金屬硫蛋白對(duì)皮膚癌發(fā)生抵抗作用及機(jī)制的研究

武月婷　時(shí)佳宏　潘奇正　王　元　侯寶蓮　任淑萍

(吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，長(zhǎng)春130021)

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金屬硫蛋白對(duì)皮膚癌發(fā)生抵抗作用及機(jī)制的研究

武月婷時(shí)佳宏潘奇正①王元侯寶蓮任淑萍

(吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，長(zhǎng)春130021)

[摘要]目的：建立HaCaT細(xì)胞UVB損傷模型，給予硫酸鋅刺激，探討其對(duì)細(xì)胞損傷的拮抗作用及機(jī)制。方法：細(xì)胞分為正常組、加鋅組、紫外線組、加鋅紫外線組，照射前24 h給予硫酸鋅處理，UVB照射后繼續(xù)培養(yǎng)，確定硫酸鋅給藥濃度和UVB輻射時(shí)間，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)金屬硫蛋白和NF-κB/p65的表達(dá)情況。結(jié)果：紫外線組細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2比值高于正常組和加鋅紫外線組；紫外線組、加鋅組細(xì)胞內(nèi)MT表達(dá)水平均高于正常組，加鋅紫外線組細(xì)胞MT表達(dá)水平高于紫外線組；紫外線組細(xì)胞內(nèi)NF-κB/p65表達(dá)水平高于正常組和加鋅紫外線組細(xì)胞。結(jié)論：硫酸鋅能夠通過(guò)細(xì)胞內(nèi)金屬硫蛋白的表達(dá)，緩解UVB誘發(fā)HaCaT細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]皮膚癌；紫外線；金屬硫蛋白；細(xì)胞凋亡

紫外線是環(huán)境中的一種重要致癌劑。隨著工業(yè)發(fā)展，大氣層的破壞，環(huán)境污染日益嚴(yán)重，大氣對(duì)紫外線的屏障作用日益減弱，紫外線輻射可誘發(fā)皮膚光損傷、光老化，甚至皮膚癌的發(fā)生，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康[1,2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年被診斷為皮膚癌的病例在美國(guó)超過(guò)1 000例，接近全部新發(fā)癌癥的40%[3,4]。已有大量研究證實(shí)，造成皮膚光老化和皮膚癌的最主要因素就是UVB[5]。UVB引起的皮膚光損傷，機(jī)制較為復(fù)雜，主要是通過(guò)氧化應(yīng)激產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡造成細(xì)胞損傷、引起皮膚光老化，誘發(fā)皮膚癌發(fā)生[6]。目前，關(guān)于硫酸鋅通過(guò)金屬硫蛋白(MT)的表達(dá)，對(duì)UVB損傷人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)的拮抗作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞損傷，建立UVB 損傷皮膚細(xì)胞模型，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生，探討硫酸鋅對(duì)UVB導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞損傷的拮抗作用，旨在為UVB造成的皮膚損傷提供預(yù)防與治療的理論基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)新型抗皮膚損傷產(chǎn)品提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自天津TBD公司，兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人MT抗體、兔抗人NF-κB/P65抗體由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司提供，免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)使用HaCaT細(xì)胞，采用單層貼壁培養(yǎng)法，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)90%時(shí)傳代。

1.2.2硫酸鋅給藥濃度及UVB輻射劑量的確定細(xì)胞融合90%時(shí)，分為對(duì)照組，紫外線組，10 μm/L硫酸鋅組，50 μm/L硫酸鋅組，100 μm/L硫酸鋅組，按不同濃度給予硫酸鋅處理，鏡下觀察細(xì)胞，確定硫酸鋅給藥濃度。

UVB輻射細(xì)胞5 min、6 min、7 min、8 min、9 min，輻射劑量分別為：7.075 mJ/cm2、8.490 mJ/cm2、9.905 mJ/cm2、11.320 mJ/cm2、12.735 mJ/cm2，臺(tái)盼藍(lán)法計(jì)算細(xì)胞存活情況，確定UVB輻射劑量。

