蝎毒多肽提取物調(diào)控肝臟移植瘤中自然殺傷細胞浸潤的機制研究①

韓　琛　王朝霞　賈　青　王兆朋　張月英　張　鈺　王恒孝

(山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南250062)

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蝎毒多肽提取物調(diào)控肝臟移植瘤中自然殺傷細胞浸潤的機制研究①

韓琛王朝霞賈青王兆朋張月英張鈺王恒孝

(山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南250062)

[摘要]目的：觀察蝎毒多肽提取物(PESV)對H22細胞小鼠肝臟原位移植瘤模型中腫瘤浸潤自然殺傷細胞(Natural killer cell,NK cell)的浸潤分布及活性的影響。方法：C57BL/6小鼠肝臟接種H22肝癌細胞株懸液構(gòu)建原位移植瘤模型，設立正常對照組、荷瘤對照組、PESV小劑量組和PESV大劑量組，分別給予生理鹽水及PESV灌胃干預14 d，觀察比較各組小鼠給藥后的腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量及生存期變化，通過HE染色比較各組腫瘤組織形態(tài)學變化，流式細胞術(shù)和免疫組化檢測肝臟及癌組織中浸潤NK1.1+細胞的比例及分布特點，real-time PCR法檢測癌組織中穿孔素、顆粒酶B的表達。結(jié)果：PESV大、小劑量組肝臟移植瘤的生長受到抑制，腫瘤體積和瘤質(zhì)量均低于荷瘤對照組，腫瘤抑制率分別為30.77%和15.38%,生存期觀察顯示PESV大劑量組能顯著延長荷瘤小鼠生存時間，生命延長率為34.06%，P<0.05；荷瘤對照組腫瘤細胞排列緊密，異型性顯著，呈浸潤性生長，PESV大、小劑量組出現(xiàn)明顯壞死區(qū)，細胞異型性減輕；PESV大劑量組小鼠肝臟NK細胞占肝臟總淋巴細胞的比例是(5.91±0.49)%，顯著高于荷瘤對照組(3.69±0.50)%(P<0.05)，且大量浸潤分布在腫瘤組織及癌旁組織中;PESV大劑量組瘤組織中穿孔素和顆粒酶的mRNA表達量分別是荷瘤對照組的3.62倍和5.82倍(P<0.05)。結(jié)論：PESV可通過提高H22細胞肝臟原位移植瘤中浸潤NK細胞的比例，促進NK細胞向腫瘤組織遷移，誘導穿孔素和顆粒酶B的產(chǎn)生，有助于NK細胞殺傷活性的恢復，從而增強對腫瘤細胞的清除，抑制腫瘤的浸潤生長。

[關鍵詞]蝎毒；肝腫瘤；自然殺傷細胞；穿孔素；顆粒酶B

自然殺傷(Natural killer cells,NK)細胞是一類胞內(nèi)含有大顆粒、不同于T、B淋巴細胞的第三類淋巴細胞，是固有免疫系統(tǒng)重要成員之一，在抗感染、抗腫瘤等免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮重要作用，被視為機體免疫系統(tǒng)的第一道防線[1]。肝臟中含有豐富的NK細胞，而且其免疫特性表現(xiàn)出器官特異性，活化的NK細胞可以更好地清除機體內(nèi)的腫瘤細胞，抑制腫瘤的生長[2]。原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生過程中，由于腫瘤細胞表面相關抗原的改變及微環(huán)境中細胞因子、免疫細胞的相互作用，NK細胞的活性大大降低，導致腫瘤細胞的逃逸。如何提高并恢復NK細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷效應，成為抗腫瘤免疫治療的重要手段[3]。蝎毒多肽提取物(Polypeptide extract from scorpion venom,PESV)是從東亞鉗蝎蝎毒中提取的活性物質(zhì)，本實驗室前期研究表明PESV對多種腫瘤細胞具有抑制作用，可抑制腫瘤血管生成、干預腫瘤免疫逃逸發(fā)生[4]，PESV在抑制腫瘤增殖過程中是否對機體NK細胞的免疫活性有調(diào)節(jié)作用尚未有相關報道，本實驗通過觀察PESV對H22細胞小鼠肝臟原位移植瘤腫瘤組織中NK細胞的浸潤分布及功能的影響，探討PESV對機體固有免疫的調(diào)節(jié)作用，為肝癌的免疫治療提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及細胞6～8周C57BL/6 小鼠，雄性，體重20～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號 SCXK2014-0004,飼養(yǎng)于山東省醫(yī)學科學院基礎研究所實驗動物房IVC(智能型獨立送回風凈化籠具)中，動物在室溫(22±2)℃、相對濕度50%條件下自由攝食飲水，動物購入適應5 d后開始試驗。鼠源性H22肝癌細胞株由本室保存，應用時復蘇后接種于昆明小鼠腹腔內(nèi)，接種三代后取增殖良好的細胞用于實驗。

