四特酒大曲中枯草芽孢桿菌的益生特性研究

嚴美婷，李海閩，張超鳳，杜　霞，張鳳英（江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，江西南昌330045）

?

四特酒大曲中枯草芽孢桿菌的益生特性研究

嚴美婷，李海閩，張超鳳，杜霞，張鳳英
（江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，江西南昌330045）

摘要：在四特酒大曲中分離純化出4株細菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌。通過采用體外模擬動物胃腸道環(huán)境的方法，對該4株枯草芽孢桿菌的益生特性（對酸、膽鹽的耐受性及抑菌效果和產(chǎn)酶特性）進行研究。結(jié)果表明，其中有2株枯草芽孢桿菌具有較強的耐酸和耐膽鹽能力，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用，分解淀粉酶和蛋白酶的能力也較高。因此，可判斷這兩株枯草芽孢桿菌具有較好的益生特性。

關(guān)鍵詞：四特酒曲；枯草芽孢桿菌；益生特性

近年來，由于抗生素的過度使用，從而使得很多細菌產(chǎn)生了耐藥性。而益生菌具有提高人體和動物免疫力、降低血脂、促進人體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、預防和治療腹瀉及便秘、抑制腸道病原菌及腐敗微生物的生長、分解致癌物質(zhì)等作用[1]。

其中枯草芽孢桿菌可以作為很好的益生菌菌種，它是農(nóng)業(yè)部公布的16種可直接飼喂動物的飼料級益生菌菌種之一[2]。它能在動物腸道中生長，促進腸道內(nèi)正常菌群的繁殖及抑制致病菌，其代謝產(chǎn)物能調(diào)節(jié)宿主腸道內(nèi)微生物的平衡，且對宿主有益、無毒性、無致病作用[3]。

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，微生態(tài)制劑已成為熱門研發(fā)課題，它已應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥保健、飼料和食品等各領(lǐng)域中。我國農(nóng)業(yè)部在2003年公布了十幾種能用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑的菌種，主要有芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、糞鏈球菌和酵母[4]。

目前，絕大多數(shù)益生菌菌株都是從動物腸道中獲得，少數(shù)從自然界中分離得到，其實大曲中有益微生物種源非常豐富，但從中國酒曲中分離益生菌的報道卻很少。因此本實驗試圖從四特酒大曲中分離獲取到有用的益生菌；分離到菌株后再采用體外模擬動物胃腸道環(huán)境，探討其益生特性，即耐酸性、耐膽鹽能力、產(chǎn)酶特性及對常見病原菌的抑制作用[5-6]，從而初步判斷其能否作為益生菌，為以后生產(chǎn)微生態(tài)制劑提供了一定的科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

菌株：枯草芽孢桿菌T1、T2、T3、T4由四特酒大曲中分離純化而來；大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由江西農(nóng)業(yè)大學食品微生物實驗室提供。

試劑：牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、酪蛋白、三號膽鹽均為生化試劑；磷酸氫二鈉、氯化鈉、葡萄糖、可溶性淀粉均為分析純。

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂15～17 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.4，0.1 MPa滅菌20 min。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基無需加瓊脂。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH值自然，0.1 MPa滅菌20 min。

淀粉瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂15 g/L，NaCl 5 g/L，可溶性淀粉2 g/L，pH7.2，0.1 MPa滅菌20 min。

酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基[7]：牛肉膏3 g/L，酪蛋白10 g/L，瓊脂2 %，NaCl 5 g/L，將pH值調(diào)成7.4后，再加入磷酸二氫鈉2 g，0.4 %溴麝香草酚藍溶液12.5 mL。

豬膽鹽培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中加入0.3 %（w/v）的膽鹽，121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

1.2實驗方法

1.2.1耐酸性測定

取適量10 %左右的鹽酸，分別用蒸餾水將pH值調(diào)為2.0、3.0、4 .0，制成人工胃液，121℃、0.1 MPa滅菌15 min，冷卻備用。將分離純化得到的4株枯草芽孢桿菌T1、T2、T3、T4活化并制成細菌含量為1.92×109cfu/mL的菌懸液，然后各以10 %的接種量接于不同pH值的人工胃液中，37℃下180 r/min進行搖瓶培養(yǎng)，分別在0 h、1 h、2 h、2.5 h取出相應(yīng)的菌液進行平板菌落計數(shù)，測定其活菌數(shù)和存活率。

1.2.2膽鹽耐受性測定

將4株枯草芽孢桿菌制成細菌含量1.79×109cfu/mL的菌懸液后，各以10 %的接種量接入已配好的豬膽鹽培養(yǎng)基中，37℃下180 r/min進行搖瓶培養(yǎng)，分別于0 h、1 h、2 h、2.5 h取出相應(yīng)的菌液，進行平板菌落計數(shù)，測定其活菌數(shù)并計算存活率。

