基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在糖尿病足創(chuàng)面皮膚的表達(dá)水平及其臨床意義※

安玉蘭，鄧麗君，孫 晴，靳生艷，李青紅，陳麗麗，黃寧慶，陸 川，程 蓉

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)科，西寧 810001)

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在糖尿病足創(chuàng)面皮膚的表達(dá)水平及其臨床意義※

安玉蘭，鄧麗君，孫 晴，靳生艷，李青紅，陳麗麗，黃寧慶，陸 川，程 蓉

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)科，西寧 810001)

目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在糖尿病足創(chuàng)面皮膚的表達(dá)水平及其臨床意義。方法 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)8例正常皮膚組織和9例糖尿病足患者創(chuàng)面組織中MMP-2、MMP-8、MMP-9表達(dá)水平；ELISA法檢測(cè)58例正常人和55例糖尿病足患者血清中MMP-2、MMP-8、MMP-9表達(dá)水平，分析其臨床意義。結(jié)果 MMP-2在正常皮膚組織和糖尿病足創(chuàng)面組織中的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)，MMP-8在正常組織中的表達(dá)明顯高于糖尿病足患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MMP-9在正常皮膚組織中的表達(dá)明顯低于糖尿病足創(chuàng)面組織。兩組樣本血清中MMP-2、MMP-8表達(dá)差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，血清MMP-9在糖尿病足患者中的表達(dá)明顯高于正常人，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)論 MMP-8、MMP-9在糖尿病足患者創(chuàng)面組織和血清中的表達(dá)明顯升高，MMP-8、MMP-9可能與糖尿病患者糖尿病足的愈合存在關(guān)聯(lián)。

糖尿病足 MMPs 表達(dá)

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)糖尿病足患者創(chuàng)面組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-8、MMP-9)的表達(dá)水平、ELISA法檢測(cè)糖尿病足患者血清中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-8、MMP-9)的表達(dá)水平，分析糖尿病足創(chuàng)面基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)特點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集青海大學(xué)附屬醫(yī)院2013～2014年確診為糖尿病足的患者及正常人群作為對(duì)照組，糖尿病足患者55例，男30例，女25例，年齡48～66歲。對(duì)照組58例，男33例，女25例，年齡36～70歲。收集皮膚組織用中性甲醛固定、石蠟包埋，4 μm切片。糖尿病足患者及正常人過(guò)夜禁食10 h，清晨空腹抽取靜脈血10 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑及儀器設(shè)備

MMPs抗體試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，二抗Sunpoly-HⅡ聚合物檢測(cè)試劑盒(上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司)，ELISA試劑盒(美國(guó)Genlab公司)，SP免疫組織化學(xué)試劑盒、ZLI-9032濃縮型DAB顯色試劑盒、DAB顯色增強(qiáng)劑(北京中杉生物科技有限公司)，山羊血清(天津市灝洋生物制品科技有限公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，Dh-cg300圖像分析系統(tǒng)(中國(guó)大恒集團(tuán)有限公司)。

1.2.2 方法

將所有病理組織標(biāo)本的石蠟塊連續(xù)切片，厚度約為4 μm，用APES防脫片膠處理的載玻片撈片后置于60 ℃的恒溫烤箱內(nèi)烘烤2 h以上，使組織標(biāo)本與載玻片緊密黏附。組織切片經(jīng)脫臘處理后在0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖溶液中高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù)，然后按SP三步法免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。加入的一抗?jié)舛染鶠?：300。

所有收集血液室溫靜置30 min，離心(2500r/min)15 min分離血清，取3 mL置于-70 ℃冰箱中保存，采用ELISA試劑盒測(cè)定血清MMP-2、MMP-8、MMP-9水平。

