地衣芽孢桿菌降解茶皂素的研究

黃　浦，肖　瑜＊，覃　妍，范文哲

（1.桂林理工大學(xué)廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004；2.桂林理工大學(xué)廣西巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西桂林541004）

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地衣芽孢桿菌降解茶皂素的研究

黃浦1，2，肖瑜1，2＊，覃妍1，2，范文哲1，2

（1.桂林理工大學(xué)廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004；
2.桂林理工大學(xué)廣西巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西桂林541004）

摘 要：以茶皂素（tea saponin）為原料，以茶皂素降解率為指標(biāo)，利用地衣芽孢桿菌降解茶皂素.分別探討發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、接種量對(duì)其降解的影響，再通過響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明，影響降解率顯著性次序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度（X2）＞接種量（X4）＞發(fā)酵時(shí)間（X1）＞搖床轉(zhuǎn)速（X3），得到最佳的優(yōu)化條件為：發(fā)酵時(shí)間10.9d，發(fā)酵溫度28.89℃，搖床轉(zhuǎn)速150r·min-1，接種量為9.11%.在此條件下發(fā)酵茶皂素的降解率達(dá)到了（63.83±0.28）%.

關(guān)鍵詞：茶皂素；地衣芽孢桿菌；液態(tài)發(fā)酵；響應(yīng)曲面分析

油茶是中國(guó)特有的一種山茶科山茶屬植物，主要分布于湖南、江西和廣西等南方地區(qū)［1］.油茶粕是油茶榨取茶油后的副產(chǎn)物，其中含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、粗纖維及礦物質(zhì)［2］；油茶茶枯中富含Mg、Fe、Ca、Mn、Zn、Cu等多種無(wú)機(jī)微量元素.但是，茶枯中的茶皂素（含量10%～15%），具有辛辣、刺鼻的特性，還具有魚毒和溶血作用，極大程度地降低了油茶粕作為飼料使用的利用率.

茶皂素（tea saponin）屬于五環(huán)三萜類皂甙，分子式為C57H90O26，相對(duì)分子質(zhì)量為1 203，熔點(diǎn)為223～224℃，表面張力為47～51Mn·m-1［3］，由甙元、糖和有機(jī)酸3部分組成，是一種非離子型極性物質(zhì)，茶皂素純品為白色微細(xì)柱狀晶體，吸濕性強(qiáng)，難溶于冷水、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇，不溶于乙醚、丙酮、苯、石油醚等有機(jī)溶劑，稍溶于溫水、二硫化碳和醋酸乙酯，易溶于含水甲醇、含水乙醇、正丁醇及冰醋酸、醋酐和吡啶［4］.

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是一種土壤中常見的細(xì)菌，是一類需氧或兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，細(xì)胞大小為0.8μm×（1.5～3.5）μm，細(xì)胞形態(tài)和排列呈桿狀、單身.

地衣芽孢桿菌是被我國(guó)農(nóng)業(yè)部公布允許使用的飼料級(jí)微生物添加劑，它在一定條件下能產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子，可產(chǎn)生脂肽類、肽類、磷脂類、多烯類和氨基酸類等多種抗生素，還可以產(chǎn)生各種酶類，如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等［5］，并且具有易培養(yǎng)、繁殖快、易保存、對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、無(wú)毒無(wú)污染等特點(diǎn).董尚智等［6］研究表明，地衣芽孢桿菌具有良好的飼料學(xué)特性，是一種優(yōu)良的益生菌菌株.周振峰［7］研究表明，在奶牛飼料中添加地衣芽孢桿菌制劑能增強(qiáng)奶牛抵抗熱應(yīng)激的能力，并能夠起到抗病的作用.劉波等［8］實(shí)驗(yàn)研究表明，在銀鯽飼料中添加地衣芽孢桿菌，可以促進(jìn)魚體生長(zhǎng).

該研究采用枯草芽孢桿菌對(duì)茶皂素進(jìn)行液態(tài)搖床培養(yǎng)，以茶皂素降解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速及菌種接種量的單因子實(shí)驗(yàn)研究得出最優(yōu)降解條件，并通過GCMS對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析.

1　材料和儀器

1.1 菌 種

地衣芽孢桿菌GIM1.362（Bacillus licheniformis）購(gòu)買于廣東省微生物研究所菌種保藏中心.

