六味地黃丸含藥血清對Eahy926細胞ERK/Nrf2-HO-1信號通路的影響

呂小輝，孫佳瑜，蔡智剛，張瑞鵬，單愛云

(1.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東 廣東 518033； 2.深圳清華大學 研究院，廣東 廣州 518067)

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六味地黃丸含藥血清對Eahy926細胞ERK/Nrf2-HO-1信號通路的影響

呂小輝1，孫佳瑜1，蔡智剛1，張瑞鵬2，單愛云1

(1.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東 廣東 518033； 2.深圳清華大學 研究院，廣東 廣州 518067)

目的 觀察六味地黃丸含藥血清對人血管內(nèi)皮細胞Eahy926增殖及其ERK/Nrf2-HO-1信號通路的影響。方法 CCK-8檢測大鼠5%、10%、20%空白血清與5%、10%、20%含藥血清對Eahy926細胞增殖的影響，并用Western-blotting方法檢測10%含藥血清對Eahy926細胞ERK/Nrf2-HO-1信號通路分子蛋白表達的影響。結果 六味地黃丸含藥血清可以促進Eahy926細胞的增殖；在Eahy926細胞中，10%六味地黃丸含藥血清能夠促進ERK的磷酸化、Nrf2核轉(zhuǎn)位和HO-1蛋白的表達，明顯高于無大鼠血清組和10%空白血清組。結論 10%六味地黃丸含藥血清誘導ERK磷酸化介導Nrf2入核和HO-1蛋白的表達。

六味地黃丸； 血管內(nèi)皮細胞； ERK/Nrf2-HO-1； 蛋白表達

血紅素加氧酶(HO)是哺乳動物內(nèi)源性保護酶，是體內(nèi)血紅素代謝的起始酶和限速酶，主要將血紅素代謝成膽綠素、一氧化碳和游離的鐵離子。HO在體內(nèi)有HO-1、HO-1、HO-3 3種同工酶，其中HO-1為可誘導型HO，參與體內(nèi)眾多抗氧化事件。血紅素加氧酶-1(HO-1)表達需要其核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2激活后入核與相應的啟動子結合，Nrf2的激活與ERK的磷酸化有著密切關系，磷酸化的ERK可以促進Nrf2激活，與封閉蛋白解離入核，進而促進HO-1蛋白的表達。以往研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸含藥血清[1]和激活ERK/Nrf2-HO-1信號通路[2]都具有血管內(nèi)皮保護作用，推測六味地黃丸含藥血清可能具有激活ERK/Nrf2-HO-1信號通路的作用。本研究主要觀察六味地黃丸含藥血清在血管內(nèi)皮細胞上對ERK/Nrf2信號通路是否有調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量180～220 g，廣州醫(yī)學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002。

1.1.2 藥物 六味地黃丸購于北京同仁堂，批號20150415，取六味地黃丸100丸(每8丸相當于生藥材量3 g)，機械粉碎成粗粉，加入50 mL蒸餾水混勻，濃縮至1.56 kg/L的藥液。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)；胎牛血清(PAN)；0.25%胰酶(Hyclone)；BCA蛋白定量試劑盒和CCK-8試劑盒(碧云天科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(Solarbio)；ERK和p-ERK一抗(SatanCruz)；Nrf2和HO-1一抗(abcam)；β-actin和所有的二抗(中杉金橋)；U0126(CST)。

1.1.4 主要儀器 Forma-371型CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；5418R型低溫冷凍離心機(Effendorf)；EN12469型超凈工作臺(ESCO)； A2LED型倒置顯微鏡(Zeiss)；elx-808型全自動酶標儀(Biotek)。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 將SD大鼠隨機分為空白組和六味地黃丸給藥組，每組各10只，通過預實驗確定給藥組生藥濃度為1.56 kg/L六味地黃丸混懸液，10 mL/kg灌胃，每天1次，空白組給予同體積生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥3 d，第4天給藥后2 h心臟取血，4 ℃冰箱過夜，5 000 r/min離心5 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活補體，超濾滅菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Eahy926細胞培養(yǎng) 人血管內(nèi)皮細胞株Eahy926，在含10%(φ)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%(φ)CO2、37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)。

1.2.3 含藥血清對Eahy926細胞增殖的影響 細胞生長融合度80%以上，消化細胞成單細胞懸液，以5×107cells/mL單細胞懸液100 μL接種于96孔板中，當細胞生長融合度達80%時，使用基礎培養(yǎng)基同步化24 h，將細胞分為無大鼠血清組、正常大鼠血清(NS)組(5%、10%、20%)和給藥大鼠血清(MS)組(5%、10%、20%)每組設6個復孔，培養(yǎng)48 h后，加入CCK-8試劑37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h后，用酶標儀在490 nm波長下檢測每孔細胞吸光度值(A值)。