1.2.3抑菌試驗

將活化培養(yǎng)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌制成細菌含量分別為1.8×108cfu/mL和1.2×108cfu/mL的菌懸液。然后將制備好的致病菌菌懸液各自稀釋10倍、100倍和1000倍，再分別取0.2 mL菌液于培養(yǎng)皿中，倒入培養(yǎng)基混勻，待其凝固后立即分別將4株枯草芽孢桿菌點種于平板中（接入極少量即可）進行抑菌實驗，待其培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈大小并測量其直徑。

1.2.4產(chǎn)酶特性試驗

將T1、T2、T3、T4分別點種于淀粉瓊脂培養(yǎng)基、酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板上，放入恒溫箱培養(yǎng)24 h后，觀察并測定其水解圈直徑(J)和菌落直徑(K)的大小，計算出J/K比值。

將T1、T2、T3、T4分別接入麩皮中培養(yǎng)48 h，然后將其倒入已滅菌的信封中烘干備用。稱10 g米粉加入100 mL水，將其在熱水浴中蒸成糊狀，然后稱0.5 g樣品放入其中攪勻，一段時間后觀察其液化能力。

1.3數(shù)據(jù)分析

用DPS v6.55版統(tǒng)計軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行分析處理，采用新復極差分析法對各組數(shù)據(jù)進行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1耐酸性研究

動物的胃中含有較多的胃酸，其pH值范圍為2.6～5.83[8]，要想讓益生菌在動物體內(nèi)發(fā)揮作用，就必須保證其在到達腸胃的過程中不被動物體內(nèi)的胃酸環(huán)境所殺死。因此選擇益生菌時首先要考慮菌株是否具有較強的耐酸性，是否能夠耐受胃液，以較高的存活率到達腸內(nèi)。4株枯草芽孢桿菌在不同pH值情況下，與人工胃液作用不同時間后，所測得的活菌數(shù)及存活率見表1、表2。

表1　不同pH值處理對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響(lg cfu/mL)

表2　不同pH值處理對枯草芽孢桿菌存活率的影響　(%)

由表1可知，T1在pH值為2.0～4.0的人工胃液中，其活菌數(shù)無明顯差異（P＜0.05），而T2、T3、T4這3株菌的活菌數(shù)都差異顯著，它們的活菌數(shù)都隨著pH值的降低而降低。并且這4株菌的活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時間的增加而顯著降低（P＜0.05）。表2顯示T1菌在pH值為2.0的人工胃液中培養(yǎng)2.5 h后其存活率較高，達到了31.74%，T3的存活率也達到了25.39 %，因此說明T1和T3具有耐酸性。而T2和T4在各pH值下培養(yǎng)2.5 h后其存活率分別只在8.70 %～21.83 %和2.45 %～21.07 %之間，由此說明T2和T4與T1、T3這2株菌相比耐酸性較差。

2.2膽鹽耐受性研究

消化道中分泌的膽汁是益生菌發(fā)揮作用的另一個障礙，人體及動物十二指腸內(nèi)食糜中膽汁鹽含量在0.03 %～0.3 %之間[9]，要想讓益生菌在消化道內(nèi)高效地發(fā)揮作用，其菌體就必須能耐受0.3 %(w/v)的膽鹽環(huán)境，益生菌才能在通過胃進入腸道后還能保持足夠的活菌數(shù)，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡的作用。4株枯草芽孢桿菌在0 h、1 h、2 h、2.5 h內(nèi)對0.3 %(w/v)豬膽鹽的耐受性結(jié)果見表3、圖1。

表3　膽鹽對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響　(lg cfu/mL)

圖1　膽鹽對枯草芽孢桿菌存活率的影響

由表3、圖1可看出，隨著培養(yǎng)時間的增加，4株菌的活菌數(shù)都在下降，特別是T2和T4，膽鹽對它們的影響很大，在培養(yǎng)2.5 h后，它們的活菌率分別只有8.68 %和6.02 %。而T1及T3菌卻不同，它們在培養(yǎng)2.5 h后，活菌數(shù)仍在107cfu/mL以上。由此可知，T2和T4不耐膽鹽，但T1和T3對膽鹽的耐受性較好。

