脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化的實驗研究①

王玲玲　唐麗麗　孫　萌　王天陽　尤和誼　張純武　楊亦榮　陳吉彩　周蒙滔　陳必成

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，溫州32500)

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脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化的實驗研究①

王玲玲唐麗麗②孫萌②王天陽尤和誼張純武楊亦榮陳吉彩周蒙滔陳必成②

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，溫州32500)

[摘要]目的：探究脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外對炎癥啟動細(xì)胞——巨噬細(xì)胞的極化作用。方法：脂多糖(LPS，1 μg/ml)模擬局部炎癥，誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化。收集培養(yǎng)過脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基(ADMSCCM)誘導(dǎo)M1型RAW264.7細(xì)胞向M2轉(zhuǎn)化。檢測M1和M2極化方向的相關(guān)指標(biāo)，通過對IL-10、IGF-1、Arg-1、TNF-α、FIZZ1、SPHK-1的mRNA定量，以及通過Western蛋白質(zhì)印跡法和熒光標(biāo)記技術(shù)觀察IL-10、IL-12 p40、IL-27 Rα的表達(dá)。結(jié)果：LPS誘導(dǎo)后的RAW264.7細(xì)胞，在經(jīng)過ADMSCCM培養(yǎng)后，其M1相關(guān)指標(biāo)(TNF-α mRNA、IL-12 p40；P<0.05)顯著下降，部分M2相關(guān)指標(biāo)(IGF-1、IL-10 mRNA、IL-10；P<0.05)明顯上升。結(jié)論：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的可溶性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)已向M1型極化的RAW264.7細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化。

[關(guān)鍵詞]脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；RAW264.7；極化

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose derived mesenchymal stem cells，ADMSC)，因其提取過程較其他干細(xì)胞相對簡單，而廣泛的被嘗試應(yīng)用于各種疾病的治療。最初關(guān)于ADMSC的研究多將其注射到局部組織，以期填補(bǔ)、替換局部的組織損傷。但之后的實驗卻發(fā)現(xiàn)移植到局部組織的ADMSC分泌的可溶性細(xì)胞因子可以促進(jìn)局部損傷的修復(fù)，并具強(qiáng)大的炎癥調(diào)節(jié)功能。

通常認(rèn)為巨噬細(xì)胞是具吞噬功能的促炎細(xì)胞。目前發(fā)現(xiàn)不同表型的巨噬細(xì)胞執(zhí)行不同的功能。Mosser等[1]將巨噬細(xì)胞按功能分為：經(jīng)典活化型(M1)，創(chuàng)傷愈合型(M2a)以及調(diào)節(jié)型(M2b/c)巨噬細(xì)胞。也是移植ADMSC治療炎癥疾病如胰腺炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和克隆恩氏病的可能機(jī)制。細(xì)菌及其產(chǎn)物L(fēng)PS可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M1表型，使其可以分泌多種促炎因子，具強(qiáng)大的胞吞作用，可以更有效殺傷細(xì)胞內(nèi)病原體[2]。亦有實驗表明，成熟的M1型巨噬細(xì)胞是可以向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的[3]。

在ADMSC移植到局部，和周圍組織及血液中遷移而來的巨噬細(xì)胞共同作用于局部組織，兩種細(xì)胞在促進(jìn)局部組織修復(fù)和調(diào)節(jié)免疫功能方面的功能極為相似。因此，研究ADMSC對巨噬細(xì)胞有何影響，是否可以誘導(dǎo)促炎的M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為促修復(fù)，調(diào)節(jié)免疫的M2型巨噬細(xì)胞，具有重要的意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取、培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSC)提取參考Zuk等[4]的方法，略有改進(jìn)：取7周齡C57BL/6小鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)腹股溝區(qū)脂肪組織，分離較大血管后剪碎，含10%Ⅰ型膠原酶(Sigma公司)的DMEM培養(yǎng)液(Gibco BRL公司，不含Hips成分)于37℃震蕩消化90 min，篩網(wǎng)濾去未消化的組織，懸濁液于1 200 r/min離心10 min，取沉淀，PBS沖洗、離心3次后，用含10%胎牛血清(Gibco BRL公司)的DMEM培養(yǎng)液重懸，培養(yǎng)于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱，此后兩日均用PBS洗去未貼壁的細(xì)胞和組織塊。常規(guī)換液至細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時進(jìn)行傳代。