1.2.4 細胞蛋白提取和Western blotting檢測[3]用預冷的PBS清洗培養(yǎng)皿3次，用預冷的RIPA蛋白裂解液刮取細胞，冰上裂解15 min后，14 000 r/min離心15 min，取上清。從上清中取少量按照BCA蛋白定量試劑盒定量后，用上樣緩沖液將所有樣品調(diào)制相同濃度，混勻100 ℃變性5 min，分裝凍存。蛋白上樣20 μL，垂直電泳跑膠，積層膠電壓為80 V，分離膠電壓為110 V，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜至NC膜上，脫脂奶粉封閉，一抗過夜，洗膜后二抗孵育，加顯影液凝膠成像曝光。

1.2.5 含藥血清對HO-1表達的作用 將細胞鋪于直徑60 mm的平皿中，分為無大鼠血清組、正常大鼠血清組[U1]和給藥大鼠血清組，正常大鼠血清組和給藥大鼠血清組分別用10%的正常大鼠血清和10%給藥大鼠血清孵育細胞48 h，提取細胞蛋白，用Western blot檢測HO-1蛋白的表達。

1.2.6 含藥血清對Nrf2轉(zhuǎn)位的作用 將細胞鋪于直徑60 mm的平皿中，分為無大鼠血清組、正常大鼠血清組和給藥大鼠血清組，正常大鼠血清組和給藥大鼠血清組分別用10%的正常大鼠血清和10%含藥大鼠血清孵育細胞48 h，提取細胞核蛋白，用Western blot檢測Nrf2蛋白的表達。

2 結果

2.1 CCK-8檢測不同濃度的含藥血清對Eahy926細胞增殖的影響

表1結果提示，與無大鼠血清組比較，3個濃度給藥大鼠血清組和10%、20%的正常大鼠血清組吸光度值明顯增高(P<0.05)；這說明給藥大鼠血清和10%、20%的正常大鼠血清能夠促進細胞的增殖；10%、20%的無大鼠血清組與同濃度的給藥大鼠血清組比較吸光度值差異無統(tǒng)計學意義，5%給藥大鼠血清組與5%正常大鼠血清組吸光度值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 CCK-8法測定各組Eahy926細胞A值

組別正常大鼠血清給藥大鼠血清無大鼠血清組0.54±0.120.55±0.145%血清組0.56±0.140.79±0.13*#10%血清組0.71±0.15*0.81±0.15*20%血清組0.83±0.16*0.83±0.17*

與無大鼠血清組比較：*P<0.05；與5%正常大鼠血清組比較：#P<0.05。

2.2 含藥血清對HO-1表達的作用

實驗結果提示，給藥大鼠血清能夠誘導HO-1蛋白的表達，并具有劑量依賴性，與無大鼠血清組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；10%正常大鼠血清對HO-1的表達沒有作用，與無大鼠血清組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。

Con10%NS5%MS10%MS20%MSHO-1β-actin3.53.02.52.01.51.00.50HO-1/β-actin*****Con10%5%10%20%NSMS

與無大鼠血清組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖1 含藥血清在Eahy926細胞上對HO-1表達的影響

2.3 含藥血清對Nrf2轉(zhuǎn)位的作用

實驗結果提示，10%給藥大鼠血清能夠促進核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2核轉(zhuǎn)位，與無大鼠血清組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；10%正常大鼠血清對核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2核轉(zhuǎn)位沒有作用，與無大鼠血清組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

2.4 含藥血清誘導ERK磷酸化介導Nrf2核轉(zhuǎn)位和HO-1表達的作用

如圖3A所示，10%給藥大鼠血清能夠明顯誘導ERK的磷酸化，與無大鼠血清組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而10%正常大鼠血清不能誘導ERK的磷酸化，如圖3B，3C所示加入ERK磷酸化特異抑制劑U0126后，U0126阻斷了10%給藥大鼠血清誘導Nrf2的核轉(zhuǎn)位和HO-1的表達。以上結果提示，10%給藥大鼠血清誘導ERK的磷酸化介導Nrf2核轉(zhuǎn)位和HO-1表達。

**Con10%NS10%MSNrf2(Nucleus)β-actin3.53.02.52.01.51.00.50Nrf2/β-actinCon10%NS10%MS

與無大鼠血清組比較：**P<0.01。

圖2 含藥血清在Eahy926細胞上對Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響

3 討論

血管內(nèi)皮細胞是覆蓋在血管內(nèi)層的一層細胞，是循環(huán)血液與血管平滑肌的機械屏障，具有多種生理功能，參與機體的凝血、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和生物活性物質(zhì)釋放等生命活性，血管內(nèi)皮損傷是心血管疾病的病理基礎，保護血管內(nèi)皮細胞損傷，對減少心血管疾病意義重大。以往研究表明，HO-1對血管內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用，能夠促進血管內(nèi)皮細胞的增殖[4 ]，減少血管內(nèi)皮細胞的凋亡[5]，對抗內(nèi)皮細胞氧化應激[6]，修復內(nèi)皮損傷[7]。HO-1表達與其轉(zhuǎn)錄因子Nrf2入核密切相關，對HO-1的表達發(fā)揮重要的作用，基礎狀態(tài)下Nrf2與Keap-1偶聯(lián)在一起，以非活化的形態(tài)存在于細胞之中，在啟動因素刺激下，Nrf2被激活與Keap-1解偶聯(lián)，進入細胞核與ARE相互作用，啟動HO-1基因轉(zhuǎn)錄，促進HO-1的表達。以往的研究顯示，ERK信號通路的激活與Nrf2的活化入核有著密切的關系[8]，一些自然產(chǎn)物能夠活化ERK促使Nrf2磷酸化入核，與核內(nèi)相應啟動子結合，增加HO-1的表達[9-10]。

