莖瘤芥（榨菜）子葉及帶下胚軸莖段離體培養(yǎng)研究

朱學棟，何曉蓉，劉華強，楊　霞，朱菲菲，周春江

（重慶市渝東南農業(yè)科學院中心實驗室，重慶涪陵408000）

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莖瘤芥（榨菜）子葉及帶下胚軸莖段離體培養(yǎng)研究

朱學棟，何曉蓉，劉華強，楊霞，朱菲菲，周春江

（重慶市渝東南農業(yè)科學院中心實驗室，重慶涪陵408000）

摘 要：以莖瘤芥永安小葉品種無菌苗子葉和帶下胚軸莖段為材料，初步探索愈傷組織誘導、分化及再生植株生根培養(yǎng).結果表明，子葉與葉柄的切口處極易產(chǎn)生愈傷組織，在MS＋1.0mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1NAA培養(yǎng)基中，愈傷組織分化率達到64%，其不定芽量最大；1／2MS＋0.6mg·L-1IBA培養(yǎng)基對不定根形成最為有利，生根率可達到96%.

關鍵詞：子葉；愈傷組織；分化；生根

莖瘤芥（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）芥菜種葉芥亞種大葉芥變種的變種，其最初由野生芥菜（Brassica juncea）進化而來.

自20世紀70年代至今，蕓薹屬作物組織培養(yǎng)技術取得了很大進展，在芥菜、甘藍型油菜、甘藍、白菜、花椰菜等一系列物種上都建立了較好的再生體系.盡管白菜型油菜（B.campestris），包括大白菜（B.campestris ssp.pekinensis）、白菜（B.campestris ssp.chinemis）等是組織培養(yǎng)比較困難的一些品種，但到目前為止，白菜等一些蔬菜已經(jīng)獲得了組織培養(yǎng)較高的再生體系頻率.

我國對蕓薹屬作物離體培養(yǎng)研究起步較晚，張智奇等［1］以小白菜的子葉為外植體、候喜林等［2］以不結球白菜的矮腳黃品種的子葉為外植體進行離體培養(yǎng)的時候，均發(fā)現(xiàn)了器官不經(jīng)過愈傷組織誘導而直接分化成不定芽的結果.1991年雷建軍等［3］對中國芥菜的器官培養(yǎng)進行了研究，發(fā)現(xiàn)基因型、外植體、生理狀態(tài)對器官培養(yǎng)植株再生都有很大影響.陳利萍等［4］在2004年利用組織培養(yǎng)技術輔助莖用芥菜育種，解決了大株留種困難、性狀鑒定時需犧牲親本等問題，也可解決育種過程遇到溫度過高、水分不足或蟲害等不良自然條件而無法正常收獲種子時的種質資源保存和繁殖的問題.張艷梅等［5］在榨菜下胚軸愈傷組織誘導及分化中得到了較高頻的愈傷組織誘導率及分化率.孫全等［6］用正交試驗優(yōu)選莖瘤芥子葉組培誘導培養(yǎng)基研究中篩選出了子葉誘導的最佳培養(yǎng)基為MS＋6-BA 3.0mg·L-1＋NAA 0.10 mg·L-1.

植物材料的基因類型直接影響著離體培養(yǎng)的效果，不同材料再生能力不同［7］，因此，作者選定一個供試品種，從愈傷組織誘導、不定芽分化、生根培養(yǎng)角度研究莖瘤芥組織培養(yǎng)技術，為今后莖瘤芥誘變育種、多倍體育種等莖瘤芥材料創(chuàng)制提供技術支撐.

1　材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為重慶市涪陵區(qū)本地品種永安小葉，材料由重慶市渝東南農業(yè)科學院提供.

1.2 實驗方法

1.2.1 無菌苗誘導

將永安小葉種子在自來水下沖洗2h.清洗干凈后拿到無菌操作臺升汞消毒7min（此過程需要不停地震蕩），無菌水清洗5遍后接種在無菌苗誘導培養(yǎng)基上.無菌苗誘導培養(yǎng)基為1／2MS＋瓊脂5.5g·L-1，溫度（25±2）℃，光照12h·d-1.