1.3 結(jié)果判定方法

在顯微鏡下，我們將細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中存在淺黃色—棕褐色顆粒者認(rèn)定為脂聯(lián)素受體陽(yáng)性，評(píng)分采用半定量方法。每個(gè)切片隨機(jī)觀察8個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。脂聯(lián)素受體檢測(cè)評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，陽(yáng)性細(xì)胞5%～25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞≥25%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞≥50%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞≥75%為4分。按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)相加后判定級(jí)別，0～1分為-，2分為+，3～4分為++，﹥5分為+++。+～+++視為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較行t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2在糖尿病足創(chuàng)面皮膚組織及正常皮膚組織中的表達(dá)水平

MMPs在糖尿病足創(chuàng)面皮膚組織胞質(zhì)均勻表達(dá)，呈棕黃色至棕褐色表達(dá)；在正常皮膚組織胞質(zhì)少量表達(dá)，呈淺黃色至棕黃色表達(dá)。MMP-2的表達(dá)見(jiàn)圖1。糖尿病足患者皮膚組織MMP-2免疫組化顯色反應(yīng)強(qiáng)度比較結(jié)果見(jiàn)表1。正常皮膚組織中MMP-2的平均表達(dá)量為13.55±4.6，糖尿病足患者創(chuàng)面皮膚組織中MMP-2的平均表達(dá)量為15.75±2.3，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 MMP-8在糖尿病足創(chuàng)面皮膚組織及正常皮膚組織中的表達(dá)水平

MMP-8的表達(dá)見(jiàn)圖2。糖尿病足患者皮膚組織MMP-8免疫組化顯色反應(yīng)強(qiáng)度比較結(jié)果見(jiàn)表1。正常皮膚組織中MMP-8的平均表達(dá)量為19.31±3.66，糖尿病足患者創(chuàng)面皮膚組織中MMP-8的平均表達(dá)量為15.71±2.51，正常皮膚組織中MMP-8的平均表達(dá)量明顯高于糖尿病足患者創(chuàng)面皮膚組織中的表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 MMP-9在糖尿病足創(chuàng)面皮膚組織及正常皮膚組織中的表達(dá)水平

MMP-9的表達(dá)見(jiàn)圖3。糖尿病足患者皮膚組織MMP-9免疫組化顯色反應(yīng)強(qiáng)度比較結(jié)果見(jiàn)表1。正常皮膚組織中MMP-9的平均表達(dá)量為11.29±1.92，糖尿病足患者創(chuàng)面皮膚組織中MMP-9的平均表達(dá)量為23.34±2.35，糖尿病足患者創(chuàng)面皮膚組織中的表達(dá)量明顯高于正常皮膚組織中MMP-8的平均表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 MMP-2、MMP-8、MMP-9在糖尿病足患者及正常人血清中的表達(dá)水平

MMP-2、MMP-8、MMP-9在糖尿病足患者及正常人血清中的表達(dá)水平見(jiàn)表2。

左圖：MMP-2免疫組化染色(100×，A、C為正常對(duì)照者皮膚組織，B、D為糖尿病足患者皮膚組織)
右圖：MMP-2免疫組化染色(400×，A、C為正常對(duì)照者皮膚組織，B、D為糖尿病足患者皮膚組織)

Figure 1 MMP-2 expression in the skin tissue of diabetic foot wound and the normal skin tissue(SP×100，SP×400)

Table 1 Immunohistochemical chromogenic Intensity comparison of soft tissue MMP-2、MMP-8、MMP-9 among diabete patients

左圖：MMP-8免疫組化染色(100×，A、C為正常對(duì)照者皮膚組織，B、D為糖尿病足患者皮膚組織)
右圖：MMP-8免疫組化染色(400×，A、C為正常對(duì)照者皮膚組織，B、D為糖尿病足患者皮膚組織)

Figure 2 MMP-8 expression in the skin tissue of diabetic foot wound and the normal skin tissue(SP×100，SP×400)

左圖：MMP-9免疫組化染色(100×，A、C為正常對(duì)照者皮膚組織，B、D為糖尿病足患者皮膚組織)右圖：MMP-9免疫組化染色(400×，A、C為正常對(duì)照者皮膚組織，B、D為糖尿病足患者皮膚組織)