1.1.2試劑和儀器PESV由本室研制，提取方法見參考文獻[5]，使用時用無菌生理鹽水稀釋。Percoll購自Solarbio公司，小鼠CD3-FITC(Cat.No.553 061)、NK1.1-PE-CY7(Cat.No.5620 62)標記熒光單克隆抗體購自BD公司，兔抗鼠NK1.1抗體購自Abcam公司(ab197979)，Trizol購自Invitrogen公司、TransScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、TransScript? Green qPCR Sup-erMix UDG試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。穿孔素、顆粒酶引物購自上海鉑尚生物公司。Bio-Rad MyCycleTMThermal Cycler梯度PCR儀、實時熒光定量PCR LightCycler 480儀購自德國Roche公司；Leica DM4000B光學顯微、LeicaQWin V3圖像分析軟件購自德國徠卡儀器有限公司。流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1H22細胞肝臟原位移植瘤模型的建立、分組及給藥選取腹腔接種H22肝癌細胞株后腹水生長良好的小鼠無菌抽取腹水，洗滌后用生理鹽水重懸細胞，顯微鏡下細胞計數(shù)，經(jīng)臺盼藍染色法檢測細胞存活率>95%，調(diào)整細胞濃度至2×106ml-1，置于冰上待用。采用5%水合氯醛(0.06 ml/10 g)小鼠腹腔注射進行麻醉，取仰臥位固定于實驗板上，碘伏消毒皮膚，劍突下沿腹中線縱行切口，逐層剪開皮膚和腹膜，充分暴露肝左葉。用微量注射器抽取50 μl H22細胞懸液(含細胞數(shù)1×105個)緩慢注入肝臟實質(zhì)，按壓至不出血后逐層縫合切口。術(shù)后24 h將小鼠隨機分為荷瘤對照組(Control)、PESV小劑量組(PEVS-L,10 mg/kg)、PESV大劑量組(PESV-H,40 mg/kg),每組8只。術(shù)后3 d開始灌胃給藥，灌胃容量0.1 ml/10 g鼠重，每日一次，荷瘤對照組采用等體積生理鹽水灌胃，共計14 d。另取6只正常小鼠作為正常對照(Normal)。

1.2.2H22細胞肝臟原位移植瘤小鼠生存期觀察按1.2.1方法接種H22細胞后隨機分組，每組各8只，分別連續(xù)灌胃給藥14 d，于末次給藥后24 h開始記錄各組動物存活天數(shù)、存活數(shù)量至其自然死亡，根據(jù)公式：生存延長率=(實驗組平均生存天數(shù)-荷瘤對照組平均生存天數(shù))/荷瘤對照組平均生存天數(shù)×100%，計算生命延長率。

1.2.3取材各組動物末次給藥24 h后摘取眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，取肝臟腫瘤組織，測量瘤組織最大(a)及最小(b)直徑，根據(jù)公式計算腫瘤體積(V)，V=ab2/2[6]，腫瘤抑制率(%)=[荷瘤對照組瘤質(zhì)量(g)-用藥組瘤質(zhì)量(g)]/荷瘤對照組瘤質(zhì)量(g)×100%。部分腫瘤及癌旁組織采用中性甲醛固定及-80℃凍存，部分腫瘤組織及肝組織機械研磨分離單核細胞。

1.2.4HE染色及腫瘤組織形態(tài)學觀察腫瘤組織4%中性甲醛固定24 h后，常規(guī)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片，厚度4 μm；切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，采用蘇木素-伊紅染色，水洗后，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片，鏡下觀察原位移植瘤組織形態(tài)變化。