1.1.2含ADMSC分泌的可溶性細(xì)胞因子培養(yǎng)基(ADMSCCM)的制備ADMSC傳代至第2、3代，當(dāng)細(xì)胞鋪滿80%～90%視野時，使用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，24 h后取培養(yǎng)液，2 500 r/min離心10 min，取上清液，保存于-20℃，細(xì)胞常規(guī)傳代。

1.2方法

1.2.1RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)及處理小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)，購自KeyGen BioTech公司，使用含5%胎牛血清(HyClone公司)的1640培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)。實驗分空白對照組(Control組)，LPS刺激組(LPS組)，LPS刺激-ADMSCCM干預(yù)組(LPS-CM組)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿30%的視野時，用不含血清的1640培養(yǎng)液預(yù)處理12 h后Control組常規(guī)換液，LPS及LPS-CM組換添加1 μg/ml LPS(Sigma公司)的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，24 h后Control、LPS組換1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，LPS-CM組換含50%ADMSCCM的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。48 h后提取總RNA、總蛋白并進(jìn)行免疫熒光實驗。

1.2.2 RNA提取及RTPCR按1.2.1的步驟處理的RAW264.7細(xì)胞，Trizol法(Invitrogen公司)提取總RNA。使用Thermo試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)逆轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行RTPCR。擴(kuò)增程序為：95℃3 min，95℃15 s，62℃1 min，40循環(huán)(ABI7500,USA)。應(yīng)用參照基因GAPDH進(jìn)行校正，利用空白對照組進(jìn)行歸一化，最終得到目的基因的表達(dá)差異:相對表達(dá)量=2-△△Ct,△△Ct=[Cttarget gene (標(biāo)本) - Ctinternal reference (標(biāo)本)]-[Cttarget gene(對照)-Ct internal reference (對照)]。實驗均進(jìn)行復(fù)孔檢測。檢測GAPDH、IL-10、IL-12p40、IL-27Rα、IGF-1、iNOS、Arg-1、TNF-α、FIZZ1、SPHK1的相對表達(dá)量，引物均由GENEWIZ公司合成，序列見表1。

1.2.3蛋白提取及Western蛋白質(zhì)印跡檢測按1.2.1步驟處理的RAW264.7細(xì)胞，細(xì)胞裂解液作用20 min后細(xì)胞刮收集細(xì)胞，12 000 r/min離心后收集上清液，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后100℃變性5 min。制備12%聚丙烯酰胺分離膠和4%積層膠，取30 μg蛋白上樣電泳。分子量18.7 kD(IL-10)的蛋白濕法電轉(zhuǎn)移25 min，其余均轉(zhuǎn)50 min。5%牛奶TBSB封閉后，孵育一抗GAPDHpAb(Bioworld公司)，Anti-IL10 antibody(Abcam公司)，Anti-IL27Rα antibody(abcam公司)，抗IL-12BP40抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)。孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(Bioworld公司)后曝光，使用Quantityone對得到的條帶進(jìn)行光密度定量分析。

1.2.4免疫熒光染色按1.2.1步驟處理的RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)4%甲醛液固定，TritonX-100破膜，封閉，孵育一抗、二抗，DIPA染色(Roche公司)，室溫涼干后熒光顯微鏡觀察(目的激發(fā)波長493 nm，發(fā)射波長518 nm；細(xì)胞核激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長450 nm)，隨機(jī)選取中央部位拍照。使用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行圖片合成及熒光強(qiáng)度分析。

