黃精多糖聯(lián)合低劑量順鉑對小鼠H22肝癌移植瘤生長的抑制及其抗氧化損傷作用

李超彥　周媛媛　王福青

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南　漯河　462002)

?

黃精多糖聯(lián)合低劑量順鉑對小鼠H22肝癌移植瘤生長的抑制及其抗氧化損傷作用

李超彥周媛媛王福青

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南漯河462002)

〔摘要〕目的觀察黃精多糖(PSP)聯(lián)合低劑量順鉑對小鼠H22肝癌移植瘤生長的影響及其抗氧化損傷作用，并探討其機(jī)制。方法72只小鼠右腋皮下注射H22肝癌細(xì)胞建立荷瘤模型，隨機(jī)分為對照組、PSP小劑量組(10 g/kg)、PSP大劑量組(30 g/kg)、順鉑組(2.5 mg/kg)、PSP小劑量+順鉑組、PSP大劑量+順鉑組；末次給藥24 h后處死小鼠，通過稱重移植瘤的質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率；通過稱重肝臟的質(zhì)量，計(jì)算肝臟系數(shù)；測定肝組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的含量；同時(shí)觀察肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果與對照組比較，順鉑組及PSP+順鉑組均顯著降低移植瘤重(P<0.05或P<0.01)，且隨著PSP劑量增大及與順鉑合用抑瘤率逐漸提高；與對照組比較，順鉑干預(yù)后肝臟質(zhì)量及肝組織勻漿中SOD水平明顯降低(P<0.01)，而MDA含量明顯升高(P<0.01)；與順鉑組比較，PSP聯(lián)合順鉑干預(yù)后肝臟質(zhì)量及肝組織勻漿中SOD水平逐漸升高(P<0.05或P<0.01)，且MDA含量降低(P<0.01)。結(jié)論黃精多糖與順鉑聯(lián)合使用可明顯抑制H22肝癌移植瘤的生長，并能減輕順鉑引發(fā)的肝臟氧化損傷。

〔關(guān)鍵詞〕黃精多糖；順鉑；肝癌；氧化損傷；超氧化物歧化酶(SOD)；丙二醛(MDA)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率極高，故化療在肝癌的綜合治療中仍占重要地位〔1〕。順鉑是臨床上常用的周期非特異性重金屬類抗癌藥，對肝癌等各類實(shí)體瘤均具有較強(qiáng)的抑制和殺傷作用，但其嚴(yán)重的細(xì)胞毒作用引發(fā)的臟器功能氧化損傷限制了其廣泛應(yīng)用〔2,3〕。目前，臨床上通常在使用化療藥物的同時(shí)配合抗氧化中藥，不僅能起到增效增敏作用，還能減輕化療藥物的毒副反應(yīng)。黃精多糖(PSP)是黃精水提物的主要有效成分和生物學(xué)活性成分之一，研究表明其具有增強(qiáng)免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化作用〔4,5〕等多種藥理作用。本文以H22荷瘤小鼠為動物模型，觀察PSP聯(lián)合低劑量順鉑對小鼠H22移植瘤生長的影響及PSP對順鉑所致肝癌小鼠肝臟氧化損傷的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物清潔級昆明小鼠，72只，雄性，6~8周齡，體重18~22 g，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證號醫(yī)動字第20110118號)。

1.2細(xì)胞株H22肝癌細(xì)胞由本校分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，小鼠腹水傳代。

1.3藥品與試劑PSP，濃度50%，由陜西楊凌東科麥迪森制藥有限公司提供。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(批號20110307)。順鉑凍干粉(批號11010161，20 mg)，齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，臨用前0.9%氯化鈉溶液配制。

1.4儀器721-分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)，超低溫冰箱(美國ThermoForma702)，AU2700全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司)，MSE-25型高速冷凍離心機(jī)(上?？茖W(xué)儀器廠)，Leica DMIL倒置顯微鏡(德國萊卡儀器有限公司)。