1.2.5流式細胞術(shù)對肝臟及腫瘤浸潤組織中NK細胞的檢測剪碎肝臟組織，200目濾網(wǎng)進行冰上研磨，加入RPMI1640保持組織濕潤。將研磨后的肝組織收集于離心管中，冰浴自然沉降后，吸取上層液體離心，1×PBS洗2次。采用非連續(xù)密度梯度Percoll法分離淋巴細胞[7]：用3 ml 40% Percoll溶液重懸沉淀，用吸管將其疊加于70% Percoll溶液上，離心后用滴管小心吸取2層Percoll溶液界面的白膜層至另一離心管中，離心洗滌后收集得到的細胞即為單核細胞，進行臺盼藍染色計算細胞存活率。將分離得到的單核細胞每個樣本均取1×106細胞加入流式管中，大鼠血清封閉后加入相應的熒光抗體(FICT-CD3，PE-Cy7-NK1.1)孵育30 min，洗滌后重懸細胞并上機檢測。

1.2.6免疫組織化學檢測腫瘤及癌旁組織中NK1.1陽性細胞分布及結(jié)果判定腫瘤組織用4%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片，脫水后采用檸檬酸鈉抗原修復液(0.01 mol/L,pH6.0)進行抗原修復。正常山羊血清封閉后滴加兔抗鼠NK1.1(1∶200)一抗，4℃冰箱孵育過夜；漂洗3次后山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，DAB顯色劑顯色，蘇木素復染。陰性對照用PBS代替抗體。判定標準：NK1.1主要表達于C57BL/6小鼠NK細胞膜表面，參考Schmidt等[8]以及我們之前介紹的雙評分半定量法[9]對染色結(jié)果進行評分，在400倍高倍鏡下隨機選取10個視野，根據(jù)染色強度和陽性細胞所占百分比例進行判定：陽性細胞區(qū)域分4級，陽性率<10%為1級計1分，10%～50%為2級計2分，50%～80%為3級計3分，>80%為4級計4分。染色強度按以下標準評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩種評分相加記為免疫組化染色評分，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中等陽性(++)，4分以上為強陽性(+++)。

1.2.7Real-time PCR法檢測癌及癌旁組織中穿孔素、顆粒酶mRNA的表達取冰凍肝癌組織采用TRizol 法提取總RNA，20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系按照試劑盒操作說明進行，反應程序為42℃ 30 min和85℃ 5 min。Real-time PCR選用20 μl反應體系包括1 μl RT產(chǎn)物，0.4 μl 上游引物，0.4 μl 下游引物，10 μl 2×TransStrat Green qPCRSuperMix UDG，ddH2O至20 μl。引物序列見表1，反應條件為 94℃ 10 min，94℃ 5 s,60℃ 30 s,72℃ 10 s,40個循環(huán)，熒光信號檢測。結(jié)果處理用β-actin作內(nèi)參。每個樣本設置3個復孔，取Ct平均值，采用2-ΔΔCt相對定量的方法表示基因的相對表達量。試驗重復3次。

2結(jié)果

2.1PESV的抑瘤作用及對荷瘤小鼠的生存期影響經(jīng)過14 d用藥處理，PESV-H組與Control組相比小鼠腫瘤體積顯著減小(80.19±28.75 mm3vs.143.44±60.36 mm3,P<0.05)，瘤質(zhì)量降低明顯(0.18±0.0.04 g vs.0.26±0.02 g,P<0.01)；PESV-L組與Control組相比腫瘤體積無顯著差異[(96.63±28.17)mm3vs.(143.44±60.36)mm3,P>0.05]、瘤質(zhì)量減小[(0.22±0.05)g vs.(0.26±0.02)g,P<0.05]。PESV-H、PESV-L組腫瘤抑制率分別為30.77%和15.38%。各組小鼠生存時間顯示，PESV-H、PESV-L組均能延長荷瘤小鼠生存時間，平均生存時間分別(38.38±1.44)d和(33.75±1.53)d，高于Control小鼠(28.63±2.09)d，生命延長率分別為34.06%和17.88%，其中PESV-H組與Control組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，能顯著延長小鼠的荷瘤生存時間，見圖1。

表1穿孔素、顆粒酶B引物序列及產(chǎn)物長度

Tab.1Perforin and Granzyme B primer sequences and products length

GenePrimer(5'-3')SequencesProductslength(bp)PerforinForwardCTGCCACTCGCTCAGAATGReverseCGGAGGGTATTCACATCCAT88GranzymeBForwardTGTGAAGGGCAGGAGATGTGTGCTAReverseTCAGCTCAGCCTCTTGTAGCGTGT92β-actinForwardGGCTGTATTCCCCTCCATCGReverseCCAGTTGGTAACAATGCCATGT156

圖1　PESV對肝臟移植瘤組織生長及小鼠生存期的影響Fig.1　Effects of PESV on orthotopic transplantation tumor in liver and survival time of miceNote: Ⅰ.A.Normal control group;B.Control group;C.PESV-L group;D.PESV-H group;Ⅱ.The tumor volume and weight of each group;Ⅲ.The average of survival time on each group.Compared with the control group,*.P<0.05；compared with the control group,**.P<0.01.