表1RTPCR引物序列

Tab.1Primers used with real-time PCR

GenePrimerGAPDH5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'IL-105'-CCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATG-3'5'-TGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA-3'IGF-15'-CACACCTCTTCTACCTGGCGCTCTGC-3'5'-AGTCTCCTCAGATCACAGCTCCG-3'Arg-15'-CAGAAGAATGGAAGAGTCAG-3'5'-CAGATATGCAGGGAGTCACC-3'TNF-α5'-TTAACGCCCCACTCACCTGCTG-3'5'-GCTTCTTTGGGACACCTGCTGC-3'FIZZ15'-GGTCCCAGTGCATATGGATGAGACCATAGA-3'5'-CACCTCTTCACTGCAGGGACAGTTGGCAGA-3'SPHK15'-ACAGCAGTGTGCAGTTGATGA-3'5'-GGCAGTCATGTCCGGTGATG-3'

mRNA相對定量Ct值，WB光密度定量分析結(jié)果及免疫熒光強(qiáng)度分析結(jié)果進(jìn)行Oneway ANOVA后，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1巨噬細(xì)胞分型相關(guān)分子mRNA的相對表達(dá)量如圖1，已向M1極化的RAW264.7細(xì)胞(LPS組)，在ADMSCCM的作用后，其M1相關(guān)指標(biāo)TNF-α mRNA表達(dá)明顯下降(P=0.039)。M2a相關(guān)性指標(biāo)IGF-1 mRNA表達(dá)明顯下降(P=0.045)，及Arg-1 mRNA表達(dá)上升(P=0.162)，F(xiàn)IZZ1 mRNA表達(dá)無明顯變化(P=0.626)。M2b相關(guān)指標(biāo)IL-10 mRNA表達(dá)明顯上升(P=0.046)，SPHK-1mRNA表達(dá)無明顯差別(P=0.587)。

2.2巨噬細(xì)胞分型相關(guān)分子蛋白表達(dá)如圖2所示，RAW264.7細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)后，IL-10、IL27Rα表達(dá)量下降(PIL-10=0.011,PIL27Rα<0.001)，IL-12p40表達(dá)量上升(PIL-12p40=0.001)，說明其向M1型巨噬細(xì)胞極化。經(jīng)過ADMSCCM的誘導(dǎo)培養(yǎng)后，IL-10、IL27Rα表達(dá)量有所回升(PIL-10=0.012，PIL27Rα=0.048)，IL-12p40表達(dá)量下降(PIL-12p40=0.005)，說明已向M1型極化的RAW264.7細(xì)胞在ADMSCCM的作用下向M2型極化。

2.3免疫熒光標(biāo)志按1.2.1的步驟處理的RAW264.7細(xì)胞。可見LPS-CM處理組相比LPS組熒光強(qiáng)度，其IL-12p40表達(dá)量明顯下降，而IL-10，IL-27Rα的表達(dá)量明顯升高(圖3)。

圖1　巨噬細(xì)胞分型相關(guān)分子mRNA的相對表達(dá)量Fig.1　Relative expression of macrophage type related mRNANote: *.P<0.05.

3討論

本課題以小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)代替腹腔貯存型巨噬細(xì)胞。使用脂多糖(LPS)將RAW264.7誘導(dǎo)為促炎的M1型巨噬細(xì)胞。使用含ADMSC分泌的可溶性細(xì)胞因子的培養(yǎng)基(ADMSCCM)模擬ADMSC移植治療。檢測以IL-12p40為代表的經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞指標(biāo)，以IL-27Rα為代表的創(chuàng)傷愈合型巨噬細(xì)胞指標(biāo)，以及以IL-10為代表的調(diào)節(jié)型巨噬細(xì)胞指標(biāo)。檢測發(fā)現(xiàn)LPS能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向M1表型極化，而加入ADMSCCM后極化細(xì)胞能逆轉(zhuǎn)M1極化，成為M2型巨噬細(xì)胞。

圖2　RAW264.7誘導(dǎo)極化時IL-10、IL-12 p40和IL27Rα的表達(dá)Fig.2　Expression of IL-10,IL-12 p40 and IL-27 Rα in different group of RAW264.7 cellNote: *.P<0.05;**.P<0.001.