1.2.3建立UVB損傷細(xì)胞模型細(xì)胞傳至一次性培養(yǎng)皿中，融合達(dá)90%時(shí)，隨機(jī)分為正常組、紫外線組、加鋅組、加鋅紫外線組。棄掉原有培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入10 ml含0.5%FBS的1640培養(yǎng)液，加鋅組和加鋅紫外線組分別加入5 μl ZnSO4，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄掉原有培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入4 ml PBS浸沒(méi)平皿底，UVB燈正下方20 cm處照射6 min(其中正常組加蓋平皿蓋，其余組開(kāi)蓋照射)。照射后，將平皿內(nèi)的PBS棄掉，加入預(yù)冷的PBS 4 ml，沖洗3次。加入1640培養(yǎng)液(10%FBS)，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4Western blot法檢測(cè)硫酸鋅對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞照射24 h后，收集至離心管中，離心，1 000 r/min，10 min。棄上清，1 ml PBS 重懸，移入EP管中，4℃離心，4 000 r/min， 5 min。棄上清，加入100 μl RIPA裂解液( 含1 mmol/L PMSF)。4℃裂解30～45 min，每5 min振蕩一次。4℃離心，12 000 r/min，5 min，取上清，蛋白定量。

配制分離膠、濃縮膠，加樣孔中加入20 μl樣品，接通電源，恒壓80伏進(jìn)行電泳。PVDF膜轉(zhuǎn)膜100 mA恒流，2 h。取出膜放入10 ml 封閉緩沖液中，室溫輕搖2 h。一抗孵育，4℃過(guò)夜。TBST室溫洗膜10 min×3次。二抗孵育，室溫輕搖45 min。TBST洗膜10 min×3次。 DAB顯色試劑盒顯色。掃描PVDF膜，Quantity one軟件對(duì)條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5細(xì)胞中金屬硫蛋白的檢測(cè)采用免疫細(xì)胞化學(xué)法：細(xì)胞培養(yǎng)于鋪好蓋玻片的6孔板中，各組處理因素如1.2.2所述，UVB輻射24 h后，95%乙醇4℃固定10 min后晾干，0.3%Triton-100打孔10 min。3%H2O2去離子水室溫孵育10 min。PBS沖洗5 min×3次。正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，加入1∶200稀釋的兔抗金屬硫蛋白多克隆抗體，4℃過(guò)夜。PBS沖洗5 min×3次。滴加生物素化二抗工作液(IgG)，室溫孵育10 min。PBS沖洗5 min×3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10 min。PBS沖洗5 min×3次。用DAB顯色試劑盒顯色。自來(lái)水終止顯色后，中性樹(shù)膠封片?！?00顯微鏡下觀察。將結(jié)果圖片用軟件Image Pro Plus 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 細(xì)胞中NF-κB/p65的檢測(cè)操作步驟同1.2.5，UVB輻射2 h后固定細(xì)胞。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1改變硫酸鋅劑量對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響如圖1所示，倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，正常組、10 μm/L硫酸鋅組和50 μm/L硫酸鋅組細(xì)胞大多數(shù)貼壁生長(zhǎng)，狀態(tài)良好。100 μm/L硫酸鋅組細(xì)胞幾乎全部死亡漂起。

2.2改變UVB輻射時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響如圖2所示，細(xì)胞存活率隨著輻射時(shí)間的增加而逐漸降低。照射6、7、8、9 min后細(xì)胞存活率低于正常組，差異顯著(P<0.05)。

2.3硫酸鋅對(duì)細(xì)胞中Bax和Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響如圖3、4所示，以GAPDH為內(nèi)參，紫外線組細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2比值高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與紫外線組相比，加鋅紫外線組細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2比值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1　倒置顯微鏡下的細(xì)胞狀態(tài)(×400)Fig.1　State of cells under invert microscope(×400)Note: A.Normal group B.100 μm/L ZnSO4 group C.50 μm/L ZnSO4 group D.10 μm/L ZnSO4 group.

圖2　UVB輻射時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響±s)Fig.2　Effects of different duration of UVB radiation on HaCaT cell ±s)Note: #.P<0.05 vs normal group.

