應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)模擬預(yù)測(cè)黃芩改善胰島素抵抗的物質(zhì)基礎(chǔ)

潘思娜，王亞玲，韓智慧，吳純偉，王淑美，楊永霞

(廣東藥科大學(xué) 1. 基礎(chǔ)學(xué)院; 2.中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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醫(yī)學(xué)研究

應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)模擬預(yù)測(cè)黃芩改善胰島素抵抗的物質(zhì)基礎(chǔ)

潘思娜1,2，王亞玲1,2，韓智慧1,2，吳純偉2，王淑美2，楊永霞1

(廣東藥科大學(xué) 1. 基礎(chǔ)學(xué)院; 2.中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的 應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)模擬預(yù)測(cè)黃芩改善胰島素抵抗的活性物質(zhì)，揭示黃芩改善胰島素抵抗的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法 應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)黃芩所含43種化合物與胰島素抵抗有關(guān)的24個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接篩選，并采用Cytoscape軟件建立多成分-多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型。結(jié)果 黃芩中有14個(gè)化合物與12個(gè)以上的靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性。結(jié)論 通過分子對(duì)接技術(shù)模擬篩選出黃芩中改善胰島素抵抗的活性成分，為中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

黃芩； 分子對(duì)接； 胰島素抵抗； 物質(zhì)基礎(chǔ)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指機(jī)體對(duì)胰島素生理作用的反應(yīng)性降低，即胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取作用受損，其具體表現(xiàn)為外周組織如脂肪和肝臟組織對(duì)胰島素敏感性下降以及對(duì)葡萄糖的利用障礙[1]。IR是2型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)，也是代謝綜合征的核心機(jī)制[2]。WHO預(yù)計(jì)到2025年，全世界糖尿病患者將增加到3億，我國將達(dá)3 800萬人[3]；目前我國代謝綜合征發(fā)病率大于15%，患者人數(shù)已超過2億[4]。因此，尋找能減少IR產(chǎn)生及逆轉(zhuǎn)IR的藥物與方法已成為當(dāng)代醫(yī)藥學(xué)的迫切需要。黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，為唇形科植物黃芩的根[5]。黃芩單獨(dú)使用或復(fù)方對(duì)IR的改善具有較好療效。黃芩有降糖作用，也有治療糖尿病并發(fā)癥的作用[6]；黃芩提取物能提高胰島素的敏感性和活化AMPK，治療糖尿病，改善IR[7]；黃連解毒湯對(duì)IR大鼠肝線粒體損傷有明顯的保護(hù)作用[8]；葛根芩連湯可以調(diào)節(jié)糖代謝、提高機(jī)體的抗氧化能力、改善大鼠的IR[9]。因此，黃芩具有明確的改善IR的作用。但是，中藥成分復(fù)雜，黃芩改善IR作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚。

分子對(duì)接技術(shù)[10]是從已知結(jié)構(gòu)的受體(靶蛋白或活性位點(diǎn))和配體出發(fā)，通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法模擬分子的幾何結(jié)構(gòu)和分子間作用力來進(jìn)行分子間相互作用識(shí)別并預(yù)測(cè)受體配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的方法，也是比較成熟的直接藥物設(shè)計(jì)方法。本研究用分子對(duì)接技術(shù)，將黃芩中的化合物與IR的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，篩選黃芩中可能改善IR的活性成分。

1 材料與方法

1.1 材料

本文應(yīng)用的軟件為Sybyl-X7.3(美國Tripos公司)中的Surflex-Dock模塊和Cytoscape 3.0.0。軟件運(yùn)行環(huán)境：Microsoft Windows XP Professional操作系統(tǒng)。

1.2 黃芩化合物的收集及準(zhǔn)備

從化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫和《中藥原植物化學(xué)成分手冊(cè)》查找并從PubChem化合物數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載已報(bào)道的黃芩所含化學(xué)成分，共計(jì)43個(gè)。利用Sybyl-7.3軟件對(duì)每個(gè)分子進(jìn)行加氫處理，添加Gasteiger-Hückel電荷、加Tripos力場(chǎng)、以Powell能量梯度法完成能量最小化。