圖3　IL-10、IL-12p40和IL27Rα的免疫熒光標(biāo)記Fig.3　Immunofluorescence labeling for IL-10,IL-12 p40 and IL-27 Rα

自從Fang等[5]使用ADMSC治療Ⅲ～Ⅳ級難治性急性移植物抗宿主病取得理想的療效后，利用ADMSC調(diào)節(jié)免疫功能收到了廣泛的關(guān)注。隨后，人們嘗試?yán)肁DMSC在免疫調(diào)節(jié)方面的作用來治療過敏性鼻炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[6-8]，并就其具體機(jī)制進(jìn)行了探討。這些研究絕大多數(shù)都是直接的將ADMSC及其分泌的細(xì)胞因子與局部組織、通路聯(lián)系起來，并在治療機(jī)制方面取得了一些進(jìn)展。單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)幾乎參與到了全身所有的炎性反應(yīng)，而且是多種炎癥反應(yīng)的啟動細(xì)胞。因此，研究ADMSC對這些具體的炎癥細(xì)胞的影響，或許可以解開ADMSC為什么會有如此強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用。

巨噬細(xì)胞可按功能劃分為3個基本亞群：①經(jīng)典活化型(M1)巨噬細(xì)胞，其代表標(biāo)志為TNF-α、IL-12 p40等。②創(chuàng)傷愈合型(M2a)巨噬細(xì)胞，其代表標(biāo)志為IGF-1、Arg-1、FIZZ1、IL-27 Rα等。③調(diào)節(jié)型巨噬細(xì)胞(包括M2b、M2c以及多種其他刺激活化的巨噬細(xì)胞)[1]，其代表標(biāo)志為IL-10、SPHK-1等。我們使用ADMSCCM干預(yù)LPS誘導(dǎo)后的RAW264.7細(xì)胞(M1)，發(fā)現(xiàn)其M1型相關(guān)指標(biāo)TNF-α mRNA以及IL-12 p40蛋白的表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)；而M2a、M2b/c部分相關(guān)指標(biāo)有不同程度上升(IGF-1、IL-10 mRNA及IL-10蛋白變化均存在統(tǒng)計學(xué)差異)。說明在ADMSCCM的干預(yù)下，已極化為M1型的巨噬細(xì)胞可在一定程度上向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其促炎作用明顯降低，促修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)功能有所增強(qiáng)。

雖然M1型巨噬細(xì)胞可以分泌多種促炎因子，具強(qiáng)大的胞吞作用，可以更有效殺傷細(xì)胞內(nèi)病原體[2]。但過度的免疫反應(yīng)同樣會造成局部組織損傷，引起多種疾病。相對M2型巨噬細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞主要分泌IL-12、TNF-α等細(xì)胞因子，它們不僅在局部組織中起到明顯的促炎作用，也是檢測M1型巨噬細(xì)胞的主要標(biāo)志。IL-12是目前發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答范圍最廣的細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的非特異性免疫反應(yīng)以及Th、CTL介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)[9]。TNF-α所誘發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)，也可導(dǎo)致局部炎癥的遷移及組織損傷[10]。ADMSC在局部組織中降低巨噬細(xì)胞IL-12和TNF-α的表達(dá)，無疑有助于改善局部的炎性損傷。

對于M2型巨噬細(xì)胞，IL-10的低表達(dá)是其共同特點(diǎn)。Mosser等[1]將其歸為調(diào)節(jié)型巨噬細(xì)胞(M2b/c)的特征。IL-10可以降低抗原呈遞作用，下調(diào)T細(xì)胞活性，還可抑制IL-1、IL-6、IL-8、THF-α、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的合成[11]。IL-27Rα是創(chuàng)傷愈合型(M2a)巨噬細(xì)胞的標(biāo)志之一。IL-27雖然屬于IL-6/IL-12家族，但其對Th1型免疫的調(diào)節(jié)是具有雙向性的[12]，并可負(fù)調(diào)控Th2型免疫反應(yīng)[13]，抑制Th17細(xì)胞分化[14]，總體上發(fā)揮抗炎效果。ADMSC降低局部巨噬細(xì)胞IL-10、IL-27的表達(dá)，對于以炎性損傷為主要病變的疾病是非常有幫助的。

