超聲波提取地龍抗血栓部位的工藝研究

鄭順亮，劉東明，王思瑤

（牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司，黑龍江牡丹江157013）

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超聲波提取地龍抗血栓部位的工藝研究

鄭順亮，劉東明，王思瑤

（牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司，黑龍江牡丹江157013）

摘要：通過(guò)提取方式選擇和正交設(shè)計(jì)法對(duì)地龍的抗血栓部位進(jìn)行超聲波提取，以纖溶酶活性和干膏率為指標(biāo)，分別對(duì)料液比、提取溫度、提取時(shí)間等因素進(jìn)行考察，優(yōu)選出最佳工藝條件為：以水為提取溶劑，料液比1∶12/1∶10，提取溫度25℃，提取時(shí)間40min；驗(yàn)證試驗(yàn)表明工藝穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：地龍；抗血栓部位；超聲波提??；纖維蛋白平板法；正交試驗(yàn)

地龍（Pheretima）為鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E. Perrier）、通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi （Michaelsen）和櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥全體[1 ]。地龍是一味重要的動(dòng)物藥材，臨床上常被用來(lái)治療心腦血管疾病、高熱驚厥、哮喘等[2]。地龍中含有多種活性成分[3-7]，包括具有抗血栓、抗凝活性的蛋白質(zhì)、多肽、酶類成分（酶類主要包括蚯蚓纖維蛋白溶解酶Earthworm fibrinolytic enzyme、蚓激酶Lumbrokinase等），還含有核苷酸、脂類、微量元素等其他成分，這些成分在地龍的應(yīng)用中起著十分重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用纖維蛋白平板法來(lái)檢測(cè)地龍中的纖溶酶活性，并以纖溶面積和干膏率為指標(biāo)，優(yōu)化和確定超聲波提取地龍抗血栓部位的提取工藝。友搏藥業(yè)現(xiàn)已配備產(chǎn)業(yè)化外循環(huán)超聲提取設(shè)備（一噸罐），本工藝研究可為地龍的產(chǎn)業(yè)化研究及綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為公司新產(chǎn)品的開發(fā)起推動(dòng)作用。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1材料與儀器

地龍藥材（廣地龍）由牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，產(chǎn)地廣西。

5%纖維蛋白原溶液（溶于0.1mol·L-1磷酸緩沖液pH值為7.4），20μ·mL-1凝血酶溶液（溶于0.1 mol·L-1磷酸緩沖液pH值為7.4）；凝血酶（上海生物化學(xué)制藥廠），纖維蛋白原（上海萊士血制品有限公司）；乙醇（A.R.），蒸餾水，其余試劑均為分析純。

RE-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SC-3610離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；BGZ146電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DSY-1-6孔電熱恒溫水浴鍋（北京國(guó)華醫(yī)療器械廠）；FE20K型PH計(jì)（METTLER TOLEDO公司）；YP3001N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；平皿（φ9cm）若干；PSH-525恒溫箱（重慶試驗(yàn)設(shè)備廠）；游標(biāo)卡尺（SANTO公司）。

1.2纖維蛋白平板的制備[ 8 ]

在平皿內(nèi)加9mL纖維蛋白原溶液，再加1mL凝血酶溶液，立即打旋混勻大約10s，在平皿蓋上襯以濾紙，在水平處放置30min，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3纖溶酶活性的測(cè)定方法[ 9 ]

將20μL地龍待測(cè)液滴加到纖維蛋白平板上，每點(diǎn)間距離不得小于1.5cm，在另一側(cè)滴加20μL生理鹽水作為對(duì)照。將平板平置于濕盒內(nèi)，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)6h，觀察有無(wú)溶解圈，并用卡尺測(cè)定溶解圈的直徑，根據(jù)下式計(jì)算溶解圈面積（纖溶面積），以纖溶面積評(píng)價(jià)纖溶酶活性（面積越大，表示纖溶酶活性越強(qiáng)）。

纖溶面積（mm2）=[（長(zhǎng)徑+短徑）/4]2×π

1.4干膏率的測(cè)定方法

精密吸取適量地龍?zhí)崛∫褐糜谝迅稍镏梁阒氐恼舭l(fā)皿中，水浴蒸干溶劑，轉(zhuǎn)移至干燥箱中105℃干燥3h，取出置干燥器中放涼，稱定，得干膏物重，并根據(jù)下式計(jì)算干膏率。

