臭氧關(guān)節(jié)腔注射對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠趨化因子水平的影響

柏林昆,劉寧寧,王?，?蘇雅珍,郭瑞團(tuán),和 平,任利民,高文琴,張麗中,張改連

(1山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，山西白求恩醫(yī)院，山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院，同濟(jì)山西醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，太原 030032；2山西醫(yī)科大學(xué)第五醫(yī)院，山西省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科；*通訊作者,E-mail:Zgl1118@163.com)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以炎癥性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外受累為特征的全身慢性自身免疫性疾病，可因免疫紊亂引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及異常分泌細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致滑膜增生、血管翳形成和骨破壞[1,2]。研究表明RA患者血清中趨化因子異常表達(dá)[3]。而在RA患者滑膜炎癥組織中，趨化因子和趨化因子受體結(jié)合既可通過(guò)促進(jìn)白細(xì)胞募集、刺激血管生成[4,5]；又能調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡來(lái)影響骨代謝[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)RA患者的血漿、滑液和滑膜組織中人巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(human macrophage chemoattractant protein-1, MCP-1)和調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(reduced upon activation, normal T cell expressed and secreted, RANTES)水平升高[8]。MCP-1和RANTES通過(guò)募集RA相關(guān)炎性細(xì)胞，促進(jìn)炎癥的發(fā)生[9-11]。C-X-C配體10(C-X-C ligand10，CXCL10)又稱為干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10，與其受體C-X-C趨化因子受體3(C-X-C chemokine receptor-3，CXCR3)結(jié)合后可趨化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，促進(jìn)Th1炎癥反應(yīng)[12]。在RA動(dòng)物模型中，CXCL10/CXCR3軸的激活可以促進(jìn)CIA小鼠滑膜成纖維細(xì)胞的侵襲[13]；而抑制CXCL10/CXCR3軸水平已被證明可以減少受損關(guān)節(jié)部位炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而減輕關(guān)節(jié)炎癥和骨侵蝕[4,14]。在分子水平上，趨化因子能夠激活核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB, RANK)-RANK配體(RANK ligand, RANKL)信號(hào)通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟和分化[15]。

臭氧(ozone，O3)，又稱三原子氧，是一種不穩(wěn)定且具有強(qiáng)氧化性的分子。一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，O3療法已被廣泛使用并進(jìn)行了大量研究。目前已證實(shí)O3治療具有抑制病原微生物、激活氧代謝、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、副作用小且可預(yù)防的特點(diǎn)[16]。有關(guān)RA動(dòng)物模型的研究表明，O3處理可抑制促炎細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-6)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的產(chǎn)生，增加抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，減輕關(guān)節(jié)炎癥，重建細(xì)胞氧化還原平衡[17,18]。同時(shí)，O3還可能對(duì)RA發(fā)生發(fā)展過(guò)程中異常表達(dá)的RANKL/RANK/骨保護(hù)素信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控[19]。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，與甲氨蝶呤(MTX)單藥治療相比，MTX聯(lián)合O3更能降低RA患者的疾病活動(dòng)度[20]。然而，目前還沒(méi)有研究證實(shí)O3關(guān)節(jié)腔注射對(duì)RA發(fā)生發(fā)展過(guò)程中趨化因子表達(dá)水平的影響。本研究旨在采用O3關(guān)節(jié)腔注射對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis, CIA)大鼠進(jìn)行干預(yù)，評(píng)估其對(duì)關(guān)節(jié)滑膜組織的影響，檢測(cè)血清中MCP-1、RANTES、CXCL10的水平，滑膜組織CXCR3蛋白的表達(dá)，以及滑膜組織、淋巴結(jié)和脾臟中CXCL10和CXCR3的mRNA表達(dá)水平，同時(shí)將MTX和O3單藥治療效果進(jìn)行對(duì)比，從相關(guān)趨化因子角度探討O3治療RA炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雌性Wistar大鼠40只，年齡(49±5)d，160～180 g，由中國(guó)北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，證書號(hào)：SCXK【軍隊(duì)】，2012-0004，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，稱重標(biāo)記，采用亂數(shù)表法將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=8)和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M(n=32)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：20 ℃室溫，50%相對(duì)濕度，定時(shí)喂食，自由攝水，光照周期(8 h光線和16 h黑暗)。