綜上所述，ADMSC在移植到局部組織時，其分泌的可溶性細(xì)胞因子中的某些成分，會影響到局部組織中貯存、遷移的巨噬細(xì)胞的極化方向，誘導(dǎo)促炎的經(jīng)典活化型(M1)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，尤其是向調(diào)節(jié)型(M2b/c)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可減少過度存在的炎癥反應(yīng)，減輕局部由于炎癥反應(yīng)帶來的組織損傷。這一機(jī)制的建立，讓我們可以根據(jù)巨噬細(xì)胞參與的情況，初步明確適用于ADMSC移植治療的疾病，以及哪些治療效果好，哪些較差。從而指導(dǎo)今后的研究和臨床應(yīng)用。目前，關(guān)于巨噬細(xì)胞激化(活化)的相關(guān)通路較為明確，M2型巨噬細(xì)胞主要依賴于IL-4/IL-13激活Jak/Stat6以及IL-10激活Jak/Stat3為主。而M1型巨噬細(xì)胞主要依賴LPS及其他炎癥因子激活I(lǐng)FN-γ通路。而間充質(zhì)干細(xì)胞具體通過分泌哪些因子影響巨噬細(xì)胞激化方向，目前仍無明確的結(jié)論，這也是我們今后研究的重點(diǎn)。

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[收稿2015-06-25修回2015-07-15]

(編輯倪鵬)

Induction of macrophages differentiation to M2 type by adipose derived mesenchymal stem cells

WANGLing-Ling,TANGLi-Li,SUNMeng,WANGTian-Yang,YOUHe-Yi,ZHANGChun-Wu,YANGYi-Rong,CHENJi-Cai,ZHOUMeng-Tao,CHENBi-Cheng.

TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China

[Abstract]Objective:To explore the effect of adipose derived mesenchymal stem cells to regulate the differentiation of macrophage RAW264.7.Methods: First，we used RAW264.7 cells to simulate macrophage and induced them to M1 macrophage with lipopolysaccharide (LPS,1 μg/ml). Then we cultured these RAW264.7 cells in culture mediums which were previously used to culture adipose derived mesenchymal stem cells to imitate the transplantation of ADMSC.Last,the mRNA relative expression of IL-10,IGF-1,Arg-1,TNF-α,FIZZ1,SPHK-1 was detected by real-time PCR.The protein expression of IL-12 p40,IL-27 Rα,IL-10 was detected by Western blot.Results: After been cultured in ADMSCCM and induced by LPS,M1 markers (TNF-α mRNA，IL-12 p40；P<0.05) of the RAW264.7 cells declined while M2 markers (IGF-1 mRNA,IL-10 mRNA,IL-10;P<0.05) rose.Conclusion: ADMSC can secrete soluble cytokines to induce the RAW264.7 cell,which have been induced to the M1 macrophages,to differentiate towards M2 macrophages.

[Key words]Adipose derived mesenchymal stem cells;Macrophages;RAW264.7;Differentiation

中圖分類號R329.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0332-05

作者簡介：王玲玲(1990年-)，女，碩士，主要從事免疫學(xué)及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療方面的研究，E-mail:893257713@qq.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：陳必成(1974年-)，男，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫學(xué)和胰腺炎方面的研究，E-mail:chenbicheng@hotmail.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.008

①本文受浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃(2013C33173，2013C37046)和浙江省自然科學(xué)基金(Y2110944，LY12H05005)。

②溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，外科學(xué)重點(diǎn)實驗室，溫州325000。