光動力學調(diào)控miR143激活Bcl-2/Bax的信號路徑對人宮頸癌的治療機制

蘭艷麗　劉　韻

441021 湖北文理學院附屬襄陽市中心醫(yī)院

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光動力學調(diào)控miR143激活Bcl-2/Bax的信號路徑對人宮頸癌的治療機制

蘭艷麗劉韻

441021 湖北文理學院附屬襄陽市中心醫(yī)院

【摘要】目的探討在宮頸癌中光動力學調(diào)控對miR143激活Bcl-2/Bax的信號路徑的影響，為光動力學聯(lián)合miR143應用于宮頸癌的治療機制奠定基礎。方法人宮頸癌HeLa細胞分別進行miR143干擾處理(miR143組)、光動力照射處理(PDT組)及miR143干擾聯(lián)合光動力照射處理(PDT+ miR143組)，采用CCK8法、流式細胞術及Transwell小室侵襲模型對各組處理后HeLa細胞的抑制率、凋亡率及侵襲能力進行分析，同時采用熒光定量PCR檢測不同處理前后各組細胞的miR143、Bcl-2和Bax的mRNA表達水平。結(jié)果3組之間的細胞抑制率、凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，PDT+ miR143組細胞抑制率和凋亡率分別高于PDT組和miR143組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而PDT+ miR143組穿膜細胞數(shù)顯著高于miR143組和PDT組(P<0.05)。處理后，3組miR143和 Bcl-2 mRNA表達水平較處理前均顯著升高(P<0.0001)，且處理后PDT+ miR143組miR143和 Bcl-2 mRNA表達水平顯著高于PDT組和miR143組(P<0.05)，而處理后3組Bax mRNA表達水平無明顯變化。結(jié)論在宮頸癌中，光動力學治療對miR143激活Bcl-2/Bax的信號路徑起正向調(diào)控作用，為光動力學聯(lián)合miR143治療宮頸癌的機制奠定了基礎。

【關鍵詞】光動力學；miR143；Bcl-2/Bax；宮頸癌

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:541～544)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率位于女性癌癥的第二位，全世界約有100萬女性患有宮頸癌[1-2]。自70年代中期光動力學療法(photodynamic therapy，PDT)在生殖器皰疹得到應用之后，光動力學療法就成為臨床上治療腫瘤的重要方法，由于其創(chuàng)傷小、毒性低、可重復治療并能保護器官和患者的生理功能等優(yōu)勢，光動力學療法在宮頸癌治療中得到廣泛的應用[3-4]。miR143是一類不編碼蛋白質(zhì)的單鏈小RNA,近幾年的研究顯示miR143與食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌發(fā)生發(fā)展有著密切的關系[5-6]。目前，miR143應用于癌癥的治療已成為研究的熱點。關于光動力學聯(lián)合miR143的抗腫瘤作用未見報道，鑒于此，本研究將對光動力學療法調(diào)控miR143激活Bcl-2/Bax的信號路徑進行研究，以期為光動力學聯(lián)合miR143治療宮頸癌奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

人宮頸癌HeLa細胞購于上海博研生物工程研究中心，TMPyP4、DMED、胚胎牛血清、RNAi轉(zhuǎn)染試劑、TransStart Top Green qPCR SuperMix 試劑盒購于北京全式金有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、CCK8試劑盒、FITC-Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于索來寶生物技術有限公司，Transwell小室購于北京優(yōu)尼生物科技有限公司，matrigel基質(zhì)膠購于德國BD公司，QIAquick RNA Extraction Kit購于德國QIAGEN公司，F(xiàn)irst Strand cDNAsynthesis Kit試劑盒購于日本Takara公司。pGenesil-1-miR143質(zhì)粒載體由武漢晶賽公司構(gòu)建。流式細胞儀、酶標儀、ABI7500熒光定量PCR儀均為本院實驗中心提供，PDT激光治療儀由本院神經(jīng)外科提供。miR143、Bcl-2和Bax熒光定量引物由華大基因合成，miR143引物序列：F:5'-GCGCAGCGCCCTGTCTCCCAG-3';R:5'-GCTGCAGAACAACTTCTCTCTTC-3',Bcl-2:F:5'-TCCGCATCAGGAAGGCTAGA-3';R:5'-AGGACCAGGCCTCCAAGCT-3';Bax:F:5'-CCTTTTCTACTTTGCCAGCAAAC-3';R:5'-GAGGCCGTCCCAACCAC-3',GAPDH：F：5’-CGACGTAGTCTCATCTGACTT-3’,R:5’-GTTGCAGTCGACATAATCGTTGA-3’。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組用含10%胚胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)子宮頸癌HeLa細胞，培養(yǎng)條件：37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，每2天進行換液或傳代處理。分別在種板36 h后進行miR143干擾處理(miR143組)、光動力照射處理(PDT組)及miR143干擾聯(lián)合光動力照射處理(PDT+ miR143組)，以種板36 h后未做處理的子宮頸癌HeLa細胞為對照(空白對照組)，其中miR143濃度為100 nm/L,光動力學處理中TMPyP4濃度為10F mol/L，激光波長為425 nm，激光能量密度為8 J/cm2,PDT+miR143組中中板18 h后先給予miR143干擾處理，培養(yǎng)18 h再進行光動力學處理，作用時間均為6 h。

