黃水醋飲生產(chǎn)工藝研究

王永偉，謝　杰，張聰芝，蔣紅菊，冷云偉（.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷3800；.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州6）

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黃水醋飲生產(chǎn)工藝研究

王永偉1，謝杰1，張聰芝1，蔣紅菊1，冷云偉2
（1.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800；2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州221116）

摘要：探索了利用白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水生產(chǎn)一種醋飲的工藝，通過(guò)采用生物轉(zhuǎn)化、多菌種協(xié)同發(fā)酵等生物學(xué)手段，結(jié)合釀酒技術(shù)及傳統(tǒng)制醋工藝，研究確定了黃水生物轉(zhuǎn)化液及輔型米酒生產(chǎn)的最佳工藝條件，并將這2種發(fā)酵液按照7∶3的特定比例進(jìn)行混合，通過(guò)采用固態(tài)有氧發(fā)酵方式，即可制得醋飲。該研究對(duì)于黃水高附加值研究及深加工應(yīng)用具有一定的理論及實(shí)踐指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：黃水；生物轉(zhuǎn)化；醋母；酒母；輔型米酒；醋飲

白酒在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物黃水，對(duì)于黃水的回收利用，部分企業(yè)只是針對(duì)黃水中大量的醇、醛、酸、酯中的一種或幾種成分進(jìn)行蒸餾、濃縮、提取，黃水的附加效益沒(méi)能得到最大限度的發(fā)揮，且經(jīng)過(guò)蒸餾濃縮后的黃水仍含有大量糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等有機(jī)物，排放后仍會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，沒(méi)能從根本上解決黃水的污染問(wèn)題。由于形成黃水COD的主要成分為含量在百分級(jí)別的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等大分子組分，而非以往得到普遍關(guān)注的芳香性組分，因此，有關(guān)黃水綜合利用的一個(gè)方向可以是將高含量組分通過(guò)生物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移到產(chǎn)品中去，從而達(dá)到徹底轉(zhuǎn)移COD的目的。

本試驗(yàn)的研究是利用黃水通過(guò)多途徑生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)一種黃水醋飲，將黃水中含有的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、多肽、有機(jī)酸、各種醇酯等芳香化合物進(jìn)行最大程度的微生物轉(zhuǎn)化利用，生產(chǎn)出一種醋飲，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)黃水的零排放。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

黃水生物轉(zhuǎn)化菌種：13h，ah，52#選育于洋河酒廠黃水及酒醅中，保藏于微生物實(shí)驗(yàn)室。

釀酒酵母：CGMCC NO.2.399，Saccharomyces cerevisiae。

醋酸菌：CGMCC NO.1.41,巴氏醋桿菌, Acetobacter pasteurianus。

原料：黃水（洋河酒廠）、大米、麩皮、稻殼、食用酒精、硅藻土、α-淀粉酶、復(fù)合糖化酶。

試劑：蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、瓊脂粉、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、葡萄糖、MgSO4?7H2O、MnSO4?4H2O、Acetozym營(yíng)養(yǎng)鹽。

儀器設(shè)備：5 L生物反應(yīng)器、10～100 L多功能生物反應(yīng)器、40 L保溫滅菌罐、自吸通風(fēng)發(fā)酵罐、500 L固態(tài)發(fā)酵裝置、日立L-8900高速氨基酸分析儀、高效液相色譜儀、氣相色譜儀、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋、XK24-006-0058電熱恒溫箱、SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)、立式壓力蒸汽滅菌器、pHS-3C型精密酸度計(jì)、厭氧培養(yǎng)操作箱、分光光度計(jì)、數(shù)字生物顯微鏡。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1工藝流程

本實(shí)驗(yàn)采用以下工藝流程：

1.2.2工藝要點(diǎn)

1.2.2.1黃水轉(zhuǎn)化用生物菌液制備

將13h，ah，52#混合三角瓶種子液（三者的比例為1∶2∶1）按8 %～10 %的接種比例接入經(jīng)高壓滅菌（滅菌條件121℃，0.15 MPa，30 min）的發(fā)酵罐（發(fā)酵罐培養(yǎng)基由MRS培養(yǎng)基和黃水依7∶3比例組成）中培養(yǎng)，溫度控制在31～33℃，靜置培養(yǎng)42～45 h，得到黃水轉(zhuǎn)化用生物菌液；鏡檢菌體數(shù)量保持在109個(gè)/mL以上，菌體肥大、整齊，雜菌率≤2 %。