圖2　PESV對小鼠肝臟移植瘤組織形態(tài)學變化的影響(光學顯微鏡，×100)Fig.2　Histomorphology changes of orthotopic transpla-ntation tumor with PESV treatment in liver of mice(Optical microscope,×100)Note: A.Normal control group;B.Control group;C.PESV-L group;D.PESV-H group.

2.2PESV對原位移植瘤組織病理學變化的影響HE染色顯示，與正常對照相比荷瘤對照組小鼠腫瘤浸潤區(qū)肝小葉結(jié)構(gòu)異常，瘤細胞異型性明顯，大小不等，形狀各異，染色質(zhì)明顯增多，細胞核深染，呈現(xiàn)分葉、多核等病理性核分裂，腫瘤細胞排列緊密，呈浸潤性生長。PESV處理后可見瘤組織壞死區(qū)域有所增加，細胞異型性減輕，PESV-H組壞死區(qū)域增加顯著(圖2)，提示PESV能通過促進腫瘤組織壞死，增強對腫瘤的清除作用。

2.3PESV對移植腫瘤組織中浸潤NK的影響對各組小鼠肝臟組織及腫瘤組織提取總淋巴細胞，流式細胞檢測結(jié)果顯示，與Normal組相比，Control組NK細胞占設門中總淋巴細胞的頻數(shù)顯著降低(3.69±0.50)% vs.(6.90±0.22)%(P<0.05)，經(jīng)PESV不同劑量干預作用后，NK1.1陽性細胞的頻數(shù)呈增加趨勢，分別為(4.13±0.43)%和(5.91±0.49)%，其中PESV-H組與Control組組間比較差異顯著(P<0.05)，見圖3，提示經(jīng)PESV干預后腫瘤環(huán)境中浸潤的NK細胞增加。

圖3　PESV對肝臟移植瘤小鼠肝臟及瘤組織浸潤淋巴細胞中CD3-NK1.1+細胞比例的影響Fig.3　Effects of PESV on the proportion of NK cells in liver and tumor-infiltrating lymphocytesNote: A.Normal control group;B.Control group;C.PESV-L group;D.PESV-H group.Compared with the normal group,*.P<0.05；compared with the control group,**.P<0.05.

2.4PESV對移植瘤組織中浸潤NK細胞分布的影響NK1.1主要表達在C57B L/6小鼠NK細胞胞膜，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色呈棕黃色顆粒。Control組中NK1.1陽性細胞零星分布，經(jīng)PESV藥物作用后，陽性細胞大量聚集分布于癌旁組織中，在壞死的腫瘤組織中也出現(xiàn)陽性細胞(圖4)。經(jīng)秩和檢驗顯示，PESV-H組NK1.1+細胞顯著多于Control組，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

圖4　PESV對肝臟移植瘤小鼠腫瘤組織中NK1.1+細胞浸潤分布的影響(免疫組化，×200)Fig.4　Effects of PESV on NK1.1+cell infiltration in different HCC tissues of C57BL/6 mice(IHC，×200)Note: A.Tumor-bearing control group;B.PESV-L group;C.PESV-H group.

表2不同分組肝癌組織中NK細胞的浸潤程度

Tab.2Infiltration of NK1.1+cells in HCC tissue of different groups

Groups-++++++Control4310PESV-L2312PESV-H1)1133

Note：1)P=0.017.

2.5PESV對肝臟移植瘤小鼠腫瘤組織中穿孔素、顆粒酶B表達變化的影響與Control組相比，經(jīng)PESV不同劑量作用后，腫瘤組織中穿孔素、顆粒酶B的表達均呈增加趨勢，PESV-H組與Control組間比較差異顯著，分別是Control組的3.62倍和5.82倍，(P<0.05，P<0.01)(圖5),PESV-L組與Control組間、PESV-H組與PESV-L組組間比較無顯著性差異(P>0.05)。