1.2.2各組細胞生長抑制率、凋亡率及侵襲能力檢測采用CCK8試劑盒檢測各組細胞生長抑制率，采用FITC-Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒及流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率，具體操作按試劑盒說明，采用Transwell小室侵襲模型檢測各組細胞的侵襲性，具體操作參照文獻報道[7]。

1.2.3處理前后各組細胞miR143、Bcl-2和Bax的mRNA表達水平各組于處理前及處理作用后6 h收集細胞，采用QIAquick RNA Extraction Kit(購自QIAGEN公司,德國)，濃度及純度符合要求的RNA進行合成cDNA第一鏈，cDNA第一鏈的合成按照First Strand cDNA synthesis Kit操作說明(Takara公司，日本)，反應條件為：42 ℃孵育30 min。合成的cDNA第一鏈放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肨ransStart Top Green qPCR SuperMix 試劑盒進行miR143、Bcl-2和Bax實時熒光定量PCR反應，PCR反應體系為：cDNA第一鏈1 μl,2xTrans Start Top Green qPCRSuperMix 10 μl,引物1(10 μM)0.6 μl,引物2(10 μM)0.6 μl,Passive Reference Dye 0.4 μl,ddH2O 7.4 μl，反應在ABI7500熒光定量PCR儀中進行，擴增程序為：95 ℃預變性3 min,95 ℃10 sec；58 ℃20 sec；72 ℃30 s，40個循環(huán)，同時進行溶解曲線的分析，程序為：60 ℃1 min;95 ℃30 s。在ABI7500分析軟件上分析miR143、Bcl-2和Bax、GAPDH基因(參考基因)的Ct值，采用2-?Ct法計算各組細胞處理前后miR143、Bcl-2和Bax的表達量，采用公式?Ct= Ct(目的基因)-Ct(GAPDH基因)。

1.3統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1各組子宮頸癌HeLa細胞生長抑制

CCK-8法檢測細胞生長抑制情況，PDT組、miR143組及PDT+ miR14 3組的細胞抑制率分別為(46.16±3.76)%、(28.34±4.05)%、(91.32±8.96)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),PDT+ miR143組胞抑制率明顯高于PDT組和miR143組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2各組子宮頸癌HeLa細胞凋亡及侵襲能力情況

空白對照組、PDT組、miR143組及PDT+ miR143組凋亡率差異明顯(P<0.05)，3組處理組凋亡率均顯著高于空白對照組(P<0.05)，且PDT+ miR143組凋亡率明顯高于PDT組和miR143組(P<0.05)。各組侵襲能力的檢測結(jié)果，3組處理組穿膜細胞數(shù)均顯著低于空白對照組(P<0.05)，其中PDT+ miR143組穿膜細胞數(shù)與miR143組及PDT組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

±s)

2.3處理前后各組細胞miR143、Bcl-2和Bax的mRNA表達水平

處理前，miR143、Bcl-2和Bax的mRNA表達水平在3組之間均無明顯差異(P>0.05)。

經(jīng)PDT、miR143及聯(lián)合PDT+miR143處理，3組miR143和 Bcl-2 mRNA表達水平較處理前均顯著升高(P<0.0001)，且處理后PDT+ miR143組miR143和 Bcl-2 mRNA表達水平顯著高于PDT組和miR143組(P<0.05)。處理后3組Bax mRNA表達水平有下降的趨勢，但與處理前相比，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且處理后3組之間無明顯差別(P>0.05)，見表2。