1.2.2.2酒母制備

將釀酒酵母(CGMCC NO.2.399，Saccharomyces cerevisiae)三角瓶種子液按照8 %～10 %的接種比例接入發(fā)酵罐（發(fā)酵罐培養(yǎng)基由玉米糖化醪培養(yǎng)基和黃水依6∶4(v/v)比例組成）中培養(yǎng)，發(fā)酵罐溫度控制在28～30℃，轉(zhuǎn)速控制在100～120 r/min，培養(yǎng)20～24 h，得到酒母；鏡檢菌體數(shù)量保持在108個(gè)/mL以上，酵母菌體肥大、整齊，出芽率≥20 %，菌液中桿菌比例≤2 %。

1.2.2.3“醋母”制備

將醋酸菌（CGMCC NO.1.41,巴氏醋桿菌, Acetobacter pasteurianus）三角瓶種子液按照8 %～10 %的接種比例接入經(jīng)高壓滅菌（滅菌條件121℃，0.15 MPa，30 min）的發(fā)酵罐中（發(fā)酵罐培養(yǎng)基由牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和黃水依質(zhì)量比1∶1(v/v)組成）培養(yǎng)，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度控制在30～32℃，轉(zhuǎn)速控制在120～140 r/min，培養(yǎng)46～48 h，得到醋母；鏡檢菌體數(shù)量保持在109個(gè)/mL以上，菌體肥大、整齊、呈典型桿狀，雜菌率≤2 %。

1.2.2.4黃水預(yù)處理及生物轉(zhuǎn)化

將收集的新鮮黃水進(jìn)行自然沉降3～5 h，除去固形物雜質(zhì)，黃水中補(bǔ)充0.04 %(m/v，g/100 mL)MgSO4，0.2 % (m/v，g/100 mL)K2HPO4后,然后按照接種量9 %～13 %的比例接入1.2.2.1制備的生物菌液，調(diào)節(jié)黃水pH值，控制發(fā)酵溫度28～36℃，發(fā)酵時(shí)間36～60 h，制得黃水生物轉(zhuǎn)化液。

1.2.2.5大米液化、糖化

大米粉碎至80目，依質(zhì)量比1∶4加自來(lái)水，調(diào)節(jié)pH值為6.2～6.5，添加大米粉質(zhì)量0.02 %～0.04 %的2萬(wàn)U/g α-淀粉酶，90～93℃液化15 min；冷至58～60℃；調(diào)節(jié)大米液化液pH4.5～4.8，添加大米粉質(zhì)量0.2 %的2萬(wàn)U/g糖化酶，在58～60℃保溫糖化4 h，得大米糖化醪。

1.2.2.6輔型米酒生產(chǎn)

將1.2.2.5制備好的大米糖化醪液按9 %(v/v)～11 %(v/v)接種量接入步驟1.2.2.2制備的酒母，發(fā)酵溫度控制在28～32℃，發(fā)酵48～60 h，制得輔型米酒。

1.2.2.7黃水醋飲生產(chǎn)（有氧發(fā)酵）

將1.2.2.4生產(chǎn)的黃水生物轉(zhuǎn)化液與步驟1.2.2.6生產(chǎn)的輔型米酒按照特定的比例進(jìn)行混合，然后按照8 %(v/v)～10 %(v/v)接種量的比例接入步驟1.2.2.3制備的醋母，控制溫度39～41℃，發(fā)酵10～15 d；發(fā)酵結(jié)束，經(jīng)過(guò)后續(xù)的除雜、澄清、陳放，得黃水醋飲。

1.3分析測(cè)定法

酒精度的測(cè)定，蒸餾法；酸的測(cè)定，滴定法；氨基氮的測(cè)定，甲醛法；還原糖測(cè)定，DNS（3,5-二硝基水楊酸）法；氨基酸測(cè)定，AccQ-Tag法；菌落總數(shù)的測(cè)定，平皿培養(yǎng)法；二氧化碳測(cè)定，失重法。

2　結(jié)果與討論

2.1混菌黃水生物轉(zhuǎn)化最佳工藝條件的確定

為了確定混合菌株模式13h+ah+52#（2∶1∶1）進(jìn)行黃水生物轉(zhuǎn)化的最佳工藝條件，進(jìn)行了4因素3水平正交試驗(yàn)。

表1　因素水平表

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，混合菌株模式13h+ah+52#（2∶1∶1）進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的最佳工藝條件為接種量13 %，發(fā)酵溫度32℃，黃水pH6.0，發(fā)酵時(shí)間48 h，在此條件下，黃水中的還原糖利用率可達(dá)72.8 %。

黃水生物轉(zhuǎn)化液經(jīng)過(guò)120℃油浴蒸餾提取后，進(jìn)氣相色譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙酸和乳酸含量明顯上升，分別達(dá)到了496.97 mg/100 mL和603.03 mg/100 mL。

2.2輔型米酒最佳工藝條件的研究

2.2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1酒母接種量對(duì)輔型米酒品質(zhì)的影響

