可以降低大鼠熱痛覺過敏，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，改善疼痛。鞘內(nèi)注射GSK90693可以降低大鼠的痛域，但對(duì)大鼠骨質(zhì)結(jié)構(gòu)改變無(wú)明顯影響，不能逆轉(zhuǎn)大鼠骨質(zhì)破壞。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛模型大鼠脊髓p-Akt水平明顯升高，提示在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛模型大鼠的疼痛發(fā)生過程中，PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)生激活，鞘內(nèi)注射Akt抑制劑GSK690693后，脊髓中的p-Akt水平降低，PI3K/Akt信號(hào)通路受到抑制，大鼠疼痛癥狀好轉(zhuǎn)，證實(shí)了PI3K/Akt信號(hào)通路在大鼠骨癌痛發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，這為骨癌痛的治療提供了新的方向，通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路有望改善骨癌痛。有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路可能通過激活下游NF-κB通路導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的活化[7]，但具體的機(jī)制仍不明確。

綜上所述，PI3K/Akt信號(hào)通路參與了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠骨癌痛脊髓水平的調(diào)節(jié)，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的研究證明。

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(編輯：吳小紅)

PI3K/Akt Signal Pathway in Cancer Pain Induced by Bone Metastases

YUANCuitang,DINGGang,LIAOZhijun,etal.

XinhuaHospitalAffliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai,200092

【Abstract】ObjectiveTo discuss the role of PI3K/Akt signal pathway in bone metastases pain caused by breast cancer in rats.MethodsWistar rats weighting 180～200 g were selected,all rats were randomly divided into 3 groups:group A was rat model of bone cancer pain,group B was sham operation group,group C was the control group.To establish bone cancer pain model,Walker 256 tumor cells was intra-left tibial inoculated in Wistar rats in group A.Group B was given normal saline of the same quantity,group C received no treatment.7 days after establishment of bone cancer pain model,the model were evaluated.The rats in group A that were successfully established bone cancer pain model were divided into 3 group:group A1 was rat model of bone cancer pain,group A2 was rat model of bone cancer pain+NS,group A3 was rat model of bone cancer pain+PI3K inhibitor.Rats in group C were divided into 2 groups:group C1 received no treatment,group C2 received PI3K inhibitor.On the 13th day,14th day,and 21st day,group A3 and C2 were injected by Akt inhibitor GSK690693.By intrathecal injection,group A2 was treated with NS in the same condition,there was no treatment on group A1,B,and C1.We measured mechanical withdrawal threshold and thermal withdrawal latency at 0,7,14,21 day.After 21 days when we finished behavior testing at 21 day,the lumbar segment 4～6 of spinal cord were isolated from these experimental rats.The level of p-Akt was detected by immunohistochemistry and western blots.ResultsIt was observed that MWT and TWL were reduced in each experimental group which indicated that the bone pain model was established successfully.The p-Akt level of spinal cord in bone cancer pain model was significantly higher than group C1 on the 21st day.Intrathecal injection of Akt inhibitors may suppress the expression of p-Akt in spinal cord.ConclusionThe PI3K/Akt signal pathway plays an important role in the initiation and development of bone cancer pain.

【Key words】PI3K/Akt;Spinal cord;Breast cancer cell

(收稿日期2015-09-09修回日期 2016-12-12)

中圖分類號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)03-0349-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.001

通訊作者：陳思宇

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81400905);上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院院級(jí)課題培育項(xiàng)目(P201410)