1.1.2 主要試劑與儀器 天然牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑(CFA)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)于德國(guó)QIAGEN公司。流式細(xì)胞儀(型號(hào)：NovoCyte D1040)購(gòu)于艾森生物(杭州)有限公司。臭氧發(fā)生器購(gòu)于德國(guó)赫爾曼公司。X射線攝影設(shè)備購(gòu)于美國(guó)飛利浦公司。LEICA RM-223 5型切片機(jī)購(gòu)于德國(guó)LEICA公司。Olympus BX41照相顯微鏡購(gòu)于美國(guó)Media Cybernetics公司。Image-ProPlus 5.1圖形軟件分析系統(tǒng)為美國(guó)Media Cybernetics公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 CIA大鼠模型的制備 本研究采用注射用完全弗氏佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原，于適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后誘導(dǎo)大鼠CIA模型，具體方法如下：牛Ⅱ型膠原蛋白在0.1 mol/L的冰乙酸中溶解，濃度為2 mg/ml，4 ℃過(guò)夜，次日在無(wú)菌冰浴條件下用等量完全弗氏佐劑(CFA)充分混勻乳化。配制成質(zhì)量濃度為1 g/L即每1 ml溶劑含1 mg牛Ⅱ型膠原的乳化液。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠腹腔注射5%水合氯醛5 ml/kg用以麻醉，注射部位使用75%酒精消毒后，分別在大鼠背部3點(diǎn)、尾根部和任一后足掌皮內(nèi)注射乳化液共0.5 ml(含牛Ⅱ型膠原0.5 mg)。加強(qiáng)免疫于初次免疫1周后在大鼠腹腔注射0.2 ml乳化液(含牛Ⅱ型膠原蛋白0.2 mg)，誘導(dǎo)CIA模型。正常對(duì)照組不予以任何特殊處理。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)方案 上述32只雌性大鼠中24只成功建立CIA模型。將造模成功的24只大鼠按亂數(shù)表法隨機(jī)分為3組：CIA組、臭氧干預(yù)組(O3組)及甲氨蝶呤干預(yù)組(MTX組)，每組8只，分籠飼養(yǎng)。O3組，在雙踝關(guān)節(jié)局部注射臭氧(40 μg/ml)1 ml，每周1次，連續(xù)3周[18]；MTX組，腹腔注射MTX 0.9 mg/kg，每周1次，連續(xù)3周[21]；CIA組(陽(yáng)性對(duì)照組)和正常對(duì)照組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，用法同上。

1.2.3 標(biāo)本制備 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(5周)向各組Wistar大鼠腹腔注射5%的水合氯醛(5 ml/kg)麻醉，采用頸椎脫位法處死。內(nèi)眥靜脈收集外周血并離心，取上清液-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。然后立即解剖獲取新鮮脾臟、淋巴結(jié)和滑膜組織以備下一步研究。新鮮組織分別標(biāo)記:一部分浸泡于4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，石蠟包埋進(jìn)行免疫組化研究，另一部分儲(chǔ)存于液氮容器(-190 ℃)以便進(jìn)行RT-PCR分析。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血清中MCP-1、RANTES、CXCL10的表達(dá)水平 解凍上清液，采用梯度稀釋法制備標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)用流式細(xì)胞儀和多項(xiàng)趨化因子檢測(cè)試劑盒(北京曠博生物技術(shù)有限公司)測(cè)定血清趨化因子濃度，采用Cell-Quest軟件(Becton Dickinson)和Windows多文檔接口流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)滑液組織中CXCR3蛋白的表達(dá) 滑膜組織經(jīng)石蠟包埋后進(jìn)行冷凍，使石蠟變成固態(tài)，將其切為厚度為5 μm的切片，貼附在清潔載玻片上，置于烤箱37 ℃恒溫干燥4 h以上；分梯度脫蠟；3% H2O2室溫下孵育10 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性；PBS洗滌；抗原修復(fù)；血清封閉；CXCR3單克隆抗體孵育，4 ℃冰箱過(guò)夜；常溫下40 min后PBS緩沖液沖洗；切片上覆蓋聚合物輔助劑20 min，PBS洗滌；滴加山羊抗兔IgG多聚體抗體，37 ℃恒溫箱中孵育30 min后PBS洗滌；DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察蒸餾水沖洗終止顯色；蘇木素再次染色，脫水封片。通過(guò)光學(xué)顯微鏡攝取組化圖像，輸入Image-Proplus 5.1圖形分析系統(tǒng)，按照標(biāo)準(zhǔn)分辨率截取200倍圖像。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)CXCL10、CXCR3在滑膜組織、淋巴結(jié)和脾臟中的mRNA表達(dá)水平 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)滑膜組織、淋巴結(jié)和脾臟中CXCL10、CXCR3的mRNA表達(dá)水平?？俁NA提取方法如下：用Trizol試劑對(duì)組織樣品裂解，裂解液離心(12 000 r/min，4 ℃，15 min)；用苯酚-氯仿混合物提取上清液中RNA，冰異丙醇沉淀，離心(7 500 r/min，4 ℃，5 min)，棄上清；將沉淀物(RNA)重新溶解于經(jīng)焦炭酸二乙酯(DEPC)處理過(guò)的H2O中，瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA條帶。利用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，序列見(jiàn)表1。采用Rotor-Gene SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄和cDNA擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增混合液配置：20 μl×4管，反應(yīng)體系:5×TSRT Buffer 8 μl，2.5 mmol/L dNTP 6 μl，10 μmol/L引物各2 μl，Taq酶0.4 μl，cDNA 4 μl，ddH2O 53.6 μl。PCR程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；Tm退火30 s；72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延長(zhǎng)7 min。利用Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行分析，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)分析。

