豌豆離體再生體系建立及遺傳穩(wěn)定性研究

劉本家，楊曉明

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

作物研究所，甘肅 蘭州　730070)

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豌豆離體再生體系建立及遺傳穩(wěn)定性研究

劉本家1，楊曉明2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

作物研究所，甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 提高速豌豆誘傷組織和不定芽的誘導(dǎo)率，建立豌豆高效離體再生體系.【方法】 以半無葉型豌豆品種‘隴豌1號(hào)’和蔓生型豌豆品種‘S3008’的莖段為外植體，研究不同基因型、培養(yǎng)基激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、分化的影響.【結(jié)果】 ‘隴豌1號(hào)’莖段愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率較高，分別達(dá)到88.7%和76.7%，‘S3008’莖段最高愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率分別為86.7%和74.7%.誘導(dǎo)愈傷組織最適培養(yǎng)基是MS+2 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D；誘導(dǎo)不定芽形成的最適培養(yǎng)基為MS+2 mg/L TDZ+1 mg/L 6-BA，平均不定芽數(shù)為4.3；在不定芽誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基(1/2MS+20 g/L蔗糖+1.5 mg/L ABT)上，生根率為74.0%，移栽后再生植株成活率達(dá)86.0%.兩個(gè)豌豆品種都能得到再生植株且繁殖系數(shù)高.【結(jié)論】 本培養(yǎng)體系適宜豌豆離體再生.通過染色體分析，再生植株染色體數(shù)和供體親本材料一致，初步表明再生植株遺傳穩(wěn)定.

關(guān)鍵詞：豌豆；莖段；愈傷組織；離體再生；染色體鑒定

豌豆(Pisumsativum)屬于豆科、豌豆屬一年生或越年生草本植物[1]，是一種兼有糧食、飼料、蔬菜、肥料和醫(yī)藥等多種用途的農(nóng)作物.豌豆具有豐富而均衡的營(yíng)養(yǎng)，蛋白質(zhì)含量比小麥、玉米高2～3倍[2].近年，豌豆在畜牧業(yè)和可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中起著重要作用，種植面積和市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大，但由于病蟲害以及干旱、低溫等不利條件的影響，產(chǎn)量很不穩(wěn)定.利用常規(guī)育種方法進(jìn)行豌豆品種改良周期長(zhǎng)且效率低.轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有時(shí)間短見效快的特點(diǎn)，但轉(zhuǎn)基因技術(shù)必須以高效穩(wěn)定再生體系為基礎(chǔ)[3].豌豆的組培離體再生研究國內(nèi)外已有報(bào)道.Schroeder等[4]以豌豆未成熟種子的下胚軸為外植體進(jìn)行豌豆的轉(zhuǎn)化和再生.Bean等[5]以干種子為起始材料，利用未成熟的幼胚直接獲得轉(zhuǎn)基因的芽，沒有通過中間的愈傷組織階段.蘇承剛等[6]發(fā)現(xiàn)，在激素對(duì)豌豆莖和真葉誘導(dǎo)愈傷組織及芽分化研究中，不同濃度的BA，KT與NAA組合中均未成功誘導(dǎo)豌豆莖和真葉愈傷組織分化出不定芽.已有的相關(guān)研究結(jié)果普遍存在重復(fù)性差、培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格、再生頻率低等問題，一定程度上制約了依靠基因工程方法對(duì)豌豆進(jìn)行種質(zhì)改良.為了提高愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)率，建立高效豌豆離體再生體系，本試驗(yàn)選取豌豆幼苗的莖段為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)及植株的再生研究，以期為豌豆的離體快繁和遺傳轉(zhuǎn)化等工作奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用半無葉型豌豆品種‘隴豌一號(hào)’和蔓生型豌豆品種‘S3008’為材料.兩品種均由甘肅省農(nóng)科院作物所提供.

1.2方法

1.2.1無菌苗的準(zhǔn)備將豌豆種子用水浸泡6～8 h，在流動(dòng)的水中沖洗30 min，用無菌水沖洗1次，然后于超凈工作臺(tái)上用75%酒精消毒30 s，再用1%的“84”消毒液浸泡10 min，最后轉(zhuǎn)入0.1%的升汞溶液消毒8～10 min，無菌水沖洗4～6遍.將消毒好的豌豆種子接種于不含任何生長(zhǎng)激素的MS培養(yǎng)基上.7～10 d后得到無菌苗.