**10%MS10%NSConp-ERKERK2.01.51.00.50P-ERK/ERKCon10%NS10%MS+-+-++--0.70.60.50.40.30.20.10HO-1/β-actinMS(10%)U0126HO-1β-actin**##Con10%MS10%MS+U0126U0126AC**##MS(10%)U0126Nrf2β-actin+-+-++--1.41.21.00.80.60.40.20Nrf2/β-actinCon10%MS10%MS+U0126U0126B

A. 10%給藥大鼠血清對ERK磷酸化的作用(與無大鼠血清組比較：**P<0.01)； B. ERK磷酸化抑制劑U0126阻斷10%給藥大鼠血清促進Nrf2表達的作用(與無大鼠血清組比較：**P<0.01; 與U0126組比較:##P<0.01); C. ERK磷酸化抑制劑U0126阻斷10%給藥大鼠血清促進HO-1表達的作用(與無大鼠血清組比較：**P<0.01; 與10%給藥大鼠血清組比較：##P<0.01)。

圖3 含藥血清在Eahy926細胞上誘導ERK磷酸化介導Nrf2入核和HO-1蛋白

六味地黃丸組方源于宋代醫(yī)學家錢乙的《小兒藥證直決》是滋補腎陰的基礎方劑配伍組方上具有“三補三瀉”的特點，主要由熟地、澤瀉、山萸肉、丹皮、山藥、茯苓六味中藥組成，具有滋陰益腎的作用，現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸具有抗癌、增加細胞免疫性、調(diào)節(jié)血壓血脂[11]、降低血糖、血脂、抗氧化等作用[12]，而六味地黃丸含藥血清對HO-1表達及上游ERK/Nrf2信號通路的研究報道很少。本實驗研究發(fā)現(xiàn)5%六味地黃丸的給藥血清能夠?qū)ρ軆?nèi)皮細胞Eahy926增殖有促進作用，與對照組和空白血清組比較差異有統(tǒng)計學意義，同時發(fā)現(xiàn)10%六味地黃丸含藥血清能夠促進ERK的磷酸化，并且使用ERK磷酸化的特異抑制劑U0126能夠阻斷ERK的磷酸化，同時也阻斷10%六味地黃丸含藥血清對HO-1的誘導表達和轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的入核，結果提示，10%六味地黃丸含藥血清誘導ERK磷酸化介導Nrf2入核和HO-1蛋白的表達。本文只是初步探討了10%六味地黃丸含藥血清對ERK/Nrf2-HO-1信號通路的調(diào)節(jié)作用，六味地黃丸含藥血清是否通過ERK/Nrf2-HO-1信號通路對損傷血管內(nèi)皮發(fā)揮保護作用，還需要進一步研究。

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(責任編輯：幸建華)

Effect of drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the ERK/Nrf2-HO-1 signaling pathway in Eahy926 cells

LYU Xiaohui1,SUN Jiayu1,CAI Zhigang1,ZHANG Ruipeng2,SHAN Aiyun1

(1.ShenzhenFutianDistrictTraditionalChineseMedicineHospital,Guangdong518033,China; 2.KeyLabforNewDrugsResearchofTCM,ShenzhenResearchInstituteofTsinghuaUniversity,Shenzhen518067,China)

Objective To investigate the effect of drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the ERK/Nrf2-HO-1 pathway in Eahy926 cells. Methods The proliferation of Eahy926 cells was detected by CCK-8 method. Western blotting was used to determine the protein expression of the ERK/Nrf2-HO-1 pathway. Results The drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills promoted the proliferation of Eahy926 cells. The levels of ERK phosphorylation,Nrf2 nuclear translocation and HO-1 expression in Eahy926 cells treated with 10% drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills were significantly higher than that of the control and blank groups. Conclusion 10% drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills promotes Nrf2 nuclear translocation and expression of HO-1 via inducing ERK phosphorylation.

Liuwei Dihuang pills; vascular endothelial cells; ERK/Nrf2-HO-1 signaling; protein expression

2016-05-10

深圳市科技研發(fā)基金(JCYJ20140414145007216)

呂小輝，女，主管藥師，主要從事臨床藥學研究，Email:22181265@qq.com；通信作者：單愛云，女，主任藥師，主要從事藥事管理研究，Email:253010652@qq.com。

時間：2016-09-30 9:39

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.0939.001.html

R285.5

A

1006-8783(2016)05-0618-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016051001