干膏率（%）=（干膏物重/地龍生藥量）×100%

1.5提取工藝設(shè)計(jì)

首先，對(duì)超聲波提取地龍抗血栓部位的提取溶劑、方式進(jìn)行考察，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇合適的影響因素再進(jìn)行正交試驗(yàn)，最后根據(jù)篩選得到的最佳工藝提取3批樣品進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6提取方式的選擇-提取液的制備

水煎煮法：將地龍100g加水浸泡30min，煎煮提取2次（10倍量，每次90min），過(guò)濾，合并濾液。

乙醇回流法：將地龍100g加70%乙醇浸泡30min，加熱回流提取2次（10倍量，每次90min），過(guò)濾，合并濾液。

水超聲提取法：將地龍100g加水浸泡30min，超聲提取2次（10倍量，每次40min），過(guò)濾，合并濾液。

乙醇超聲提取法：將地龍100g加70%乙醇浸泡30min，超聲提取2次（10倍量，每次40min），過(guò)濾，合并濾液。

以上4種不同提取方式得到的濾液均分別以4800r·min-1離心30min，上清液定容后取適量減壓濃縮（55～60℃）至每毫升藥液相當(dāng)于2.0g生藥（即2.0g生藥/mL），備用。

2　結(jié)果與討論

2.1地龍?zhí)崛》绞降倪x擇

以纖維蛋白平板法的纖溶面積為指標(biāo)，考察和優(yōu)選地龍的提取方式。

按“1.3纖溶酶活性的測(cè)定方法”，精密吸取“1.6提取方式的選擇-提取液的制備”項(xiàng)下的4種地龍?zhí)崛饪s液各20μL，分別滴加于同一纖維蛋白平板上，于37℃培養(yǎng)6h，測(cè)定纖溶面積，結(jié)果見表1。

表1　4種提取方式試驗(yàn)結(jié)果Tab.1　Results of the four extraction methods

結(jié)果表明，地龍的水超聲提取法優(yōu)于其他3種方法，所以選擇以水為溶劑、超聲提取法提取地龍抗血栓活性部位。

2.2地龍水超聲波提取的工藝優(yōu)選

根據(jù)“2.1”項(xiàng)下地龍?zhí)崛》绞皆囼?yàn)結(jié)果，以水為提取溶劑進(jìn)行超聲波提取，均提取2次，分別以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）為影響因素，以干膏率和纖溶面積為考查指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)選。因素水平、試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果分別見表2～4。

表2　L9（34）正交試驗(yàn)水平因素Tab.2　Orthogonal test of L9（34）

表3、4結(jié)果表明，對(duì)地龍干膏率影響的主次因素為提取溫度（C）＞提取時(shí)間（B）＞料液比（A），其中提取溫度的影響具有高度顯著性（P小于0.01），提取時(shí)間和料液比沒(méi)有顯著性差異，最佳工藝為A2B2C3；對(duì)纖溶面積影響的主次因素為提取溫度（C）＞料液比（A）＞提取時(shí)間（B），其中提取溫度的影響具有高度顯著性（P小于0.01），料液比的影響具有顯著性（P小于0.05），提取時(shí)間沒(méi)有顯著性差異，最佳工藝為A3B2C1?？紤]到纖溶面積指標(biāo)在地龍抗血栓部位超聲波提取工藝中的重要性，并結(jié)合生產(chǎn)成本、時(shí)間、效率等因素，優(yōu)選工藝為A3B2C1，即超聲波提取地龍抗血栓部位的優(yōu)選工藝條件為以水為提取溶劑，料液比（提取兩次：第一次1∶12，第二次1∶10），提取溫度為25℃，每次提取時(shí)間為40min。

在以上優(yōu)化工藝條件下重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，地龍超聲波提取的干膏率為11.23%（±1.24%，n=3）、纖溶面積為423.5mm2（±2.73%，n=3），驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明工藝穩(wěn)定可行。

表3　L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3　Result of orthogonal test of L9（34）