1.2.2外植體誘導(dǎo)愈傷組織切取無菌苗的莖段約1 cm為外植體.外植體分別接種至含不同質(zhì)量濃度 2,4-D(0、0.2、0.5 mg/L)和TDZ(0.5、1.0、2.0 mg/L)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(表1).25 d后開始計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率，得出最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基.

1.2.3不定芽的誘導(dǎo)將第一步中得到的愈傷組織切成約0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種到不同激素配比的MS分化培養(yǎng)基上(表 2).20 d后觀察記錄不定芽分化結(jié)果.

1.2.4帶芽愈傷組織的繼代培養(yǎng)將含有芽的愈傷組織切成小塊，接種到MB5(含有MS培養(yǎng)基的鹽和B5培養(yǎng)基的維生素和煙酸)培養(yǎng)基上，GA3、6-BA和IAA配比見表3.25 d后統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基中不定芽的生長(zhǎng)情況.

1.2.5生根和馴化移栽將培養(yǎng)到2～3 cm的不定芽剪下，把切口插入到以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加20%的蔗糖及不同濃度的ABT或NAA培養(yǎng)基上(表4)，進(jìn)行不定芽生根培養(yǎng).統(tǒng)計(jì)生根率.當(dāng)試管苗的根伸長(zhǎng)約3 cm時(shí)，進(jìn)行馴化，移栽至溫室.

以上各項(xiàng)試驗(yàn)處理都為3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含有外植體50個(gè).基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基.培養(yǎng)基中附加3%蔗糖和0.45%瓊脂， pH調(diào)至5.8～6.0,常規(guī)高壓滅菌，培養(yǎng)溫度(22±2)℃，光周期為12 h光/12 h暗，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx.

1.2.6根尖染色體觀察以兩個(gè)豌豆品種的再生植株和親本材料根尖為試驗(yàn)材料.采用低溫預(yù)處理的方法[7]，在4 ℃條件下處理24 h.預(yù)處理后的根尖于卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中固定20～24 h，固定后的根尖用蒸餾水反復(fù)沖洗后，放入1 mol/L的鹽酸中，在60 ℃下解離10 min，經(jīng)解離的根尖用蒸餾水反復(fù)沖洗， 再用改良的石炭酸品紅染液染色10 min后壓片，用普通光學(xué)顯微鏡鏡檢.

2結(jié)果與分析

2.1不同激素組合對(duì)豌豆愈傷組織形成的影響

由表1看出，不同激素配比的培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出愈傷組織，隨著2,4-D濃度的增加，莖段愈傷組織誘導(dǎo)率呈上升趨勢(shì).其中，外植體莖段在MS+TDZ2 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L中培養(yǎng)5～7 d后，

兩端膨大，25 d后‘隴豌一號(hào)’和‘S3008’莖段外植體的出愈率分別達(dá)到88.7%和86.7%.在MS+TDZ 2 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L組合中平均愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到90%以上.但形成愈傷組織的質(zhì)地不一樣，前者愈傷組織質(zhì)地較后者緊實(shí)，大多為淺綠色或者綠色，可進(jìn)行芽分化，而后者愈傷組織過于膨大和松散，呈淡黃色，表面有白色顆粒，不利于分化芽.

表1　不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

同一列中小寫字母不同者差異顯著(P<0.05).下同.

2.2不同激素養(yǎng)組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

愈傷組織在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后，愈傷組織開始分化形成不定芽，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的分化情況(表2).在添加2 mg/L TDZ和1 mg/L 6-BA的分化培養(yǎng)基處理中，平均誘導(dǎo)率為75.7%，高于其他激素配比處理，且長(zhǎng)勢(shì)良好.但是在單一添加6-BA的培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)率較低.當(dāng) 6-BA濃度固定時(shí)，TDZ濃度在1～4 mg/L范圍內(nèi)，分化形成不定芽的數(shù)量隨濃度的增加而增加.當(dāng)TDZ濃度為4 mg/L時(shí)，每塊愈傷組織平均含有7.9個(gè)芽，但芽變得越來越纖細(xì)，葉子也很小.這說明高濃度的TDZ對(duì)不定芽的增值有利，但大量的不定芽之間會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，抑制不定芽的生長(zhǎng)，不利于后期完整植株的構(gòu)建.