3討論

自然殺傷細胞是機體固有免疫系統(tǒng)中重要成員，它識別靶細胞無MHC限制性，無需抗原預先致敏即可直接殺傷腫瘤細胞，清除體內(nèi)突變細胞，發(fā)揮免疫監(jiān)視功能[10-13]。肝臟作為機體重要的“天然免疫器官”，含有豐富的免疫細胞，其中NK細胞約占肝臟淋巴細胞的30%～50%，是其他器官或組織的5～10倍，而且肝臟NK細胞在免疫表型、形態(tài)及功能特征上都表現(xiàn)器官特異性，較外周NK細胞具有更強的細胞毒活性和對腫瘤細胞的殺傷能力[14]。盡管如此，仍有一定比例的原發(fā)性肝癌細胞逃避機體免疫監(jiān)視形成腫瘤。Guo等[15]發(fā)現(xiàn)HCC患者外周血中NK細胞3種亞群CD3-CD56+、CD3-CD57+、CD3-CD161+含量類似于健康志愿者，但在HCC癌組織中，CD3-CD56+、CD3-CD57+NK細胞比例顯著低于癌旁組織，這種降低可能受腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、骨髓來源的抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSC)、細胞因子TGF-β及缺氧、低pH值等因素影響，致使NK細胞無法正常識別靶細胞，使腫瘤細胞逃避了NK細胞的殺傷[16-24]。

圖5　PESV對腫瘤組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA的影響Fig.5　Effects of PESV on perforin and granzyme B expression detected by real-time PCR in tumor tissuesNote: *.P<0.05,compared with the control group;**.P<0.01,compared wtih the control group.

NK細胞發(fā)揮腫瘤殺傷作用主要通過其表面的活化性受體識別并黏附靶細胞，通過分泌相應細胞因子和釋放細胞毒性穿孔素、顆粒酶等溶解、誘導靶細胞死亡[25，26]。穿孔素(Perforin)是一種具有溶細胞作用的糖蛋白，主要存在于細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和NK細胞質(zhì)的細胞毒顆粒中。穿孔素具有很高的磷酸膽堿親和性，能促進與膜的融合并在膜上形成跨膜通道,導致靶細胞發(fā)生滲透性溶解，是機體抗腫瘤的主要方式之一[27]。穿孔素常與顆粒酶B(Granzyme B)協(xié)同發(fā)揮殺傷作用，誘導DNA斷裂并參與多條凋亡途徑，促使靶細胞凋亡[28]。

蝎毒多肽提取物是本實驗室自東亞鉗蝎蝎毒中提取的包含50～60個氨基酸多肽混合物，前期實驗表明PESV具有多種生物活性，對多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用，它可以通過抑制腫瘤微環(huán)境中的細胞因子TGF-β和VEGF的表達,在抑制腫瘤組織血管生成的同時，促進樹突狀細胞(DC)表面共刺激分子CD80/CD86的表達，提高抗原攝取與遞呈能力，解除DC的免疫逃逸狀態(tài)[29,30]。本研究在前期研究基礎上，采用直接注射法構(gòu)建小鼠H22細胞肝臟原位移植瘤模型，與皮下移植瘤相比能較好地表現(xiàn)肝癌發(fā)生過程中免疫應答過程。給予PESV大、小劑量藥物14 d處理后，腫瘤的體積和腫瘤質(zhì)量分別為[(80.19±28.75)mm3,(0.18±0.04)g]和[(96.63±28.17)mm3,(0.22±0.05)g]，與荷瘤對照組[(143.44±60.36)mm3,(0.26±0.02)g]相比均減小，抑瘤率分別為30.77%和15.38%,表明PESV對小鼠H22細胞原位移植瘤有一定抑制作用。通過對荷瘤小鼠生存時間的觀察發(fā)現(xiàn)PESV大、小劑量組的荷瘤小鼠平均生存時間分別為(38.38±1.44 d，33.75±1.53 d)，較荷瘤對照組小鼠(28.63±2.09 d)生存時間延長，生命延長率分別為33.06%及17.88%，表明PESV可延長小鼠荷瘤生存時間。對肝臟腫瘤組織病理形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)荷瘤對照組形成致密瘤組織，瘤細胞具有顯著的異型性，核深染，出現(xiàn)病理性核分裂象，給藥后瘤組織出現(xiàn)不同程度的壞死，且在癌旁組織中有大量炎性細胞浸潤。經(jīng)進一步觀察PESV對肝癌組織中浸潤NK細胞的影響，正常對照組與荷瘤對照組NK 細胞占淋巴細胞比例分別為(6.90±0.22)%和(3.69±0.50)%，表明在腫瘤發(fā)生過程中NK細胞受到顯著抑制，給予PESV大、小劑量干預后，NK細胞在淋巴細胞中的比例分別為(5.91±0.49)%和(4.13±0.42)%，其中大劑量組顯著升高(P<0.05)，提示PESV能提高NK細胞的浸潤程度。免疫組織化學結(jié)果證實，PESV處理后NK1.1陽性細胞主要聚集分布在癌旁組織，浸潤數(shù)量顯著高于荷瘤對照組。以上結(jié)果提示，給予PESV治療可以上調(diào)腫瘤浸潤NK細胞的比例，影響其分布，在一定程度上促進其免疫監(jiān)視功能的恢復，由于受腫瘤局部微環(huán)境等因素的影響無法恢復至正常或超過正常水平，導致腫瘤仍緩慢進展。采用實時熒光定量PCR檢測肝癌組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA的表達，結(jié)果表明與荷瘤對照組比較，PESV大劑量組瘤組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA相對表達量均出現(xiàn)顯著升高，由此推斷PESV能通過上調(diào)NK細胞穿孔素、顆粒酶B的表達，提高NK細胞的活性，增強對腫瘤細胞的清除作用。