圖1　接種量對(duì)米酒發(fā)酵的影響

由圖1可知，接種量少時(shí)，米酒發(fā)酵液酒精度較低，但酸度較高。因?yàn)榻臃N量過(guò)少導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)緩慢、發(fā)酵困難，另外易染雜菌，從而使米酒中混有異味。從圖1可以看出，酸度和酒精度隨接種量加大而升高，當(dāng)接種量超過(guò)10 %時(shí)，由于接種量過(guò)大，米酒發(fā)酵液溫度上升速度快，酵母菌大量繁殖，發(fā)酵體系失去平衡，米酒有明顯的酸味，酒精度也開(kāi)始下降。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取10 %為最適接種量。

2.2.1.2發(fā)酵溫度對(duì)輔型米酒品質(zhì)的影響

圖2　溫度對(duì)米酒發(fā)酵的影響

由圖2可知，發(fā)酵溫度為較低時(shí)，發(fā)酵液酒精度和總酸都較低。隨著溫度的升高，總酸和酒精度都明顯升高。當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到28℃時(shí)，總酸生成速度變緩，酒精度達(dá)到最高。隨著溫度的繼續(xù)升高，酒精度明顯下降，而總酸繼續(xù)上升，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高或感染雜菌，產(chǎn)酸量增大。結(jié)合輔型米酒的口感綜合考慮，選取最適發(fā)酵溫度為28℃。

2.2.1.3發(fā)酵時(shí)間對(duì)米酒品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中酸度隨時(shí)間逐漸上升，酒精度上升較快。發(fā)酵時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，代謝過(guò)程變緩慢，同時(shí)易感染雜菌，導(dǎo)致輔型米酒品質(zhì)下降。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取最適發(fā)酵時(shí)間48 h。

圖3　發(fā)酵時(shí)間對(duì)米酒發(fā)酵的影響

2.2.2輔型米酒最佳工藝條件的確定

表3　輔型米酒發(fā)酵試驗(yàn)因素水平表

表4　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表4可以看出，以酒精度作為輔型米酒最佳工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)，最佳組合為B3A1C3，即發(fā)酵溫度32℃、接種量9 %、發(fā)酵時(shí)間60 h。

2.3制醋工藝研究

2.3.1好氧發(fā)酵工藝的確定

好氧發(fā)酵過(guò)程有液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵2種形式，其中液態(tài)發(fā)酵采用分割連續(xù)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵采用間歇式批量發(fā)酵，2種發(fā)酵試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)比見(jiàn)圖4、圖5。

從轉(zhuǎn)化率來(lái)看，使用液態(tài)發(fā)酵方式乙醇氧化成乙酸的轉(zhuǎn)化率明顯高，基本可以達(dá)到95 %以上。不過(guò)從風(fēng)味來(lái)看，由于液態(tài)發(fā)酵時(shí)間短，溶液中的乙醇在短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化為乙酸，但芳香性成分的氧化程度明顯不夠，風(fēng)味的改變不是很大，尤其是黃水氣味比較明顯，大大地影響了產(chǎn)品的品質(zhì)。為此，本研究中使用傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)。

2.3.2黃水生物轉(zhuǎn)化液與輔型米酒配比研究

在黃水醋的生產(chǎn)過(guò)程中，確定了采用傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵方式，但黃水與米酒需按適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行混合，這樣在有氧發(fā)酵過(guò)程中，兩者的成分才能達(dá)到互相補(bǔ)充，“醋母”才能充分利用黃水與米酒中的成分，并且進(jìn)行合理充分轉(zhuǎn)化，從而使得所產(chǎn)醋的香味成分含量適宜，產(chǎn)品香味豐滿協(xié)調(diào)。

圖4　液態(tài)發(fā)酵的成分變化

圖5　固態(tài)發(fā)酵的成分變化

為了確定黃水轉(zhuǎn)化液與米酒最佳的配比組合，研究中采用不同比例的組合，按接種量10 %的比例接入“醋母”，控制發(fā)酵溫度39℃，發(fā)酵時(shí)間12 d，發(fā)酵終了測(cè)定發(fā)酵液中的總酸、固形物含量及氨基氮等指標(biāo)。其結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　不同配比理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果　(g/100 mL)

從表5可以看出，當(dāng)黃水轉(zhuǎn)化液與米酒的比例為7∶3時(shí)，發(fā)酵液中的各指標(biāo)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其他比例，因此黃水制醋的最佳配比為黃水轉(zhuǎn)化液∶米酒=7∶3，經(jīng)后續(xù)的除雜，澄清，即得醋飲產(chǎn)品。

2.3.3醋飲產(chǎn)品指標(biāo)分析

表6和表7為按照食醋標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)分析，從分析結(jié)果可以看出，本實(shí)驗(yàn)獲得的醋飲產(chǎn)品具有良好的感官指標(biāo)，理化指標(biāo)亦合格。