2.3抑菌效果研究

益生菌及其代謝產(chǎn)物對人和動物有很好的益生作用，它不但能抑制腸道病原菌和腐敗微生物的生長，而且還能提高人和動物的免疫力。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是環(huán)境中最常見的2種致病菌，容易使人患上腸道疾病，而濫用抗生素藥物容易導致耐藥菌株的增加，會引起人和動物的胃腸功能紊亂，使患者的免疫力下降[10-11]，因此益生菌比藥更加安全。4株枯草芽孢桿菌對不同菌落總數(shù)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用結(jié)果見表4。

表4　枯草芽孢桿菌對病原菌的抑制作用　(mm，n=3)

抑菌圈的大小分別代表著4株枯草芽孢桿菌的抑菌效果，其抑菌圈越大，抑菌效果就越好。本實驗探究了4株枯草芽孢桿菌對不同菌落總數(shù)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。由表3可看出，T1和T3對這2種病原菌都有較強的抑制作用，而T2和T4的抑菌作用較弱。通過統(tǒng)計分析可知，在大腸桿菌菌落數(shù)為1.8× 107cfu/mL左右時，T1和T3對其抑制作用最強，抑菌圈直徑分別達到了26.15 mm和35.05 mm。這2株菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用是在金黃色葡萄球菌菌落數(shù)為1.2×105cfu/mL左右時最強。

2.4產(chǎn)酶特性研究

在飼料中添加益生菌，它所產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶能將飼料分解成小分子，從而能有效地提高飼料的營養(yǎng)價值和消化吸收率[12]。因此益生菌在飼料工業(yè)中發(fā)揮著極其重要的作用，它代表著新型飼料添加劑的發(fā)展方向。4株枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶能力見圖2。

圖2　4株枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶特性

由圖2可知，從四特酒大曲中分離出的4株枯草芽孢桿菌中，T1和T3這2株菌分解蛋白酶、淀粉酶的能力較強，尤其是分解蛋白酶的能力更強，其中T1的酪蛋白瓊脂平板的水解圈直徑(J)與菌落直徑(K)的比值大小為3.52，T3的J/K值達到了3.26。而T2和T4相對于T1、T3來說，它們分解這2種酶的能力較弱，特別是T2幾乎不分解蛋白酶。且通過液化能力實驗結(jié)果表明，它們的液化能力大小排序為T3＞T1＞T2≈T4。因此，可以初步判斷T1和T3枯草芽孢桿菌能作為用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑的菌種，它們分解蛋白酶和淀粉酶的能力較強，能應(yīng)用于動物飼料的生產(chǎn)中，改善飼料的利用率，從而促進動物的生長。

3　結(jié)論

本實驗結(jié)果顯示，從四特酒大曲中分離出的4株枯草芽孢桿菌中，T1和T3具有較強的耐酸性，它們在不同pH值條件下培養(yǎng)2.5 h后其活菌數(shù)仍達到了107cfu/mL以上，存活率都在25 %以上；并對0.3 %的膽鹽也具有耐受性，經(jīng)試驗處理后，其存活率分別保持在30.69 %和46.14 %。

同時T1和T3對病原菌大腸桿菌及金黃色葡萄球菌都具有較好的抑制作用，并且對細菌含量不同的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果不同，其中T1和T3對菌落總數(shù)為1.8×107cfu/mL左右的大腸桿菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑分別達到了26.15 mm和35.05 mm，而它們對金黃色葡萄球菌的抑制作用是在菌落總數(shù)為1.2× 107cfu/mL左右時最好，抑菌圈直徑分別為12.67 mm和27.15 mm。T1和T3枯草芽孢桿菌分解蛋白酶和淀粉酶的能力也較強，尤其是分解蛋白酶，其J/K值都在3.0以上。

T2及T4菌不耐酸，在pH值為2.0的人工胃液中處理2.5 h后，存活率分別僅為8.70 %和2.45 %；也不耐膽鹽，經(jīng)試驗處理后存活率低，只達到了8.68 %和6.02 %；對腸道病原菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用也不好，尤其是T2對大腸桿菌的抑制作用最弱；T2幾乎不分解蛋白酶，分解淀粉酶的能力也弱，T4雖然分解這2種酶，但分解能力很差。

因此，根據(jù)本實驗結(jié)果可初步判斷，從四特酒大曲中分離出的4株枯草芽孢桿菌中，T1和T3的益生特性比較好，具有較高的研究開發(fā)價值。

參考文獻：

[1]王旭明,陳宗澤,袁毅.益生菌作用機理的研究進展[J].吉林農(nóng)業(yè)科學,2002(1)：50-53.

[2]楊鋒,章亭洲.枯草芽孢桿菌生物學特性的研究[J].飼料研究, 2011(3)：34-36.

[3]汪海峰,王井亮,王翀,等.一株腸源枯草芽孢桿菌的生長、抗逆和產(chǎn)酶特性分析[J].中國畜牧雜志,2012(17)：66-70.