圖3　Western 印跡檢測(cè)細(xì)胞中Bax和Bcl-2 蛋白表達(dá)Fig.3　Effects of Zinc sulfate on HaCaT cell Bax and Bcl-2 expression detected by Western blot

圖4　細(xì)胞中Bax和Bcl-2表達(dá)情況Fig.4　Expression of Bax and Bcl-2 in HaCaT ±s)Note: #.P<0.05 vs normal group；*.P<0.05 vs UVB group.

圖5　免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞中金屬硫蛋白表達(dá)(×400)Fig.5　Expression of metallothionein in HaCaT cells by Immunocytochemistry detection (×400)Note: A.Normal group；B.UVB group；C.ZnSO4 group；D.UVB+ZnSO4 group.

圖6　細(xì)胞中金屬硫蛋白表達(dá)情況±s)Fig.6　Expression of metallothionein in HaCaT ±s)Note: #.P<0.05 vs Zn group;*.P<0.05 vs UVB group,Δ.P<0.05 vs normal group.

圖7　免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB/p65表達(dá)(×400)Fig.7　Expression of NF-κB/p65 in HaCaT cells by Immunocytochemistry detection (×400)Note: A.Normal group；B.UVB group;C.ZnSO4 group;D.UVB+ZnSO4 group.

2.4硫酸鋅處理對(duì)細(xì)胞中金屬硫蛋白表達(dá)情況的影響與正常組相比，加鋅組、紫外線組、加鋅紫外線組細(xì)胞內(nèi)MT表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與紫外線組相比，加鋅紫外線組細(xì)胞內(nèi)MT表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與加鋅組相比，加鋅紫外線組細(xì)胞內(nèi)MT表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5、6。

2.5硫酸鋅處理對(duì)細(xì)胞中NF-κB/p65表達(dá)情況的影響與正常組相比，紫外線組、加鋅紫外線組細(xì)胞內(nèi)NF-κB/p65表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與紫外線組相比，加鋅紫外線組細(xì)胞內(nèi)NF-κB/p65表達(dá)量顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖7、8。

圖8　細(xì)胞中NF-κB/p65表達(dá)情況Fig.8　Expression of NF-κB/p65 of in HaCaT ±s)Note: #.P<0.05 vs normal group；*.P<0.05 vs UVB group；Δ.P>0.05 vs normal group.

3討論

紫外線對(duì)皮膚損傷、炎癥、光老化和皮膚癌的發(fā)生、發(fā)展有著極為重要影響[7,8]。紫外線可通過(guò)損傷角質(zhì)形成細(xì)胞DNA，最終導(dǎo)致凋亡[9]。表皮中的角質(zhì)形成細(xì)胞是UVB損傷的主要對(duì)象， HaCaT細(xì)胞為人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞，培養(yǎng)條件相對(duì)比較簡(jiǎn)單，潛在增殖能力高，保留了表皮細(xì)胞的分化能力和增殖特性[10]，因此，實(shí)驗(yàn)選用HaCaT細(xì)胞株作為研究對(duì)象。

有研究證實(shí)，在UVB導(dǎo)致的角質(zhì)形成細(xì)胞損傷中，Bcl-2發(fā)揮了抗凋亡的作用[11]。Bcl-2家族由凋亡蛋白和抗凋亡蛋白組成，如Bcl-2屬于抗凋亡基因而B(niǎo)ax屬于促凋亡基因，這中間的平衡關(guān)系決定了細(xì)胞的存亡。本研究結(jié)果顯示，UVB組Bax/Bcl-2比值顯著高于正常組，表明該比值的改變導(dǎo)致從線粒體中Cyto-C的釋放，致使天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的活化，最終導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。在HaCaT細(xì)胞中， Bcl-2的過(guò)量表達(dá)阻斷UVB導(dǎo)致的凋亡，其中包括了阻止Cyto-C的釋放，Caspase-3的表達(dá)等，對(duì)半胱氨酸天門(mén)冬酶前體-8表達(dá)的阻滯，削弱了直接死亡受體對(duì)其表達(dá)的影響。Bcl-2在UVB輻射刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞中也發(fā)揮了抗氧化劑的作用。