該醋飲產(chǎn)品融合了現(xiàn)代釀醋技術(shù)，其具備一般醋的口感與香味，同時(shí)使用的原料主要是白酒副產(chǎn)物黃水，兼有白酒中特有的窖香、曲香、酯香、醇香，該產(chǎn)品是一種酒醋有機(jī)融合的復(fù)合飲品，其酸味純正柔和，入口甜潤(rùn)甘美。

表6　感官指標(biāo)分析

表7　醋飲產(chǎn)品理化指標(biāo)分析　(g/100 mL)

尤其是從理化指標(biāo)可以看出，本產(chǎn)品中不揮發(fā)性酸的比例明顯高，從而表現(xiàn)為柔和的酸味，遠(yuǎn)沒(méi)有乙酸的刺激，為應(yīng)用創(chuàng)造了條件。另外，由于黃水中具有一定數(shù)量的蛋白質(zhì)和蛋白酶，因此表現(xiàn)出產(chǎn)品具有氨基酸組分，經(jīng)過(guò)氨基酸分析表明（見(jiàn)圖6），氨基酸種類(lèi)合理，為產(chǎn)品適宜的口感做出了貢獻(xiàn)，同時(shí)也使產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)性得到體現(xiàn)。

圖6　氨基酸分析圖譜

另外，通過(guò)使用多功能食品安全快速測(cè)定箱對(duì)本研究產(chǎn)品的黃曲霉毒素、重金屬、致病菌等安全性指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，全部顯示為陰性或低于指標(biāo)值，說(shuō)明本產(chǎn)品的安全性是有所保障的。從整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程來(lái)看，沒(méi)有添加任何化學(xué)產(chǎn)品，且黃水本身來(lái)自酒窖之中，其前身是糧食，發(fā)酵過(guò)程也為食品生產(chǎn)過(guò)程，不會(huì)形成系統(tǒng)性毒害物質(zhì)。

3　結(jié)論

3.1黃水生物轉(zhuǎn)化最佳工藝條件

采用菌株13h，52#，ah進(jìn)行黃水生物轉(zhuǎn)化的最佳工藝條件為：黃水中補(bǔ)充0.04 % MgSO4, 0.2 % K2HPO4后，調(diào)節(jié)pH值為6.0，按照ah∶13h∶52#=1∶2∶1的比例，接種量為13 %，32℃發(fā)酵48 h，降糖幅度可達(dá)70 %，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中的丙酸和乳酸含量達(dá)到了496.97 mg/100 mL和603.03 mg/100 mL。

3.2輔型米酒最佳工藝條件

確定了黃水醋輔型米酒最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度32℃、接種量9 %、發(fā)酵時(shí)間60 h。

3.3黃水醋飲產(chǎn)品

確定了黃水制醋中黃水轉(zhuǎn)化液與米酒的最佳配比為7∶3，在此種配比下，發(fā)酵液中總酸、固形物含量及氨態(tài)氮的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他比例，且發(fā)酵產(chǎn)品顏色呈深黃色，無(wú)刺激酸味，醇厚釀香，酸味適中柔和，并且通過(guò)使用多功能食品安全快速測(cè)定箱對(duì)本研究產(chǎn)品的黃曲霉毒素、重金屬、致病菌等安全性指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，全部顯示為陰性或低于指標(biāo)值。

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The Production of Vinegar Drink by Yellow Water

WANG Yongwei1, XIE Jie1，ZHANG Congzhi1，JIANG Hongju1and LENG Yunwei2
(1.Yanghe Distillery Co.Ltd., Suqian, Jiangsu 223800; 2.School of Chemical Engineering and Technology, China University of Mining & Technology, Xuzhou, Jiangsu 221116, China)

Abstract:In this study, the use of liquor fermentation by-product, yellow water, to produce vinegar drink was explored. Yellow water biotransformation solution and auxiliary rice wine were prepared through biotransformation and mixed fermentation of multiple bacterial species combined with traditional wine-making techniques and vinegar-producing techniques. And the best technical conditions were determined. Then the two kinds of fermenting liquid were mixed at the ratio of 7:3. After solid aerobic fermentation of the mixture solution, vinegar drink was finally produced. Such study was of theoretical and practical significance in deep processing and high value-added research of yellow water.

Key words:yellow water; biotransformation; acetic acid bacteria; yeast; auxiliary rice wine; vinegar drink

作者簡(jiǎn)介：王永偉（1983-），男，山西忻州人，工程師，主要從事微生物應(yīng)用研究。

收稿日期：2015-08-18

DOI：10.13746/j.njkj.2015343

中圖分類(lèi)號(hào)：TS262.3；TS261.9；X797

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）03-0052-05

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-02-15；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160215.1447.003.html。