1.5方法

1.5.1動物模型建立昆明小鼠腹腔接種H22細(xì)胞，培養(yǎng)1 w后抽取腹水，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)并用無菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度至5×109個(gè)/L，每只小鼠右腋皮下注射0.2 ml H22肝癌細(xì)胞，制成實(shí)體型荷瘤鼠模型。

1.5.2分組及給藥將72只造模成功荷瘤小鼠隨機(jī)分為6組，每組12只。對照組(灌胃生理鹽水0.3 ml)；PSP小劑量組(灌胃10 g/kg)；PSP大劑量組(灌胃30 g/kg)；順鉑組(腹腔注射2.5 mg/kg)；PSP小劑量+順鉑組(灌胃PSP 10 g/kg，同時(shí)給予順鉑腹腔注射2.5 mg/kg)；PSP大劑量+順鉑組(灌胃PSP 30 g/kg，同時(shí)給予順鉑腹腔注射2.5 mg/kg)。以上給藥均為1次/d，連續(xù)10 d。

1.5.3一般狀況觀察小鼠接種腫瘤及給藥期間，每天觀察小鼠皮毛、食欲、活動狀況，對刺激的反應(yīng)及體重變化情況，評價(jià)化療毒副反應(yīng)及生存質(zhì)量。

1.5.4瘤重及抑瘤率測定末次給藥24 h后，頸椎脫臼法處死小鼠并稱重，完整剝?nèi)∫浦擦?，用濾紙擦拭干凈后電子天平稱重，并依公式計(jì)算抑瘤率。

1.5.5肝臟指數(shù)測定各組小鼠處死后剪取肝臟并稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)：肝臟質(zhì)量(g)/體重(g)×100%。

1.5.6肝組織勻漿生化測定計(jì)算肝臟系數(shù)后剪取0.1 g肝組織，剪碎后加冰生理鹽水研磨成10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液置4℃冰箱備測SOD、MDA，SOD、MDA的測定均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.7組織病理學(xué)觀察取小鼠肝臟組織，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，厚度5 μm，行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡觀察肝臟組織學(xué)形態(tài)變化。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1荷瘤小鼠一般狀況觀察實(shí)驗(yàn)過程中，通過觀察小鼠精神狀態(tài)、活動狀況、對刺激的反應(yīng)、食欲及消瘦幅度、被毛脫落等指標(biāo)，評價(jià)小鼠的生存質(zhì)量。結(jié)果表明：對照組及PSP各組小鼠生存質(zhì)量較好，未見明顯的不良反應(yīng)；順鉑組小鼠生存質(zhì)量較差，不良反應(yīng)明顯，出現(xiàn)厭食、腹瀉、精神萎靡、消瘦及脫毛等癥狀；PSP+順鉑聯(lián)合用藥組好于單獨(dú)順鉑組，不良反應(yīng)相對較少。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，除PSP大劑量組以外的各組小鼠均有死亡，表現(xiàn)為體重明顯下降，排除感染或飼養(yǎng)不當(dāng)?shù)囊蛩赝?，推測小鼠死亡原因?yàn)樽陨眢w質(zhì)過差引起，但各組小鼠死亡率差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2移植瘤重及抑瘤率接種后1 w內(nèi)小鼠外觀變化不明顯，1 w后各組均可觸及右腋下瘤塊，對照組小鼠移植瘤生長迅速、局部腫脹壓迫明顯；各藥物治療組小鼠移植瘤生長較對照組緩慢，各組移植瘤重均低于對照組(P<0.05或P<0.01)。各劑量聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組兩兩比較，移植瘤重差異顯著(P<0.01)。見表1。

2.3肝臟質(zhì)量、肝臟系數(shù)及肝組織勻漿生化指標(biāo)的變化與對照組比較，順鉑組及PSP各劑量與順鉑聯(lián)合組肝臟質(zhì)量明顯下降(P<0.05或P<0.01)，肝臟系數(shù)減??；肝臟組織勻漿中SOD明顯下降(P<0.05或P<0.01)，MDA含量明顯升高(P<0.05或P<0.01)；PSP大劑量組可升高肝臟組織勻漿中SOD水平(P<0.05)，降低MDA含量(P<0.05)。與順鉑組比較，PSP各劑量與順鉑聯(lián)合組肝臟質(zhì)量逐漸增大(P<0.05或P<0.01)，肝臟系數(shù)變大；肝臟組織勻漿中SOD明顯升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.01)。見表2。