表4　方差分析Tab.4　Analysis of variance

2.3討論

提取溶劑和提取方式是決定地龍抗血栓部位纖溶活性的2個(gè)重要因素，因此，本實(shí)驗(yàn)首先考察了以乙醇、水為提取溶劑，超聲提取和加熱（回流）提取分別對(duì)地龍進(jìn)行提取考察，結(jié)果表明加熱提?。ǜ邷兀┢茐牡佚堉械睦w溶酶活性成分而無(wú)纖溶作用，而以水為溶劑超聲波提取的地龍纖溶酶活性顯著優(yōu)于以乙醇為提取溶劑。

纖維蛋白溶解活性（纖溶酶活性）的測(cè)定方法是評(píng)價(jià)藥物纖溶活性和篩選抗血栓部位的重要手段。試驗(yàn)中，同時(shí)采用過(guò)平板法和加熱平板法來(lái)測(cè)定地龍樣品的纖溶酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)平板法較加熱平板法敏感，所以本試驗(yàn)選擇平板法測(cè)定纖溶面積。

大生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)中藥材的提取基本上都是采用提取兩次，在試驗(yàn)過(guò)程中，考察了地龍藥材的超聲波第3次提取，其第3次提取的干膏率占總干膏率的3.52%、纖溶面積（樣品濃度：4.0g生藥/mL）僅為38.3mm2，表明地龍超聲波提取兩次已基本提取完全，考慮大生產(chǎn)的成本、效率等因素，可不進(jìn)行第3次提取。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波提取技術(shù)，應(yīng)用超聲波能在液體介質(zhì)中傳播的性質(zhì)和超聲波特有的“空化效應(yīng)”，快速有效地提取地龍藥材中的有效成份。與傳統(tǒng)的水煎、回流相比，超聲波提取具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）提取溫度低：超聲波提取中藥材有效成份的最佳溫度為20～60℃，對(duì)熱不穩(wěn)定、易水解或氧化的有效成份具有保護(hù)作用，同時(shí)節(jié)省能耗；（2）提取時(shí)間短：通常在20～40min即可獲得最佳提取效果，較傳統(tǒng)水煎、回流的提取方法縮短提取時(shí)間；（3）提取效率高：超聲波獨(dú)具的物理特性促使動(dòng)植物細(xì)胞組織破壁或變形，使有效成分提取更充分，提取率與傳統(tǒng)提取方法相當(dāng)或更高；（4）適應(yīng)性廣：超聲波提取中藥材不受成份極性、分子量大小的限制，適用于絕大數(shù)種類中藥材和各類成份的提取。

由于地龍的有效成份酶類（如纖維蛋白溶解酶、蚓激酶）等為熱敏成份，高溫情況下易被破壞降解，用超聲波提取技術(shù)進(jìn)行常溫或低溫提取，可以有效保留地龍的抗血栓活性成分，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量，保證產(chǎn)品療效，并適合大生產(chǎn)的需要。本試驗(yàn)通過(guò)提取方式選擇和正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化和確定了超聲波提取地龍抗血栓部位的工藝條件，對(duì)于今后開發(fā)利

用地龍及相關(guān)新產(chǎn)品的開發(fā)有重要的意義。

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油田化學(xué)

Study on extraction of anti-thrombotic site from Pheretima by ultrasonic method

ZHENG Shun-liang，LIU Dong-ming，WANG Si-yao
（Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co.,Ltd., Mudanjiang 157013, China）

Abstract：In this study，the ultrasonic extraction of anti-thrombotic site from Pheretima was optimized by extracting mode and orthogonal design test using the fibrinolysin activity and ratio of dry extraction as index. Ratio of material to liquid, extraction temperature, extraction time and other factors were investigated. The optimum extraction condition has been established as follows: using water as extraction solvent, ratio of material to liquid 1∶12 / 1∶10, extraction temperature 25℃, extraction time 40min. Validation test showed that the optimized process is stable and high efficient.

Key words：Pheretima；anti-thrombotic site；ultrasonic extraction；fibrin plate method；orthogonal experiment

作者簡(jiǎn)介：鄭順亮（1984-），男，浙江溫州瑞安，（制藥）工程師、碩士，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。

收稿日期：2016-01-30

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq. 20160374

中圖分類號(hào)：R961

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A