MT是一種富含半胱氨酸蛋白家族，在體內(nèi)低水平持續(xù)表達(dá)，可以通過(guò)半胱氨酸殘基與重金屬離子結(jié)合，在存在這些金屬離子情況下可以被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)。皮膚中的MT表達(dá)可在對(duì)燒傷、UV輻射等刺激的應(yīng)答中上調(diào)[13]。MT可降低氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)組織的愈合，調(diào)節(jié)免疫功能等，表明這些蛋白可以幫助細(xì)胞拮抗UV輻射的損傷效應(yīng)，阻斷細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑的活化，成為拮抗UV導(dǎo)致皮膚癌癥發(fā)生發(fā)展的內(nèi)源性潛在保護(hù)機(jī)制[14,15]。本實(shí)驗(yàn)中，與正常組相比，加鋅組和紫外線組細(xì)胞均有較高的MT表達(dá)。這說(shuō)明50μM的硫酸鋅能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中的MT表達(dá)，且作為誘導(dǎo)MT表達(dá)的物理因素，UVB也能使MT表達(dá)水平上調(diào)；加鋅紫外線組細(xì)胞中MT表達(dá)水平顯著高于紫外線，這說(shuō)明當(dāng)細(xì)胞受到UVB輻射時(shí)，造成生物性損傷，細(xì)胞本身產(chǎn)生的MT不足以拮抗損傷，而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行硫酸鋅處理后，鋅離子可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)MT的表達(dá)，從而拮抗UVB的損傷。

研究表明，活化的NF-κB能夠抑制Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)與存活[16],使NF-κB成為促進(jìn)凋亡的因素。本研究中UVB組細(xì)胞內(nèi)NF-κB/p65表達(dá)量顯著升高，同正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。在眾多的MT光保護(hù)機(jī)制中， NF-κB活性改變是其中很重要的一種。MT能夠通過(guò)發(fā)揮抗氧化作用，降低NF-κB活性，降低UVB所導(dǎo)致的生物學(xué)損傷，而MT能夠清除自由基，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)的特點(diǎn)，也成為間接降低NF-κB表達(dá)水平的途徑。在本研究中，加鋅紫外線組細(xì)胞NF-κB/p65表達(dá)量比較低，說(shuō)明硫酸鋅誘導(dǎo)金屬硫蛋白的表達(dá)，可能具有抑制NF-κB的作用，阻止NF-κB/p65導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。

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[收稿2015-11-26]

(編輯張曉舟)

Antagonizing effects of Metallothionein against development of skin cancer and relevant mechanisms

WUYue-Ting,SHIJia-Hong,PANQi-Zheng,WANGYuan,HOUBao-Lian,RENShu-Ping.

DepartmentofOccupationalandEnvironmentalHealth,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun130021，China

[Abstract]Objective:To establish a UVB damage cell model with HaCaT cells to investigate the protective effects of Zinc sulfate on the cell damage caused by UVB and its relevant mechanisms.Methods: The cells were divided into normal group,Zinc group,UVB group,Znic and UVB group.The addition of Zinc sulfate to the HaCaT cells was conducted 24h prior to the irradiation to the cells by UVB.Cell apoptosis was detected by Western blot and the expression of metallothionein and NF-κB/p65 were measured by immunohistochemistry.Results: Compared with normal and Zn+UVB group,Bax/Bcl-2 rate in UVB group increased.Compared with normal group,MT expression levels in UVB group,Zn group increased,and compared with UVB group,MT expression level in Zn+UVB group increased .Compared with normal group and Zn+UVB group,NF-κB/p65 expression level in UVB group increased.Conclusion: Zinc sulfate alleviates the apoptosis of HaCaT cell induced by UVB because of the expression of MT.

[Key words]Skin cancer;UV;Metallothionein;Apoptosis

中圖分類號(hào)R392

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)03-0340-05

作者簡(jiǎn)介：武月婷(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事環(huán)境有害因素對(duì)健康影響方面的研究，E-mail：wuyueting72@sohu.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：任淑萍(1966年-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境有害因素對(duì)健康的影響及機(jī)制研究,E-mail：rensp@jlu.edu.cn。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.010

①吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長(zhǎng)春130000。