1.2 原料與培養(yǎng)基

茶皂素，純度在98%以上，購(gòu)于長(zhǎng)沙哈根生物科技有限公司.

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨（5g·L-1），牛肉膏（3g·L-1），氯化鈉（5g·L-1），瓊脂（20g·L-1），pH自然.

發(fā)酵培養(yǎng)基：茶皂素（2g·L-1），尿素（2g·L-1），磷酸二氫鉀（3g·L-1），磷酸氫二鉀（6g· L-1），硫酸鎂（1g·L-1），硫酸錳（0.2g·L-1），pH自然.

1.3 主要儀器及設(shè)備

Clarus 680氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)PE公司；Agilent Technologies 1260Infinity高效液相色譜，美國(guó)安捷倫公司；Dragonlab 1 000μL移液槍，大龍儀器有限公司；SH ZB水浴恒溫振蕩器，上海安亭科學(xué)儀器廠；TGL18000cR高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；AR224CN電子分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；SNGJ2FD潔凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LTFG通風(fēng)柜，深圳市利龍湖實(shí)業(yè)有限公司；YXQLS70A立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司.

1.4 主要化學(xué)試劑

甲醇，色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨，分析純，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；尿素、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、瓊脂粉，分析純，西隴化工股份有限公司.

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1 茶皂素標(biāo)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

準(zhǔn)確稱取2.5g茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品，定容于250mL的容量瓶中，為10mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液，準(zhǔn)確量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL標(biāo)準(zhǔn)液于10mL的比色管中，分別用甲醇（色譜純）定溶至刻度線，搖勻，用注射器抽取一定量液體，過0.45μm的針頭過濾器，注入1.5mL液相進(jìn)樣瓶中，最終用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，高效液相色譜洗脫方式為純甲醇以0.5mL·min-1的速度洗脫，進(jìn)樣量為2μL，柱箱溫度30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)218nm.當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)方差達(dá)到0.999以上為合格，如圖1所示.

圖1　茶皂素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Tea saponin standard curve

2.2 地衣芽孢桿菌菌懸液的制備

用壓力蒸汽滅菌鍋滅菌250mL超純水，2個(gè)250 mL的廣口錐形瓶，于121℃高溫下滅菌30min，將滅菌過后的無(wú)菌水及錐形瓶放在潔凈工作臺(tái)上，紫外殺菌30min，冷卻至室溫，再倒入少量無(wú)菌水于斜面培養(yǎng)基中，用涂布棒輕輕將地衣芽孢桿菌的菌落撮取下來，倒入到250mL廣口錐形瓶中，放入到25℃，150r·min-1的水浴恒溫振蕩器中回旋振蕩30min，再用棉花擋住瓶口，過濾到另一滅菌后的250mL廣口錐形瓶中，最后放入到冷藏柜中保存?zhèn)溆?制得菌懸液濃度約106cfu·mL-1.

2.3 地衣芽孢桿菌降解茶皂素單因子實(shí)驗(yàn)設(shè)定

根據(jù)微生物發(fā)酵環(huán)境的差異，分別考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速及接種量等單因子對(duì)地衣芽孢桿菌降解茶皂素的影響，來確定發(fā)酵的最佳范圍，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù).

2.4 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先用Minitab16中的Plackett-Burman軟件進(jìn)行影響發(fā)酵顯著因子的篩選，確定影響較大的單因素之后，選取3個(gè)顯著因素，再用Box-Behnken設(shè)計(jì)曲面響應(yīng)面實(shí)驗(yàn).

3　結(jié)果與分析

3.1 時(shí)間對(duì)地衣芽孢桿菌降解茶皂素的影響

由圖2可知，發(fā)酵前2天的時(shí)候，由于微生物進(jìn)入新的環(huán)境要經(jīng)過調(diào)整期，以適應(yīng)新的環(huán)境，導(dǎo)致降解率比較低，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，茶皂素的降解率不斷升高，到第11天的時(shí)候，對(duì)茶皂素的降解效果已經(jīng)非常明顯，此時(shí)地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，再延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，茶皂素降解效果變化不明顯，因而得出，茶皂素的最佳發(fā)酵時(shí)間為11d.