1.3 靶點(diǎn)的收集及準(zhǔn)備

根據(jù)IR的發(fā)病機(jī)制及藥物治療方法，查詢國內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道，選取與IR相關(guān)的重要靶點(diǎn)作為研究對(duì)象，分別有PI3K、AMPK、GLUT4等24個(gè)靶點(diǎn)，從RCSB的蛋白質(zhì)PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫下載得到24個(gè)靶點(diǎn)的三維晶體結(jié)構(gòu)并保存為PDB格式，見表1。利用Surflex-Dock軟件對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)處理。具體操作是提取配體，去除水分子及其他配體，為蛋白質(zhì)加氫，以AMBER7 FF99力場(chǎng)進(jìn)行能量優(yōu)化，選擇Automatic模式產(chǎn)生活性口袋，其余參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置。1.4 分子對(duì)接

將每個(gè)化合物分別與24個(gè)靶點(diǎn)按默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分子對(duì)接，得到Total Score、Crash、Polar等參數(shù)值為對(duì)接成功，本文以Total Score參數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)。Surflex-Dock打分函數(shù)是以-log10為單位模擬結(jié)合能力，Total Score值越大，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定[11]。打分大于5.0的說明分子與靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性，打分大于7.0則說明分子與靶點(diǎn)的結(jié)合構(gòu)型具有強(qiáng)烈的活性[12]。

表1 IR相關(guān)蛋白靶點(diǎn)

Table 1 Protein targets related with insulin resistance

名稱英文縮寫PDB編號(hào)磷脂酰肌醇-3激酶PI3K4L1B有絲分裂原激活蛋白激酶MAPK4EWQ葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4GLUT43PCU胰島素受體InsR2HR7過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ2XKW腫瘤壞死因子-αTNF-α2AZ5白細(xì)胞介素-6IL-61ALU蛋白激酶BAkt/PKB3QKL核因子NF-κB4G3D脂聯(lián)素APN4DOU抵抗素Resistin1RGX誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS2Y37單核細(xì)胞趨化蛋白-1MCP-13IFD糖原合成酶3GSK31H8FC反應(yīng)蛋白CRP1GNHC-Jun氨基末端激酶JNK3V6R蛋白激酶CPKC2UZP乙酰輔酶A羧化酶ACC3TDC羥甲基戊二酸單酰CoA還原酶HMGR1DQA蛋白酪氨酸磷酸酶-1BPTP-1B2ZMM特異性磷酸酶活性的抑癌基因PTEN1D5R蛋白激酶APKA4WB5IκB激酶IKK4KIK腺苷酸活化蛋白激酶AMPK4CFH

1.5 分子蛋白作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.0.0軟件建立多成分-多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型，該網(wǎng)絡(luò)包括活性成分和靶點(diǎn)2類節(jié)點(diǎn)，若某一靶點(diǎn)與某化合物有結(jié)合活性，則以邊相連。通過網(wǎng)絡(luò)分析揭示黃芩改善IR的活性成分及作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 分子對(duì)接結(jié)果

Surflex-Dock軟件不僅運(yùn)行速度快，也具有較高可靠性和準(zhǔn)確性。將黃芩中的43個(gè)活性小分子與24個(gè)靶點(diǎn)蛋白分別進(jìn)行對(duì)接，統(tǒng)計(jì)篩選結(jié)果。黃芩中14個(gè)化合物與12個(gè)或12個(gè)以上的靶點(diǎn)有比較強(qiáng)烈的相互作用，結(jié)果見表2。木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、二氫黃芩苷、漢黃芩素-5-β-D-葡萄糖苷、黃芩苷、滇黃芩新苷、黃芩新素、菜油甾醇、5,2′,5′-三羥基-6,7,8-三甲氧基黃酮、甘肅黃芩素 I、圣草素、豆甾醇、半枝蓮種素、5,7,2′-三羥基-6′-甲氧基黃酮、甘黃芩苷元分別與20、17、16、16、16、15、14、14、13、13、13、13、12、12個(gè)蛋白有較好的結(jié)合活性，提示這些成分可能對(duì)黃芩改善IR起重要作用。