表1 引物名稱及序列Table 1 Name and sequence of primers

2 結(jié)果

2.1 O3治療可以降低CIA大鼠血清CXCL10水平

CIA組大鼠血清MCP-1、RANTES、CXCL10濃度明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。與CIA組相比，O3組大鼠血清CXCL10濃度明顯降低(P<0.05)；而O3組與CIA組大鼠血清MCP-1、RANTES濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。O3組與MTX組大鼠血清CXCL10濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖1)。

與Con組比較，*P<0.05；與CIA組比較，#P<0.05圖1 大鼠血清趨化因子MCP-1、RANTES和CXCL10表達(dá)水平比較Figure 1 Comparison of serum chemokines MCP-1, RANTES and CXCL10 levels in rats between groups

2.2 O3治療可抑制CIA大鼠滑膜組織中CXCR3的蛋白表達(dá)

CXCR3作為CXCL10的受體，在CIA大鼠滑膜組織中異常表達(dá)。免疫組化分析顯示，各組大鼠滑膜組織中CXCR3為胞漿型表達(dá)。正常對(duì)照組大鼠滑膜組織中隱約可見(jiàn)核周淡黃色著色，滑膜組織為2～3層滑膜細(xì)胞，CXCR3呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)(見(jiàn)圖2A)；CIA組大鼠可見(jiàn)滑膜組織增生，其內(nèi)分布有10～20層滑膜細(xì)胞，核周胞漿彌漫分布黃褐色著色，CXCR3表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(見(jiàn)圖2B)；O3組和MTX組大鼠滑膜組織中可見(jiàn)散在褐色或淡黃色胞漿染色，滑膜細(xì)胞約4～6層，與正?；そM織相近，CXCR3呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)(見(jiàn)圖2C，D)。經(jīng)O3和MTX治療后，CXCR3表達(dá)水平明顯下降，主要表現(xiàn)為陽(yáng)性免疫染色區(qū)域面積減少且染色變淺(見(jiàn)圖2C，D)。以上結(jié)果表明，O3與MTX作用相似，可抑制CIA大鼠滑膜組織中CXCR3的蛋白表達(dá)。

A.正常對(duì)照組B.CIA組C.O3治療組D.MTX治療組圖中箭頭所指為滑膜細(xì)胞圖2 免疫組化檢測(cè)大鼠滑膜組織CXCR3的表達(dá) (蘇木精染色，×200)Figure 2 Expression of CXCR3 in synovial tissue of rats by immunohistochemical staining (hematoxylin staining,×200)

2.3 各組大鼠不同組織中CXCL10、CXCR3的mRNA表達(dá)水平比較

RT-PCR結(jié)果顯示，在滑膜組織和淋巴結(jié)中CIA組大鼠CXCL10、CXCR3的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。與CIA組比較，O3組滑膜組織中CXCL10和CXCR3的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；而淋巴結(jié)中CXCL10和CXCR3的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MTX組滑膜組織中CXCR3的mRNA表達(dá)水平與O3組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在脾臟組織中，CIA組CXCL10的mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較顯著增加(P<0.05)。O3組與CIA組相比，脾臟中CXCL10和CXCR3的mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖3)。

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與CIA組比較，#P<0.05圖3 RT-PCR檢測(cè)大鼠滑膜、淋巴結(jié)、脾臟組織中CXCL10和CXCR3的mRNA表達(dá)水平Figure 3 The mRNA levels of CXCL10 and CXCR3 in synovial membranes, lymph nodes, and spleen tissues of rats by RT-PCR