Table 2 Comparision of serum MMP-2、MMP-8、MMP-9 expression level among diabete patientsannormal

3 討論

MMPs是一類(lèi)含Zn2+的內(nèi)源性蛋白水解酶，MMPs能降解解除多糖以外的所有胸包外基質(zhì)成分。許多研究證實(shí)絲氨酸蛋白酶系統(tǒng)中的uPA和uPA受體，通過(guò)激活MMPs從而參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解的過(guò)程，是腫瘤ECM降解的經(jīng)典模式(uPA-uPAR-MMPs)[1]。慢性創(chuàng)面及腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，關(guān)鍵因素即MMPs的過(guò)度表達(dá)影響新血管形成和膠原沉積過(guò)程，導(dǎo)致組織液化。研究表明糖尿病人群的15%患有糖尿病足，因此糖尿病足是糖尿病患者截肢(趾)的主要原因之一[2]。糖尿病足潰瘍是糖尿病的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一，截肢率高達(dá)33%[3]，研究表明[4]，糖尿病足創(chuàng)面組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平增加，活性增強(qiáng)，使創(chuàng)面難以愈合?，F(xiàn)有的研究表明，胰島素樣生長(zhǎng)因子1(1IGF-1)是一種結(jié)構(gòu)類(lèi)似胰島素的多肽，其作用主要為促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞分裂增殖，血糖過(guò)高能抑制其合成和釋放，糖尿病患者該多肽明顯減少。基底層和成纖維細(xì)胞缺乏IGF-1可能使糖尿病足潰瘍延遲愈合[5]。

基質(zhì)金屬蛋白酶能夠顯著的降解血管壁基底膜(主要作用成分為MMP-2和MMP-9)。平滑肌細(xì)胞主要位于血管壁的中膜層，基底膜包繞其周。平滑肌細(xì)胞收縮的可能原因是基底膜與平滑肌細(xì)胞接觸。平滑肌細(xì)胞因?yàn)榛啄け唤到舛鴱闹心は騼?nèi)膜遷移并增殖，增加細(xì)胞外基質(zhì)，纖維組織增生，產(chǎn)生動(dòng)脈硬化[6]。糖尿病患者動(dòng)脈中MMP-9通過(guò)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)，因這兩種細(xì)胞是主要的炎癥反應(yīng)細(xì)胞，因此導(dǎo)致糖尿病足潰瘍延遲愈合[7]。MMP-2是MMPs的一種，目前研究較多，MMP-2在青壯年糖尿病(Ⅰ型)血清樣本中升高顯著，有可能是早期糖尿病腎病的標(biāo)志物之一；研究還發(fā)現(xiàn)MMP-2在Ⅱ型糖尿病大血管病變過(guò)程中亦升高，與糖尿病患者動(dòng)脈硬化的形成及斑塊易破裂有關(guān)[8]?？赡苁翘悄虿∑つw易受損傷及急性創(chuàng)面慢性化的重要原因之一。血清 MMP-9水平升高者罹患糖尿病足潰瘍的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加約20倍，對(duì)于合并血管并發(fā)癥的患者有非常高的預(yù)防價(jià)值[9]。因此有必要進(jìn)一步明確糖尿病足局部創(chuàng)面MMPs水平，以利于更進(jìn)一步了解其發(fā)病機(jī)制，并進(jìn)一步地提出針對(duì)性的治療方案。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)SP法及ELISA法檢測(cè)MMP-2、MMP-8、MMP-9的表達(dá)水平，結(jié)果表明MMP-2在正常皮膚組織和糖尿病足創(chuàng)面組織中的表達(dá)無(wú)明顯差異，此結(jié)果與其他研究結(jié)果之間存在差異的原因尚需進(jìn)一步研究分析確定。我們分析認(rèn)為，這與患者TIMPs濃度水平之間存在一定的相關(guān)性，在生理狀態(tài)下MMPs與TIMPs之間保持著動(dòng)態(tài)平衡，協(xié)調(diào)ECM降解與重建，維持組織結(jié)構(gòu)的完整和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定；一般傷口在愈合過(guò)程中清除壞死物、細(xì)胞遷移和細(xì)胞外基質(zhì)降解重塑等過(guò)程中起著重要作用的是MMPs/TIMPs[10〗[11]。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，創(chuàng)面的早期修復(fù)階段所發(fā)生的炎癥反應(yīng)，包括上皮細(xì)胞的遷移、增殖是一致的，這表明炎癥細(xì)胞存放MMP-9和TIMP-1與角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移的早期相關(guān)聯(lián)。因?yàn)镸MP-9/TIMP-1的比值是動(dòng)態(tài)平衡的，故提示正常人在MMPs發(fā)生變化的同時(shí)其生理性拮抗劑也發(fā)生著動(dòng)態(tài)變化，這種動(dòng)態(tài)平衡能夠防止局部組織過(guò)度破壞以及過(guò)量堆積，同時(shí)也有益于傷口的自我修復(fù)[12]。此推斷需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究印證。與其他研究結(jié)果類(lèi)似，MMP-8在正常組織中的表達(dá)明顯高于糖尿病足患者，MMP-9在糖尿病足創(chuàng)面組織中的表達(dá)明顯高于正常皮膚組織，且與血清MMP-9濃度的增高程度存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。而正常人和糖尿病足患者血清中MMP-2和MMP-8的表達(dá)無(wú)差異，此結(jié)果需要對(duì)更大量的樣本進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。血清MMP-9在糖尿病足患者中的表達(dá)明顯高于正常人，與李志紅[13]等人的研究具有一致性：MMP-8、MMP-9參與了糖尿病足潰瘍的形成[14]。