1.2.2 愈傷組織誘導和不定芽分化

誘導和分化培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，添加質量分數(shù)為0.55%的瓊脂、3%的蔗糖，以及添加不同濃度的NAA（0.1、0.2）mg·L-1＋6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0）mg·L-1，調節(jié)pH為5.8.考察不同激素配比對愈傷組織誘導和不定芽分化的影響.無菌苗子葉每瓶接種10片，（25±2）℃，暗培養(yǎng)；帶下胚軸莖段每瓶接種6個，（25±2）℃，光照12h·d-1，分別接種在上述不同激素配比的培養(yǎng)基中.30d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率及不定芽分化率.

1.2.3 生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)以1／2MS為基本培養(yǎng)基，附加質量分數(shù)為0.55%的瓊脂、2%的蔗糖，添加不同濃度的IBA（0.2、0.4、0.6、0.8）mg·L-1或NAA（0.2、0.4、0.6、0.8）mg·L-1.每瓶培養(yǎng)基接種高度2cm左右的不定芽小苗5～7根.暗培養(yǎng)3d后光照培養(yǎng)，光照12h·d-1，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計生根率.

1.2.4 煉苗和移栽

將已生根的小苗移到玻璃溫室，不開蓋煉苗7d，打開蓋子，煉苗4d，用清水將小苗根部的培養(yǎng)基洗凈，移栽到裝有普通營養(yǎng)土的花缽中，遮陰，保持土質濕潤，溫度控制在27℃左右，其余常規(guī)管理.

1.2.5 實驗材料編號

實驗編號由“主編號-副編號”組成，主編號由實驗材料決定，子葉材料編號為1，帶下胚軸莖段編號為2，再生植株編號為3，副編號由實驗所使用的激素濃度決定，由激素濃度由低到高依次編號.

2　結果與分析

2.1 不同濃度激素配比對子葉愈傷組織和不定芽分化的影響

愈傷組織誘導和不定芽分化中添加不同濃度的6-BA和NAA組合后，出愈率和分化率見表1.

表1　不同濃度的激素對子葉愈傷組織和不定芽分化的影響Tab.1　Effects of the cotyledon callus and adventitious bud differentiation by different hormone concentration

由表1可以看出，子葉接種在培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)30d后子葉出愈率可達到100%，主要在子葉與子葉柄切口處形成大量淡黃色愈傷組織，愈傷量小，且伴有大量的毛狀根的形成.不定芽分化率均不高，最高分化率為編號1-6，分化率達到64%，激素用量為1.0mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1NAA；最低分化率為編號1-4，分化率達到14%，激素用量為2.0mg·L-16-BA＋0.1mg·L-1NAA.從表1中可以看出，NAA用量一定的情況下，隨著6-BA濃度的升高，分化率先升高后降低，說明過高濃度的6-BA對愈傷組織分化有一定的抑制作用；在6-BA濃度一定的情況下，隨著NAA濃度的升高，分化率有一定的提高，說明適當提高NAA濃度有利于愈傷組織不定芽的分化.

2.2 不同濃度的激素對帶下胚軸莖段出苗率的影響

將帶下胚軸的莖段接種在不同濃度梯度的MS培養(yǎng)基種，出苗率及植株長勢見表2.

表2　不同濃度的激素對帶下胚軸莖段出苗率的影響Tab.2　Effect of the hypocotyl stem section under emergence rate by different hormone concentration

由表2可以看出，在不同濃度梯度的激素配比下帶下胚軸的莖段均能出苗，出苗率達到100%，且在基部均有愈傷組織的生成，NAA用量的提高，基部愈傷組織的量明顯增加；在NAA濃度不變的情況下，隨著6-BA濃度的提高，再生小苗高度增加，葉柄肥厚，葉片細長；在低濃度的6-BA作用下葉片大，小苗較為健壯.在激素濃度為1.0mg·L-16-BA＋0.1mg·L-1NAA的作用下，小苗長勢最好.

2.3 生根情況

將長高至3cm左右的再生小苗接種含有不同濃度激素的1／2MS培養(yǎng)基上，生根結果見表3.

表3　不同濃度的激素對組培苗生根的影響Tab.3　Effect of rooting by different hormone concentration

由表3可看出，IBA和NAA均能不同程度地誘導再生植株生根，最高生根率為添加0.6mg·L-1的NAA，達到97%；最低生根率為添加0.8mg·L-1的IBA，達到74%.隨著IBA和NAA濃度的提高，生根率出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，均在用量為0.6mg·L-1時達到最大生根率，說明高濃度的生長素會抑制再生植株的生根.采用IBA和NAA誘導的再生植株生根基本一致，但根的長勢IBA整體情況較好，IBA誘導的生根根多、長、粗壯、側根較多；NAA誘導根細長、少、側根少.因此，采用0.6mg·L-1IBA對再生植株誘導生根效果最佳.