[4]曹鈺,孫玲玲,陸健.酸與膽汁耐性芽孢益生菌的篩選[J].飼料研究,2006(12)：31-34.

[5]楊霞,陳陸,杜魏紅,等.鄭州部分市售酸奶中乳酸菌的分離鑒定與益生特性的研究[J].中國微生態(tài)學雜志,2011(2)：117-121.

[6]王津,楊燕萍,王葉琛,等.母豬糞便中乳酸菌菌株體外益生特性初步研究[J].中國飼料,2014(14)：20-24.

[7]劉慧.現(xiàn)代食品微生物學實驗技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,2006：248-252.

[8]姚勇芳,廖延智,陳小鳳,等.枯草芽孢桿菌Y-生長特性及抗性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2013,41(28)：395-398.

[9] Wasson K, Criley J M, Clabaugh M B, et al. Therapeutic efficacy of oral lactobacillus preparation for antibioticassociated enteritis in guinea pigs[J].Contemp Top LABAnim Sci, 2000, 39(1)：32-38.

[10]羅曉花,孔新文.益生素作用機理及目前應(yīng)用情況[J].飼料博覽,2007(9)：16-19.

[11]王城,趙杰,李旋亮,等.枯草芽孢桿菌對禽舍分離致病菌的抑菌作用研究[J].中國農(nóng)學通報,2010,26(3)：23-26.

[12]孫笑非,孫巖冬,潘寶海.1株豬源性枯草芽孢桿菌生長特性的研究[J].飼料研究,2013(6)：44-45.

“新品速遞”——安琪釀造新品涉足新領(lǐng)域

本刊訊：近年來，湖北安琪公司在釀造領(lǐng)域始終致力于發(fā)酵專家形象的建設(shè)，先后開發(fā)了安琪超級釀酒高活性干酵母、安琪釀酒曲等王牌產(chǎn)品。

此次安琪公司再次推出安琪耐高溫醬油酵母、安琪白酒曲，宣告以新的應(yīng)用進入新領(lǐng)域。

安琪耐高溫醬油酵母2015年初，安琪公司作為第一承擔者實施的“高耐性酵母關(guān)鍵技術(shù)研究與產(chǎn)業(yè)化”項目獲得國家科學技術(shù)進步二等獎。近日，作為對項目成果的重要延伸，安琪公司推出耐高溫醬油酵母。

安琪耐高溫醬油酵母主要應(yīng)用于中國傳統(tǒng)醬類生產(chǎn)，包括原池澆淋、廣式醬油、東北大醬等多個應(yīng)用領(lǐng)域。針對國內(nèi)醬油（醬）釀造工藝特點，耐高溫醬油酵母可以彌補由于釀造溫度過高導致的釀造缺陷，對香氣和滋味上帶來顯著提升。

安琪白酒曲是繼安琪釀酒曲之后，再次推出的復合型酒曲類產(chǎn)品，應(yīng)用于白酒、醋類生產(chǎn)。

與釀酒曲應(yīng)用于工業(yè)大生產(chǎn)不同，安琪白酒曲主要針對小型設(shè)備、手工釀酒，通過對酵母、霉菌、酶等微生物的復合，彌補了釀酒曲在小批量生產(chǎn)中存在的不足，是對安琪產(chǎn)品在白酒生產(chǎn)領(lǐng)域的補充。（皮聰）

Study on Probiotic Properties of Bacillus subtilis Isolated from Site-flavor Daqu

YAN Meiting, LI Haimin, ZHANG Chaofeng, DU Xia and ZHANG Fengying
(College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi 330045, China)

Abstract:In this study, 4 bacteria strains were isolated from Site-flavor Daqu and then identified as different strains of Bacillus subtilis. The probiotic properties (the tolerance of acid and cholate, antibacterial effects and enzyme-producing properties) of the four strains were studied by simulating animal gastrointestinal environment in vitro. The results showed that, 2 of the 4 acillus subtilis strains had strong tolerance of acid and cholate, they could effectively inhibit Escherichia coli and Staphylococcus aureus; and they also had higher decomposition capability of amylase and protease. Therefore, these 2 Bacillus subtilis strains had better probiotic properties.

Key words:Site-flavor Daqu；Bacillus subtilis；probiotic properties

作者簡介：嚴美婷（1992-），女，江西新余人，在讀碩士，研究方向：食品微生物。

收稿日期：2015-11-16

DOI：10.13746/j.njkj.2015437

中圖分類號：TS262.3；TS261.1

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）03-0057-04

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-01-22；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160122.1012.006.html。