表2　不同激素組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

2.3不同激素對(duì)不定芽繼代培養(yǎng)的影響

不定芽在繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后，19.3%～69.3%的外植體存活，當(dāng)同時(shí)使用6-BA和IAA這兩種激素時(shí)得到了較高的存活率，6-BA的加入有利于增加不定芽的數(shù)量.GA3的添加與否得到了兩種形態(tài)的不定芽.添加GA3時(shí)得到細(xì)長(zhǎng)且顏色較淺的不定芽(圖1-A)；缺少GA3時(shí)得到了短粗且顏色較深的不定芽(圖1-B).在添加1 mg/L 6-BA和IAA繼代培養(yǎng)基處理中，兩個(gè)豌豆品種的外植體存活和外植體芽數(shù)高于其他激素配比處理，且生長(zhǎng)狀況良好.因此 MB5+1 mg/L 6-BA+1 mg/L IAA是不定芽的繼代培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基.

A：添加GA3；B：不添加GA3圖1　不同激素組合對(duì)不定芽繼代培養(yǎng)的影響Fig.1　Effects of different plant growth regulator combinations on the subculture of adventitious bud

植物激素/(mg·L-1)GA36-BAIAA外植體存活率/%隴豌1號(hào)S3008細(xì)長(zhǎng)的芽/%隴豌1號(hào)S3008短粗的芽/%隴豌1號(hào)S3008外植體芽數(shù)隴豌1號(hào)S300810028.7e24.0d100100003.6bc2.5e01024.7e19.3d001001004.0abc3.9c00152.7cd48.7c001001002.5c2.8de11048.0d46.0c100100005.6a5.1b10157.3bc54.7bc100100003.7bc3.5cd01166.0a64.7ab1001001001005.2ab6.1a11161.3ab69.3a100100005.2ab5.7ab

2.4生根和馴化移栽

將長(zhǎng)度為2～3 cm的不定芽接種到生根培養(yǎng)基中，接種培養(yǎng)20 d后觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表4.以豌豆莖段為外植體獲得的再生植株見圖2.在附加不同濃度ABT的培養(yǎng)基上生根效果較好.最適生根培養(yǎng)基為蔗糖質(zhì)量濃度20 g/L的1/2MS+ABT 1.5 mg/L，不定芽的生根率達(dá)到74%以上，平均每個(gè)不定芽生根4.2條，且試管苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛.而在附加有不同濃度的NAA培養(yǎng)基中，不定芽基部易形成膨大的愈傷組織，但生根效果較差.當(dāng)試管苗的根伸長(zhǎng)約4 cm時(shí)，打開瓶塞馴化3 d后，取出試管苗用自來水將根部培養(yǎng)基沖洗干凈.轉(zhuǎn)移到滅菌的培養(yǎng)土中，一周后成活率達(dá)到86%以上.

表4　培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽生根的影響

a：通過種子獲得的豌豆幼苗；b：莖段外植體在培養(yǎng)3周后誘導(dǎo)的愈傷組織；c：愈傷組織在MS+TDZ 2 mg/L+6-BA 1 mg/L培養(yǎng)2周分化的不定芽；d：不定芽繼代培養(yǎng)；e：再生芽在1/2MS+20 g/L蔗糖+1.5 mg/L ABT培養(yǎng)25 d后的生根情況；f：再生植株的馴化移栽.圖2　豌豆莖段組織培養(yǎng)及植株再生Fig.2　Tissue culture and plant regeneration from stems of peas

2.5根尖染色體觀察

從圖3看出，兩個(gè)豌豆品種的再生植株和供體親本植株根尖染色體數(shù)目相同(2n=2x=14)，再生植株倍性穩(wěn)定和供體親本材料的染色體數(shù)一致.

3討論

3.1外植體的選擇

研究表明，對(duì)于同一組織和器官來說，幼年時(shí)期比成年期更容易培養(yǎng)和再生植株[8].本研究選取培養(yǎng)7～10 d無菌苗的莖段為外植體，篩選出豌豆離體再生的最佳激素配比組合，通過5個(gè)步驟獲得了再生植株(圖2).前人對(duì)豌豆莖段外植體已有研究.張晨等[9]以山野豌豆的嫩莖為材料，對(duì)再生苗的影響因素進(jìn)行研究，通過器官發(fā)生途徑獲得了再生苗.Tzitzikas等[10]以豌豆莖段為外植體，只添加細(xì)胞分裂素直接誘導(dǎo)出帶芽組織.但前人研究中并未提及不定芽在莖段上的分化位點(diǎn).本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化過程中，不定芽的分化位點(diǎn)多集中在莖段的節(jié)和分蘗部位.因此，應(yīng)盡量切取帶節(jié)或帶分蘗部位莖段進(jìn)行培養(yǎng)，成功率較高.