2.4肝組織病理結(jié)構(gòu)變化肝臟HE染色切片顯示，對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)略疏松，間質(zhì)有少量炎癥細(xì)胞浸潤；與對照組比較，順鉑組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)明顯疏松，細(xì)胞排列不整齊，胞質(zhì)豐富且有空泡，部分細(xì)胞呈氣球樣變性，門管區(qū)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤及纖維組織增生；與順鉑組比較，PSP聯(lián)合順鉑組小鼠肝損傷有明顯改善，肝細(xì)胞氣球樣變及炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，可見正常肝索結(jié)構(gòu)及纖維化增生減輕。

表1　各組小鼠移植瘤重和抑瘤率比較±s)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與PSP小劑量組比較：3)P<0.01；與PSP大劑量組比較：4)P<0.01；與順鉑組比較：5)P<0.01

表2　各組小鼠的肝臟質(zhì)量、肝臟系數(shù)和肝組織SOD、MDA的變化

與對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與順鉑組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

3討論

據(jù)國際癌癥研究中心(IARC)報(bào)道，每年肝癌發(fā)病率和死亡數(shù)占全球肝癌病例的一半以上〔6〕。順鉑是一種廣譜鉑類抗癌劑廣泛應(yīng)用于臨床，同樣在肝癌的化療中占有重要的地位；其主要通過腫瘤細(xì)胞DNA鏈結(jié)合，形成交叉連接，抑制DNA、RNA的合成和細(xì)胞分裂，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分裂障礙而死亡，為周期非特異性腫瘤化療藥物〔2〕。順鉑的抗腫瘤效應(yīng)具有明顯的劑量依賴性，劑量越大，殺傷腫瘤效應(yīng)越強(qiáng)〔3〕；但順鉑大劑量應(yīng)用易引發(fā)嚴(yán)重的毒副反應(yīng)〔7〕，主要表現(xiàn)為對肝臟、腎臟等臟器功能的損害〔3,8〕。順鉑致肝臟毒副作用機(jī)制尚不明確，可能與其所致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)；表現(xiàn)為組織氧化代謝產(chǎn)物MDA水平升高、SOD水平降低，細(xì)胞內(nèi)代謝廢物堆積，引發(fā)肝細(xì)胞變性、灶性壞死、凋亡，導(dǎo)致急性肝功能障礙等一系列肝臟毒性反應(yīng)〔7〕。因此增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能、降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可能是減小順鉑所致肝臟毒性作用的研究方向之一。

PSP是黃精主要的生物學(xué)活性成分，增強(qiáng)免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化作用等多種藥理作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)PSP對實(shí)體移植具有明顯的抑制作用〔5〕，且對化學(xué)性肝功能損傷具有保護(hù)作用〔9〕。順鉑的抗腫瘤效應(yīng)雖有明顯的劑量依賴性，但采用低劑量(通常為最大耐受劑量的1/10~1/3)、長時(shí)間連續(xù)或高頻率給藥模式，也可產(chǎn)生顯著的抑瘤效果，且毒性反應(yīng)較小〔10,11〕；鑒于PSP和順鉑的上述特點(diǎn)，在腫瘤化療中聯(lián)合用藥理論上是可行。