3討論

光動力療法(PDT)是建立在對腫瘤細胞選擇性的聚積吸收光敏劑，在進行光照后，光敏劑通過光化學反

分組 miR143處理前處理后Bcl-2處理前處理后Bax處理前處理后PDT組2.21±1.124.32±0.971.97±1.254.56±1.194.12±1.214.02±1.06miR143組2.34±1.054.84±0.951.89±1.435.39±1.034.23±1.134.01±1.13PDT+miR143組2.14±1.085.71±0.871.74±1.196.47±0.914.19±1.084.06±1.08

應將光能轉(zhuǎn)化為分子內(nèi)能，誘導細胞產(chǎn)生的高度細胞毒性的單線態(tài)氧和其他活性氧，其誘導的氧化應激導致組織的壞死或細胞的凋亡[8]。因光動力療法對組織特異性較好，對健康組織損害小，引起的并發(fā)癥及不良反應很少，因而為宮頸癌的治療提供了一種有效的方法。miRNA是一類由18～25個核苷酸組成高度保守性的內(nèi)源非編碼RNA分子，近年來，miRNA已經(jīng)成為分子生物學、遺傳學和臨床醫(yī)學等領域的研究熱點，不斷有研究指出，miRNA對于細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用[9]。miR143作為其中一種miRNA被指出與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關，可通過其靶向基因Bcl-2抑制人宮頸癌HeLa細胞的增殖，并促進腫瘤細胞的凋亡[10]?；诠鈩恿Ο煼ê蚼iR143對宮頸癌治療的意義，本研究將對光動力學療法調(diào)控miR143激活Bcl-2/Bax的信號路徑進行研究，以期為光動力學聯(lián)合miR143治療宮頸癌奠定基礎。

本研究采用CCK8法、流式細胞術及Transwell小室侵襲模型對進行miR143處理、光動力照射處理及miR143聯(lián)合光動力照射處理后HeLa細胞的抑制率、凋亡率及侵襲能力分別檢測，結(jié)果顯示不同處理組之間的細胞生長抑制情況差異顯著(P<0.05)，其中miR143聯(lián)合光動力照射處理的抑制作用明顯強于單獨miR143或光動力照射處理(P<0.05)，提示光動力學和miR143可相互促進各自抑制腫瘤細胞的作用。凋亡率檢測結(jié)果顯示處理組細胞的凋亡率顯著高于未處理細胞的凋亡率，且經(jīng)miR143聯(lián)合光動力照射處理的細胞凋亡率明顯高于miR143或光動力照射單獨處理(P<0.05)，提示光動力學和miR143可相互促進腫瘤細胞凋亡的作用(P<0.05)。侵襲能力的結(jié)果顯示，處理組細胞的侵襲細胞數(shù)顯著低于未處理組(P<0.05)，且經(jīng)miR143聯(lián)合光動力照射處理的侵襲細胞數(shù)顯著低于miR143或光動力照射單獨處理(P<0.05)，提示miR143和光動力均可阻礙腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移，兩者的聯(lián)合能相互促進各自抑制腫瘤細胞侵襲作用的發(fā)揮。同時，本研究采用熒光定量PCR對不同處理前后細胞的miR143、Bcl-2和Bax的mRNA表達水平，結(jié)果顯示處理后細胞的miR143和 Bcl-2 mRNA表達水平顯著提高(P<0.0001)，且miR143聯(lián)合光動力照射的miR143和 Bcl-2 mRNA表達水平顯著高于miR143或光動力照射單獨處理(P<0.05)，提示miR143和光動力抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡及阻礙侵襲的作用的發(fā)揮與miR143和 Bcl-2 mRNA表達水平的上升有關，且兩者的聯(lián)合能協(xié)同促進miR143和 Bcl-2 mRNA表達水平的上升。Bax mRNA表達水平有下降的趨勢，但與處理前相比，均無顯著性差異(P>0.05)，可能與光動力學處理的時間、強度、波長及miR143的濃度有關。

綜上所述，在宮頸癌中，光動力學治療對miR143激活Bcl-2/Bax的信號路徑起正向調(diào)控作用，為光動力學聯(lián)合miR143治療宮頸癌的機制奠定了基礎。

參考文獻

[1]魏萬里，阮永華，盧玉波，等.宮頸癌化療前后腫瘤細胞凋亡及相關基因Bcl-2、Bax表達的對比分析〔J〕.實用癌癥雜志，2008，23(1)：31-33.