3.2 溫度對(duì)地衣芽孢桿菌降解茶皂素的影響

由圖3可知，隨著溫度的不斷升高，茶皂素降解率呈現(xiàn)出由低到高再到低的趨勢(shì)，在29℃時(shí)，降解率達(dá)到最大，此時(shí)的地衣芽孢桿菌活性最大，為其發(fā)酵的最佳發(fā)酵溫度；溫度較高或者較低時(shí)，茶皂素降解不理想，主要是因?yàn)楦邷鼗蛘叩蜏囟扔绊懥嗣傅幕钚?，不利于地衣芽孢桿菌對(duì)茶皂素的降解.

圖2　時(shí)間對(duì)茶皂素降解的影響Fig.2　Time influence on the degradation of tea saponin

圖3　溫度對(duì)茶皂素降解的影響Fig.3　Temperature influence on the degradation of tea saponin

3.3 轉(zhuǎn)速對(duì)地衣芽孢桿菌降解茶皂素的影響

由圖4可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大，茶皂素的降解率呈現(xiàn)出一種由低到高再到低趨勢(shì)，因地衣芽孢桿菌是好氧菌，溶解氧的多少對(duì)其新陳代謝有著決定性作用.當(dāng)轉(zhuǎn)速過低時(shí)，發(fā)酵液中溶解氧過少，，不利于微生物的生長(zhǎng)代謝，從而導(dǎo)致茶皂素的降解偏低；當(dāng)轉(zhuǎn)速過高，溶解氧含量過高時(shí)，可能是過高的氧會(huì)轉(zhuǎn)化成超氧化物基O2-和過氧化物基O22-或羥基自由基OH-，破壞微生物細(xì)胞組分，或者是過高的轉(zhuǎn)速不利于菌膠團(tuán)的形成，從而影響到茶皂素的降解，得到最佳的轉(zhuǎn)速為150r·min-1.

3.4 接種量對(duì)地衣芽孢桿菌降解茶皂素的影響

由圖5可知，隨著地衣芽孢桿菌接種量的增加，茶皂素降解率呈現(xiàn)出由低到高再到低的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為9%時(shí)，降解效果最好，茶皂素降解率達(dá)到了63.83%；當(dāng)接種量低于9%時(shí)，隨著接種量的增加，降解率變化較大，主要是充足的營(yíng)養(yǎng)提供菌體大量的生長(zhǎng)繁殖；接種量超過9%后，由于大量的微生物共存，微生物之間產(chǎn)生了大量的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)了相互競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系，激烈的相互競(jìng)爭(zhēng)不利于微生物生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致降解率降低.

圖4　轉(zhuǎn)速對(duì)茶皂素降解的影響Fig.4　Rotate speed influence on the degradation of tea saponin

圖5　接種量對(duì)茶皂素降解的影響Fig.5　Inoculum size influence on the degradation of tea saponin

3.5 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.5.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

通過單因子實(shí)驗(yàn)所得的最適培養(yǎng)條件，選取培養(yǎng)時(shí)間（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）、搖床轉(zhuǎn)速（X3）、接種量（X4）作為變量，以茶皂素的降解率（Y）作為響應(yīng)值.通過Minitab16軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，篩選出顯著單因子.實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表及Plackett-Burman設(shè)計(jì)如表1～2所示.

將表2的結(jié)果通過Mintabl16軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，得到影響地衣芽孢桿菌生物降解的顯著因素為：X2＞X4＞X1＞X3，置信度R2＝95.18%，因而選取發(fā)酵時(shí)間（X1）、發(fā)酵溫度（X2）及接種量（X4）來進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn).

表1　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Tab.1　Plackett-Burman experimental design factors level code table

表2　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2　Plackett-Burman experimental design and results

3.5.2 Box-Behnken Design設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)3.5.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵時(shí)間（X1）、發(fā)酵溫度（X2）及接種量（X4）3個(gè)顯著因素，以茶皂素降解率（Y）作為降解指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn).每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平以（-1、0、1）為編碼，如表3所示.

表3　Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素及水平Tab.3　Box-Behnken design experimental factors and levels

表4　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.4　Box-Behnken experimental design and results

根據(jù)表4中的數(shù)據(jù)分析，可以得到以下的三元二次方程式

通過對(duì)回歸方程的求解得到地衣芽孢桿菌發(fā)酵茶皂素的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間10.9d，發(fā)酵溫度28.89℃，搖床轉(zhuǎn)速150r·min-1，接種量為9.11%.模型極顯著（P＜0.001），因變量與自變量之間線性關(guān)系顯著（R2＝99.29%），擬合程度較好（Radj2＝98.39%），表明該實(shí)驗(yàn)所選用模型高度顯著.在最佳的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，茶皂素的降解率為（63.83±0.28）%，與理論值64.55%很接近，說明此模型能夠很好地預(yù)測(cè)地衣芽孢桿菌降解茶皂素的降解效果.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到響應(yīng)面圖和等高線圖，如圖6～8所示.