綜上所述，PESV可以通過調(diào)控肝癌組織中浸潤NK細胞的比例及分布，提高NK細胞穿孔素和顆粒酶B mRNA的表達，增強對腫瘤細胞的清除作用，有助于恢復機體免疫監(jiān)視功能，進一步揭示了PESV抗腫瘤作用的免疫學機制，為臨床中西醫(yī)聯(lián)合治療及NK細胞免疫過繼療法提供實驗依據(jù)。

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[收稿2015-07-11修回2015-08-04]

(編輯倪鵬)

Regulatory mechanism of PESV on tumor-infiltrating natural killer cells in liver orthotopic transplantation tumor

HANChen,WANGZhao-Xia,JIAQing,WANGZhao-Peng,ZHANGYue-Ying,ZHANGYu,WANGHeng-Xiao.

InstituteofBasicMedicine,ShandongAcademyofMedicalSciences;SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China

[Abstract]Objective:To investigate the regulatory mechanism of PESV on tumor-infiltrating natural killer(NK) cells in a mice model with H22 orthotopic transplantation tumor.Methods: Suspensions of H22 cells were injected into the lobe of liver on C57BL/6 mice for establishing liver orthotopic transplantation tumor model ,then the mice were randomly divided into four groups:normal group，control group,PESV low dose group(PESV-L) and PESV high dose group(PESV-H).Mice were either sacrificed for mechanistic studies or survival followed 14 days of therapy.The volume and weight of the tumor were measured.The proportion of infiltrating NK cells was measured by flow cytometry and the expression of NK1.1(NK) cells was investigated by immunohistochemistry method.The expression of perforin and granzyme B were further investigated by real-time PCR.Results: In contrast to control group,the tumor inhibition rate was 15.38% and 30.77% in PESV-L group and PESV-H group respectively.The survival showed that PESV-H could significantly prolong the survival time of mice,and life extension rate was 34.06%,(P<0.05).Histological analysis revealed significant pleomorphism of the neoplastic cells and invasive extendion in control group,while there were more necrosis and less degree of atypia in PESV-L and PESV-H.The level of tumor-infiltrating NK cell was significantly higher in PESV-H than in tumor-bearing control group [(5.91±0.49)% vs.(3.69±0.50)%,P<0.05],and NK cells were infiltrating in peritumoral lesions.The mRNA of perforin and granzyme B in PESV-H were respectively 3.62 and 5.82 times than that of control group(P< 0.05).Conclusion: These findings suggest that the treatment of PESV might increase the infiltration of natural killer cells in the orthotopic transplantation tumor and contribute to NK cells migration to the tumor,which induct and maintain the activities of natural killer cells against tumor cells by expressing perforin and granzyme B in vivo.

[Key words]Scorpion venom;Hepatocellular carcinoma;Natural killer cells;Perforin;Granzyme B

中圖分類號R73-36

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0390-07

作者簡介：韓琛(1981年-)，女，碩士，助教，主要從事腫瘤免疫學方面研究，E-mail ：441626282@qq.com。通訊作者及指導教師：王恒孝(1964年-)，男，博士，碩士生導師，主要從事腫瘤免疫學方面的研究， E-mail: wanghengxiao@aliyun.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.021

①本文為國家自然科學基金青年基金項目(81303077)和山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2013WS0369)。