A：隴豌1號(hào)再生植株；B：供體親本材料；C：S3008再生植株；D：供體親本材料圖3　供體親本和再生植料染色體Fig.3　Chromosomes of the donor plants and the regenerated plants

3.2植物激素對(duì)植株再生能力的影響

在豌豆組織培養(yǎng)中，激素種類和濃度是最重要的影響因素，不同濃度的激素配比，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和分化有明顯差異.調(diào)節(jié)植物再生并不是單一種或某幾種激素的作用，而是內(nèi)源激素和外源激素共同作用的結(jié)果，它們共同控制著各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝而影響植物的再生[11].前人研究表明，2,4-D預(yù)培養(yǎng)可以顯著提高不定芽形成率[12].本試驗(yàn)中2,4-D的濃度是誘導(dǎo)胚性愈傷的關(guān)鍵.在只附加TDZ的情況下，外植體不能增殖或增殖緩慢，顏色逐漸變淺發(fā)黃.較低濃度的2,4-D能顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率，若2,4-D濃度過高，愈傷組織生長(zhǎng)旺盛呈水漬狀，后期愈傷組織底部褐化，表面出現(xiàn)大量白色顆粒狀突起，不利于不定芽的分化.說明過低或過高濃度的2,4-D均不利于愈傷組織誘導(dǎo).

在不定芽的誘導(dǎo)過程中，發(fā)現(xiàn)在激素濃度相同的情況下，無論不定芽再生率，還是平均再生不定芽數(shù)，TDZ均優(yōu)于6-BA.馬光等[13]同樣發(fā)現(xiàn)TDZ比6-BA更適于誘導(dǎo)蕪菁不定芽的再生，而且TDZ比6-BA能夠誘導(dǎo)蕪菁產(chǎn)生不定芽的濃度范圍大.同時(shí)添加兩種激素比單一使用一種激素效果好，說明TDZ和6-BA組合對(duì)豌豆不定芽的誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用.這與Khalafalla等[14]報(bào)道的在MS+2 mg/L TDZ+2 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上，蠶豆平均再生不定芽數(shù)最大的結(jié)果基本一致.

3.3外植體褐化及抑制

在愈傷組織繼代和不定芽分化培養(yǎng)過程中，容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象.有資料表明[15]，在外植體接種前進(jìn)行低溫處理，或剛開始在弱光下培養(yǎng),褐化現(xiàn)象可被明顯抑制，在培養(yǎng)基中加入PVP、活性碳一類的吸附劑可以吸附醌類物質(zhì)，減輕對(duì)外植體的毒害作用，此外，VC、檸檬酸等抗氧化劑對(duì)褐化也有抑制作用.

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(責(zé)任編輯胡文忠)

Regeneration and genetic stability of peas (PisumsativumL.)invitro

LIU Ben-jia1,YANG Xiao-ming2

(1.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Institute of Crop Research,Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 To increase the rate of callus inductive and adventitious bud induction,and to set up new regeneration system.【Method】 The stems of semi-leafless peas cultivars ‘Longwan NO.1’ and vining peas cultivar ‘S3008’ were used as explants,the effect of different genotypes,hormone types and the ratio of medium were studied on callus induction,callus differentiation and rooting.【Result】 The higher frequency of callus initiation and differentiation from stems of ‘Longwan NO.1’ was 88.7% and 76.7%.The frequency of callus initiation and differentiation from stems of ‘S3008’ was 86.7% and 74.7%.The optimal medium for callus induction was MS+2 mg/LTDZ+0.2 mg/L 2,4-D.The appropriate medium for adventitious bud induction was MS+2 mg/L TDZ+1 mg/L 6-BA,the adventitious bud number per explants was 4.3.The adventitious bud on rooting induction medium were 1/2MS+20 g/L sucrose+1.5 mg/L ABT,the rooting rates was 74% and the survival rates of regenerated plants were 86%.【Conclusion】 The two cultivars tested are all able to produce regeneration plant and propagate coefficient is high,shows that this new regeneration system could be applicable to regeneration of peas in vitro.By chromosome analysis,chromosome number of the regenerated plants are same to the donor plants,which is suggested that the regenerated plants are genetic stable.

Key words：peas;stems;callus;in vitro regeneration;chromosome identification

通信作者：楊曉明，男，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事作物遺傳育種、病蟲害防控和分子生物學(xué)的研究.E-mail:yangxm04@hotmail.com

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-09-G8);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460382).

收稿日期：2015-03-10；修回日期：2015-03-31

中圖分類號(hào)：S 643.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2016)01-0040-05

第一作者：劉本家(1987-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参飳W(xué).E-mail:liu.benjia@163.com