圖6　y=f（X1，X2）響應(yīng)面曲面圖和相應(yīng)的等高線圖Fig.6　3Danalysis chart and contour man of y=f（X1，X2）

由圖6可知，發(fā)酵溫度計(jì)發(fā)酵時(shí)間對(duì)茶皂素的降解率變化范圍較明顯，發(fā)酵溫度在28.89℃、發(fā)酵時(shí)間在10.9d時(shí)降解效果最理想.等高線間距較小，說明發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)茶皂素的降解影響比較大.

圖7　y=f（X1，X4）響應(yīng)面曲面圖和相應(yīng)的等高線圖Fig.7　3Danalysis chart and contour man of y=f（X1，X4）

由圖7可知，發(fā)酵時(shí)間（X1）對(duì)茶皂素降解率的影響比接種量（X4）大，等高線間距比較小且閉合，說明發(fā)酵時(shí)間和接種量是影響茶皂素降解的重要因素.

圖8　y=（X2，X4）響應(yīng)面曲面圖和相應(yīng)的等高線圖Fig.8　3Danalysis chart and contour man of y=f（X2，X4）

由圖8可知，發(fā)酵溫度（X2）對(duì)茶皂素降解率的影響比接種量（X4）大，等高線閉合且密集，說明發(fā)酵溫度和接種量對(duì)茶皂素降解率影響明顯.

4　結(jié)束語(yǔ)

茶皂素是影響油茶粕作為飼料使用利用率低的主要障礙，作者利用地衣芽孢桿菌來降解茶皂素，具有工藝簡(jiǎn)單、節(jié)約成本、無(wú)二次污染的特點(diǎn)；利用地衣芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵降解茶皂得到的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間10.9d，發(fā)酵溫度28.89℃，搖床轉(zhuǎn)速150r·min-1，接種量為9.11%，在此條件下，茶皂素的降解率能夠達(dá)到了（63.83±0.28）%，實(shí)際降解率與理論降解率很接近，說明此模型能夠很好地預(yù)測(cè)茶皂素的降解率，說明地衣芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵降解茶皂素具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.

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（責(zé)任編輯 于 敏）

Study on the degradation of tea saponin by Bacillus licheniformis

HUANG Pu1，2，XIAO Yu1，2＊，QIN Yan1，2，F(xiàn)AN Wenzhe1，2
（1.Guangxi Key Laboratory of Environmental Pollution Control Theory and Technology，Guilin University of Technology，Guilin 541004，China；2.Guangxi Collaborative Innovation Center for Water Pollution Control and Water Safety in Karst Area，Guilin University of Technology，Guilin 541004，China）

Abstract：Using tea saponin as raw material，with tea saponin degradation rate as the evaluation index，tea saponin was degraded by Bacillus licheniformis.Fermentation time，fermentation temperature，rotation speed and inoculum size on its degradation were explored，again through the response surface design experiments the fermentation conditions were optimized.The results showed that，the order of four kinds of factors significantly impacting the fermentation of Bacillus licheniformis as follows：fermentation temperature （X2）＞inoculation size（X4）＞fermentation time（X1）＞rotation speed（X3）.The optimum fermentation degradation conditions were studied as：fermentation time 10.9d，fermentation temperature 28.89℃，rotating speed 150r·min-1and inoculum size 9.11%，the degradation of tea saponin rate reached（63.83±0.28）%.

Key words：tea saponin；Bacillus licheniformis；liquid fermentation；response surface analysis

doi：10.3969／j.issn.1000-2162.2016.01.015

作者簡(jiǎn)介：黃 浦（1989-），男，重慶人，桂林理工大學(xué)碩士研究生；＊肖 瑜（通信作者），桂林理工大學(xué)教授，博士，E-mail：1474237310＠qq.com.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21367010）；廣西礦冶與環(huán)境科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西危險(xiǎn)廢物處置產(chǎn)業(yè)化人才小高地資助項(xiàng)目

收稿日期：2015-03-28

中圖分類號(hào)：O156

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-2162（2016）01-0091-07