綜上所述，MMP-9在糖尿病足患者血清和創(chuàng)面組織中的表達(dá)明顯升高，MMP-9可能與糖尿病患者糖尿病足的愈合，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。我們的研究由于樣本量較小，難免出現(xiàn)偏倚，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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[12〗LobmannR，AmbroschA，SchultzG，et al.Expression of matrix- metalloproteinases and their inhibitors in the wounds of diabeticandnon-diabeticpatients[J].Diabe-tologia，2002，45(7)：1011-1016.

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Matrix metalloproteinases(MMPs)expression level in the skin of diabetic foot wound and its clinical significance※

An Yulan，Deng Lijun，Sun Qing，Jin Shengyan，Li Qinghong，Chen Lili，Huang Ningqing，Lu Chuan，Cheng Rong

(Department of Joints，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining，Qinghai 810001)

Objective To study the effects of matrix metalloproteinases(MMPs)expression level in the skin of diabetic foot wound and its clinical significance.Methods Used immunohistochemical SP method to detect MMP-2，MMP-8 and MMP-9 expression level in the 8 cases of normal skin and 9 patients with diabetic foot wound tissue.ELISA method was used to detect the serum levels of MMP-2，MMP-8 and MMP-9 in 58 cases of normal people and 55 patients with diabetic foot and analyze its clinical significance.Results MMP-2 showed no significant difference(P>0.05)in normal and diabetic foot wound tissue of the skin.MMP-8 expression is significantly higher than that in normal tissue in patients with diabetic foot (P<0.05)；MMP-9 was lower in normal skin tissue than that in the diabetic foot wound tissue.There was no obvious statistical significance difference(P>0.05)in both groups′ serum MMP-2 and MMP-8；the serum levels of MMP-9 expression in patients with diabetic foot was significantly higher than that in control group(P<0.001).Conclusion The tissue and serum expression level of MMP-8 and MMP-9 in patients with diabetic foot is significantly increased.It is suggested that both of them may be associated with the occurrence of diabetic foot in patients with diabetes.

Diabetic foot MMPs expression

R587.2

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.007

2015-12-12

※：青海大學(xué)附屬醫(yī)院中青年科研項(xiàng)目(ASRF-2013-16) 安玉蘭(1967～)，漢族，青海籍