3 討論

RA是目前最常見(jiàn)的慢性病之一，治療不及時(shí)極易出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形和多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。MTX作為治療RA的一線用藥，作用機(jī)制多樣，包括阻斷炎癥細(xì)胞DNA的合成、降低RANKL/OPG比率等[22]。研究發(fā)現(xiàn)MTX治療并不能完全阻止RA患者的影像學(xué)進(jìn)展，且長(zhǎng)期使用部分患者可能會(huì)出現(xiàn)病理性多器官毒性，從而限制了其治療潛力[22,23]。因此，臨床上常常將MTX與其他藥物聯(lián)合使用。O3是一種極易溶于血液和組織液的藍(lán)色氣體，早期被用于治療戰(zhàn)傷，發(fā)揮抗炎殺菌的作用[24]。近年來(lái)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射O3已經(jīng)成為治療骨關(guān)節(jié)炎的一種新方法，其不僅能夠通過(guò)控制氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)激活機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，保護(hù)軟骨細(xì)胞，發(fā)揮抗炎作用[25]；還能通過(guò)抑制致痛物質(zhì)(如前列腺素和緩激肽)的合成和釋放，減輕疼痛，增加患者依從性[26]。本課題組前期研究表明40 μg/ml的O3關(guān)節(jié)腔注射可以減輕CIA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度，降低血清促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、VEGF的水平以及骨破壞相關(guān)分子RANKL、RANKL/OPG比值，與MTX療效相當(dāng)[18,19]。

趨化因子可分為CXC、CC、C、CX3C四大亞族，不僅能在疾病初期調(diào)控穩(wěn)態(tài)免疫細(xì)胞的遷移，加重疾病的病理狀態(tài)；還能由炎癥狀態(tài)下特定的細(xì)胞誘導(dǎo)和表達(dá)，在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[27]。研究發(fā)現(xiàn)RA患者的血漿、滑液和滑膜組織中MCP-1和RANTES水平升高[8]。趨化因子在RA患者血清和滑液中的高表達(dá)能夠驅(qū)使炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，特別是CC類趨化因子RANTES和MCP-1[28,29]。RANTES主要引起T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，而MCP-1則可以驅(qū)使滑膜巨噬細(xì)胞的聚集。我們的研究結(jié)果表明O3治療可降低CIA模型大鼠血清中MCP-1、RANTES和CXCL10的異常表達(dá)。因此，O3治療抑制趨化因子的表達(dá)可能直接或間接抑制RA炎癥反應(yīng)。

CXCL10屬于CXC類趨化因子，其受體CXCR3主要(但不完全)由Th1細(xì)胞表達(dá)[30]。與受體結(jié)合后，CXCL10/CXCR3軸可促進(jìn)RA滑膜CD4+T細(xì)胞中RANKL的表達(dá)，在破骨細(xì)胞的分化、成熟及歸巢過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[31]。目前，以CXCL10/CXCR3為靶標(biāo)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和定位用于RA治療的研究也取得一定進(jìn)展[32]。本研究證實(shí)O3關(guān)節(jié)腔注射可以減輕CIA大鼠的滑膜增生，抑制滑膜中CXCL10和CXCR3的mRNA表達(dá)水平。且與MTX治療組相比，O3治療組滑膜組織中CXCR3的mRNA表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，我們推測(cè)O3治療可重建CIA模型大鼠滑膜微環(huán)境CXCL10/CXCR3介導(dǎo)的免疫平衡，這可能成為O3緩解RA滑膜炎癥和骨破壞的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。除此之外，本研究還使用RT-PCR檢測(cè)CXCL10和CXCR3在淋巴結(jié)和脾臟中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，CIA組淋巴結(jié)和脾臟中CXCL10和CXCR3 mRNA表達(dá)水平也異常升高，表明RA外周淋巴器官中同樣存在CXCL10/CXCR3軸介導(dǎo)的免疫紊亂。本研究中O3治療未糾正外周淋巴器官趨化因子異常表達(dá)，我們猜測(cè)O3療效可能受給藥水平和方式的影響。

總的來(lái)說(shuō)，以上一系列證據(jù)為O3治療RA相關(guān)炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制提供了依據(jù)，使其有望成為RA的一種可選擇的補(bǔ)充治療方法。目前，關(guān)于O3關(guān)節(jié)腔注射治療RA的最佳濃度、給藥方式等尚不統(tǒng)一，且國(guó)內(nèi)外對(duì)其長(zhǎng)期治療效果的相關(guān)報(bào)道較少。因此，為進(jìn)一步推進(jìn)這種治療方法在RA中的應(yīng)用，有必要對(duì)O3治療RA進(jìn)行更全面、更詳細(xì)的臨床前研究，以便達(dá)到規(guī)范、安全、有效的治療效果。