2.4 煉苗移栽結果

不定芽生根培養(yǎng)30d以后，將小苗移到玻璃溫室中，不開蓋煉苗7d，打開蓋子，煉苗4d，用清水將小苗根部的培養(yǎng)基洗凈，移栽到花缽中，保持水分充足，3d后葉片完全展開，葉色飽滿，生長正常，移栽成活率達到98%以上.

3　討 論

以永安小葉無菌苗子葉和帶下胚軸莖段為供試材料，子葉連接葉柄切口處極易形成愈傷組織，但愈傷組織量小、淡黃色，且伴有毛狀根的形成；20d后分化出再生植株，下胚軸莖段接種后7d左右即可觀察到生長點長出真葉，且長勢良好.沈進娟等［8］使用涪陵當?shù)亍坝腊残∪~”“郫縣榨菜”“藺市草腰子”3個地方品種進行不定芽誘導，發(fā)現(xiàn)植株再生頻率與材料基因型有密切的關系.Takasaki等［9］曾報道在白菜子葉培養(yǎng)中BA和NAA是必不可少的激素，而甘藍型油菜的子葉培養(yǎng)，只有BA是必需激素，不同種類的生長素的作用有明顯差異.該實驗愈傷組織誘導分化只采用了NAA作為唯一的生長激素，當激素配比達到1.0mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1NAA時，最高分化率達到64%.Chi等［10］在菜心離體培養(yǎng)中加入AgNO3和ABA，可有效抑制不定根的形成，從而有利于愈傷組織不定芽的分化，陳石頭［11］在榨菜帶柄子葉分化中添加5mg·L-1AgNO3，能有效提高帶柄子葉的分化效率，張鵬等［12］也有類似的研究結論.該實驗并未驗證該法，有待進一步實驗.

該實驗在子葉誘導愈傷組織分化的過程中發(fā)現(xiàn)再生植株易出現(xiàn)玻璃化苗、畸形苗現(xiàn)象.陳國菊［13］在芥菜離體培養(yǎng)中玻璃化機制進行了深入研究，但并未給出如何控制離體培養(yǎng)中的玻璃化現(xiàn)象，筆者通過降低溫度調整效果不明顯，現(xiàn)階段正通過調整培養(yǎng)基成分來控制玻璃化現(xiàn)象，結果尚不明確，而帶下胚軸莖段在培養(yǎng)溫度不高于27℃條件下培養(yǎng)，可有效抑制玻璃化苗的產(chǎn)生.因此，子葉誘導愈傷組織再分化過程還需要進一步研究，以期獲得高頻的愈傷組織誘導再生植株.

參考文獻：

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［3］ 雷建軍，陳世儒，郭余龍，等.莖用芥菜的原生質體培養(yǎng)及植株再生［J］.植物學報，1991，33（2）：91-97.

［4］ 陳利萍，李春順，戈加欣.利用組織培養(yǎng)技術輔助莖用芥菜育種［J］.中國蔬菜，2005（3）：22-23.

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（責任編輯 于 敏）

The study of cotyledon and hypocotyl with stem
on Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee in vitro culture

ZHU Xuedong，HE Xiaorong，LIU Huaqiang，YANG Xia，ZHU Feifei，ZHOU Chunjiang （The Central Laboratory of Southeast of Chongqing Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uling 400800，China）

Abstract：Cotyledon and hypocotyl stem section under as materials of Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee named Yongan Xiaoye，are used to explore callus induction，differentiation and regeneration plant rooting culture preliminarily.The results showed that the slit of cotyledon and petiole produce callus.Cultured in MS＋1.0mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1NAA medium，the callus differentiation rate reached to 64%.In 1／2MS＋0.6mg·L-1IBA medium for adventitious root formation is most favorable，the rooting rate reached to 96%.

Key words：cotyledons；callus；differentiation；rooting

doi：10.3969／j.issn.1000-2162.2016.01.014

作者簡介：朱學棟（1984-），男，甘肅蘭州人，重慶市渝東南農業(yè)科學院助理研究員，碩士.

基金項目：重慶市涪陵區(qū)科委項目（FLKJ，2014ABB2066）

收稿日期：2015-05-08

中圖分類號：O156

文獻標志碼：A

文章編號：1000-2162（2016）01-0086-05