2.2 活性成分的多靶點(diǎn)作用研究

采用Cytoscape軟件建立14個(gè)活性成分與24個(gè)靶點(diǎn)間的多成分-多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型，見圖1。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)黃芩所含化合物與靶點(diǎn)蛋白之間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，這14個(gè)活性成分可調(diào)控與IR相關(guān)的24個(gè)靶點(diǎn)。在網(wǎng)絡(luò)模型中，每個(gè)靶點(diǎn)的平均化合物數(shù)為8.5，平均每個(gè)化合物與14.5個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，反映了中藥“多成分、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)。其中，JNK、AMPK、MAPK、PI3K、Akt、GSK3等靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)模型中連接度較高，推測(cè)其可能是黃芩發(fā)揮藥效作用的重要靶標(biāo)。

表2 黃芩分子對(duì)接結(jié)果Table 2 Results of molecular docking of Scutellaria baicalensis

圖1 多成分-多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖
Figure 1 Multi-component and multi-target network

3 討論

總結(jié)最近幾年關(guān)于IR的研究報(bào)道，IR的病理機(jī)制主要包含：胰島素受體前水平、胰島素受體水平、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常、炎癥因子及脂肪因子改變[13-14]。

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑是在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵性作用，蛋白激酶B(Akt)作為PI3K 途徑的下游激酶，能夠通過影響糖原合成酶激酶 3(GSK3)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)等下游分子和蛋白，參與糖原合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及β細(xì)胞功能調(diào)控等方面參與機(jī)體糖代謝調(diào)節(jié)過程[15-17]。由對(duì)接結(jié)果可知，與PI3K、Akt、GSK3、GLUT4對(duì)接得分大于5的化合物分別有13、13、13、6個(gè)，其中與4個(gè)靶點(diǎn)蛋白都有較高結(jié)合活性的化合物有6個(gè)，分別是黃芩新素、5,2′,5′-三羥基-6,7,8-三甲氧基黃酮、半枝蓮種素、圣草素、甘肅黃芩素I、5,7,2′-三羥基-6′-甲氧基黃酮。黃芩改善IR機(jī)制中PI3K/Akt途徑未見報(bào)道，推測(cè)PI3K/Akt通路可能是重要的潛在靶點(diǎn)，同時(shí)以上化合物可能與其通路靶點(diǎn)有關(guān)，其藥理機(jī)制及藥效學(xué)研究有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

如表2、圖1所示，有13個(gè)成分均對(duì)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)具有較好的相互作用，提示AMPK可能是黃芩改善IR的主要作用靶點(diǎn)。與前期文獻(xiàn)報(bào)道的黃芩提取物能活化AMPK，改善IR的結(jié)果相吻合[7]。AMPK是一種在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)能量代謝的蛋白激酶，廣泛存在于骨骼肌、肝臟、胰腺和脂肪組織中。羥甲基戊二酸CoA還原酶(HMGR)和乙酰CoA 羧化酶(ACC)分別是膽固醇和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，也是AMPK的底物。激活A(yù)MPK可使兩者磷酸化失活，從而分別抑制膽固醇和脂肪合成[18-20]。由結(jié)果可知，14種化合物中與HMGR打分結(jié)果大于5的有9個(gè)，分別為二氫黃芩苷、黃芩苷、菜油甾醇、圣草素、豆甾醇、木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、滇黃芩新苷、半枝蓮種素、5,7,2′-三羥基-6′-甲氧基黃酮。與ACC有較好結(jié)合活性的有二氫黃芩苷、木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、豆甾醇、漢黃芩素-5-β-D-葡萄糖苷、黃芩新素、菜油甾醇6個(gè)成分。通過分析，與HMGR、ACC有較好作用的成分都分別與AMPK有較好的結(jié)合活性，暗示這些化合物可能是影響AMPK的活性，從而調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪酸的代謝，達(dá)到改善IR治療糖尿病的效果。劉金鳳等[21]研究表明，黃芩苷可激活肝和骨骼肌中AMPK，對(duì)糖尿病大鼠有一定的保護(hù)作用。其他化合物的藥效學(xué)研究有待進(jìn)一步研究。