[2]朱燕，楊其昌，劉宏斌，等.Survivin、bcl-2及 p53蛋白在官頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達及意義〔J〕.實用癌癥雜志，2008，23(2)：138-140.

[3]Soergel P,Loehr-Schulz R,Hillemanns M,et al.Effects of photodynamic therapy using topical applied hexylaminolevulinate and methylaminolevulinate upon the integrity of cervical epithelium〔J〕.Laser Surg Med,2010,42(9):784-790.

[4]Wei XQ,Ma HQ,Liu AH,et al.Synergistic anticancer activity of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in combination with low-dose cisplatin on Hela Cells〔J〕.Asian Pacifc J Cancer Prev,2013,14(5):3023-3028.

[5]Wagner A,Mayr C,Bach D,et al.MicroRNAs associated -

with the efficacy of photodynamic therapy in biliary tract cancer cell lines〔J〕.Int J Mol Sci,2014,15(11):20134-20157.

[6]Xu B,Niu X,Zhang X,et al.miR143 decreases prostate c-

ancer cell proliteration and migration and enhances their sensitivity to docetaxel through suppression of KRAS〔J〕.Mol Cell Biochem,2011,350(12):207-213.

[7]劉洪麗，呂昌帥,丁佰娟,等.新型光動力學療法聯(lián)合核仁素沉默對宮頸癌SiHa細胞的光動力學效應〔J〕.吉林大學學報，2014,40(4)：748-751.

[8]Chakrabarti M,Banik NL,Ray SK.Photofrin based photodynamic therapy and miR-99a transfection inhibited FGFR3 and PI3K/Akt signaling mechanisms to control growth of human glioblastoma in vitro and in vivo〔J〕.Plos One,2013,8(2):e55652.

[9]Pramanik D,Campbell NR,Karikari C,et al.Restitution of tumor suppressor microRNA using a systemic nanovector inhibits pancreatic cancer growth in mice〔J〕.Mol Cancer Ther,2011,10(8):1470-1480.

[10]張林，高林波.miR-143和miR-145與腫瘤的研究進展〔J〕.西安交通大學學報，2013，34(1)：1-5.

(編輯：甘艷)

Regulation Effect of Photodynamic Therapy on Bcl-2/Bax Signal Path Activated by miR143 in Human Cervical Cancer

LANYanli,LIUYun.XiangyangCentralHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofArtsandScience,Xiangyang,441021

【Abstract】ObjectiveTo investigate the regulation effect of photodynamic therapy on Bcl-2/Bax signal path activated by miR143 in human cervical cancer,and lay foundation for cervical cancer treated with photodynamic therapy along with miR143.MethodsHuman HeLa cells received miR143 interference(miR143 group),photodynamic irradiation treatment(PDT group) and miR143 interference combined with photodynamic irradiation(PDT + miR143 group).The rate of inhibition,apoptosis and invasion were detected by CCK8,flow cytometry and Transwell model,respectively.Meanwhile the expression levels of miR143,Bcl-2 and Bax before and after different treatments were detected by fluorescence quantitative PCR.ResultsThe inhibition rates and apoptosis rates among the 3 groups were significantly different(P<0.05),inhibition rates and apoptosis rates of PDT + miR143 group were distinctly higher than those of PDT group and miR143 group(P<0.05).And invasion cell number of PDT + miR143 group was significantly higher than that of miR143 group and PDT group(P<0.05).After treatment,the expression levels of miR143 and Bcl-2 among the 3 groups visibly increased than before treatment(P<0.0001).Moreover the expression levels of miR143 and Bcl-2 were significantly higher than those of PDT group and miR143 group(P<0.05).However the expression levels of Bax mRNA among the 3 groups showed no significant differences after treatment(P>0.05).ConclusionIn cervical cancer,photodynamic therapy upregulated the Bcl-2/Bax signal path activated by miR143,and lay foundation for cervical cancer treated with photodynamic therapy along with miR143.

【Key words】Photodynamic therapy；miR143；Bcl-2/Bax；Cervical cancer

(收稿日期2015-07-06修回日期 2015-12-10)

中圖分類號：R737.33

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)04-0541-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.006

通訊作者：劉韻