本研究結(jié)果顯示：順鉑組低劑量高頻率順鉑化療雖然取得良好的抑瘤效果，明顯高于PSP各組及對照組，但在整個(gè)用藥期間小鼠一般狀況表現(xiàn)不佳，出現(xiàn)厭食、腹瀉、精神萎靡、消瘦及脫毛等癥狀，且對肝臟功能的損害表現(xiàn)也很突出，如肝臟質(zhì)量、肝臟系數(shù)、SOD水平的下降及MDA水平的增高。PSP各劑量單獨(dú)用藥時(shí)，對移植瘤的生長表現(xiàn)出一定的抑制效果，用藥期間小鼠的一般狀況表現(xiàn)良好，體重增加，且對肝功能損傷呈現(xiàn)出保護(hù)作用。PSP與順鉑聯(lián)合用藥小鼠對移植瘤的抑瘤效果最佳，瘤重明顯低于對照組及順鉑組，且隨著PSP劑量增大合用的抑瘤效果更佳，抑瘤率最高達(dá)86.27%；小鼠用藥期間的生存質(zhì)量良好，精神狀態(tài)、消瘦幅度及脫毛等癥狀尚可；小鼠肝功能的損傷程度遠(yuǎn)小于順鉑單獨(dú)使用，提示PSP的應(yīng)用可以減輕順鉑所致的肝功能損傷，表現(xiàn)為肝臟質(zhì)量、肝臟系數(shù)、SOD水平的回升及MDA水平的下降。

PSP與順鉑聯(lián)合用藥組的抑瘤率高于順鉑組，提示PSP與順鉑的聯(lián)合應(yīng)用對移植瘤的生長具有不同程度的協(xié)同抑制效果，增強(qiáng)了抑瘤能力。順鉑是通過抑制腫瘤細(xì)胞DNA、RNA的復(fù)制和堿基錯(cuò)配導(dǎo)致細(xì)胞分裂障礙而死亡，達(dá)到抑制腫瘤生長的作用〔2〕；PSP組成成分及結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其抗腫瘤機(jī)制目前尚不明確，推測與其增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、提高機(jī)體應(yīng)激及抗氧化能力等活性有關(guān)〔5〕；PSP與低劑量順鉑聯(lián)合應(yīng)用后的協(xié)同增效作用及對肝功能的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與順鉑引發(fā)腫瘤細(xì)胞DNA的損傷、PSP增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能及抗氧化能力有關(guān)，二者協(xié)同抑制了腫瘤細(xì)胞的分裂，并誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

4參考文獻(xiàn)

1Pitot HC. Adventures in hepatocarcinogenesis〔J〕. Ann Rev Pathol,2007;2:1-29.

2Gonzalez VM,Fuertes MA,Alonso C,etal. Is cisplatin-induced cell death always produced by apoptosis〔J〕?Mol Pharacol,2001;59(4):657-63.

3Stewart JD,Bolt HM. Cisplatin-induced nephrotoxicity〔J〕. Arch Toxicol,2012;86(8):1155.

4張庭廷,夏曉凱,陳傳平,等. 黃精多糖的生物活性研究〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2006;2(7):42.

5江華. 黃精多糖的抗腫瘤活性研究〔J〕.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010;26(6):479-80.

6芮靜安. 原發(fā)性肝癌的治療研究新進(jìn)展〔J〕.臨床肝膽病雜志,2006;22(4):244-6.

7劉秀均,劉婷. 苦參堿聯(lián)合順鉑抗肝癌的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2007;13(6):37.

8羅景慧,楊迎暴. N-乙酰半胱氨酸對順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷后腎臟組織氧化應(yīng)激水平的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012;18(19):170.

9雷震,楊光義,葉方,等. 黃精多糖藥理作用及臨床應(yīng)用研究概述〔J〕.中國藥師,2012;15(1):114-6.

10侯繼院,沈方臻,王延濤,等. 順鉑低劑量節(jié)律化療抑制小鼠H22肝癌血管生成觀察〔J〕.齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2008;23(2):95-8.

11Emmenegger U,Man S,Shaked Y,etal.A comparative analysis of low-dose metronomic cyclophosphamide reveals absent or low grade toxicity on tissues highly sensitive to the toxic effects of maximum tolerated dose regimens〔J〕. Cancer Res,2004; 64(11):3994-4000.

〔2014-11-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1038-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.006

基金項(xiàng)目：河南省教育廳自然科學(xué)研究資助項(xiàng)目(2009C310008)

第一作者：李超彥(1981-)，男，講師，碩士，主要從事生理學(xué)研究。