PPAR是一類核轉(zhuǎn)錄因子，屬核受體超家族成員，有α、β、γ 3種亞型[22]。其中PPARγ通過影響NF-κB、炎癥因子、脂肪因子等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響糖脂代謝、脂肪形成，其受體激動(dòng)劑用于治療高脂血癥和2型糖尿病[23-24]。黃芩中菜油甾醇、豆甾醇、二氫黃芩苷、黃芩苷、滇黃芩新苷、漢黃芩素-5-β-D-葡萄糖苷、木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷與PPARγ有較好的結(jié)合活性。分析這7個(gè)化合物可能是黃芩改善IR作用于PPARγ靶點(diǎn)的有效物質(zhì)。已有研究表明，黃芩苷通過上調(diào)PPARγ的表達(dá)，升高脂連素水平并降低抵抗素、TNF-α水平，改善IR[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)的成分將為后續(xù)深入研究黃芩的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了方向。

中藥所含的化學(xué)成分復(fù)雜，其藥理作用是中藥所含多種活性成分通過多途徑、多環(huán)節(jié)和多靶點(diǎn)所表現(xiàn)出的綜合或整合作用，作用機(jī)制復(fù)雜，使得中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究是目前中醫(yī)藥研究面臨的最重要、最關(guān)鍵的問題。利用分子對(duì)接的方法，黃芩中的14個(gè)成分與24個(gè)靶點(diǎn)的對(duì)接都有12或12個(gè)以上的靶點(diǎn)打分大于5。其中，二氫黃芩苷、黃芩苷、木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、滇黃芩新苷、5,2′,5′-三羥基-6,7,8-三甲氧基黃酮、圣草素與24個(gè)靶點(diǎn)打分大于7的靶點(diǎn)數(shù)目分別有6、4、4、4、3、3個(gè)，說明這些成分與靶點(diǎn)具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。同時(shí)，JNK、MAPK、IKK、GLUT4、PKA與3個(gè)以上的成分有強(qiáng)烈的相互作用，推測(cè)以上靶點(diǎn)可能也是黃芩改善IR的重要靶標(biāo)。對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖1總體分析表明，黃芩中即存在一個(gè)成分與多個(gè)靶點(diǎn)之間的相互作用，同時(shí)也存在不同成分作用于同一個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象，這一結(jié)果也暗示黃芩改善IR可能涉及到多個(gè)成分、多個(gè)靶點(diǎn)、多生物通路之間的協(xié)同作用，同時(shí)也符合傳統(tǒng)中藥的“多成分-多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Application of molecular docking technology simulation for prediction of the material basis of Scutellaria baicalensis improving insulin resistance

PAN Sina1,2，WANG Yaling1,2，HAN Zhihui1,2，WU Chunwei2，WANG Shumei2，YANG Yongxia1

(1.SchoolofBasicCourses; 2.SchoolofTraditionalChineseMedicine，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China)

Objective To predicate the active substances of Scutellaria baicalensis for improvement of insulin resistance by the molecular docking technology. Methods The molecular docking technology was used to analyze the relationship of 43 compounds of Scutellaria baicalensis with 24 targets related with insulin resistance. Meanwhile，multi-component and multi-target network was established by software Cytoscape. Results 14 compounds of Scutellaria baicalensis displayed good binding activities with above 12 targets. Conclusion The molecular docking technology can be used to screen active ingredients of Scutellaria baicalensis for improving insulin resistance，which may provide a reference for study of the material basis of traditional Chinese medicine.

Scutellaria baicalensis; molecular docking; insulin resistance; material basis

2016-06-03

廣東省公益研究與能力建設(shè)項(xiàng)目(2015A020211033)

潘思娜(1990—)，女，2014級(jí)碩士研究生，Email:pansnzch@126.com; 通信作者：楊永霞，女，博士，教授，主要從事生物波譜學(xué)與代謝組學(xué)研究，Email:sheepma@163.com。

時(shí)間：2016-09-30 9:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.0948.002.html

R285

A

1006-8783(2016)05-0629-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016060301