基因分離及克隆技術(shù)在熱帶果樹中的應用研究進展

安娜 吳友根 陳萍

（海南大學熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室 海南大學園藝園林學院，?？?570228）

基因分離及克隆技術(shù)在熱帶果樹中的應用研究進展

安娜 吳友根 陳萍

（海南大學熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室 海南大學園藝園林學院，?？?570228）

以常見的幾種熱帶水果（香蕉、番木瓜、芒果、菠蘿和荔枝等）為例，總結(jié)了近年來利用常見的技術(shù)手段如cDNA末端快速克隆技術(shù)（repid-amplification of cDNA ends，RACE）和實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應技術(shù)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）等方式進行基因分離，并將成功克隆出的目的基因或片段進行基因分析與表達研究，最后闡述了基因分離與克隆技術(shù)的優(yōu)勢與缺陷，對基因分離及克隆技術(shù)提出了展望，旨為今后科研人員進行進一步的基因分子生物學水平上的熱帶果樹研究與熱帶農(nóng)業(yè)科學研究奠定基礎。

熱帶果樹；基因；分離；克隆

南回歸線與北回歸線之間的地區(qū)為熱帶地區(qū)，適應這種熱帶地區(qū)氣候并能夠在該地區(qū)生長的果樹通常被人們稱之為熱帶果樹，海南及云南南部熱帶、亞熱帶水果種類非常豐富，有些為海南所特有的熱帶水果品種。近年來，基因分離技術(shù)已經(jīng)廣泛的應用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究領域，也逐漸被更多地應用到熱帶果樹的研究上，基因克隆技術(shù)成熟大約是在20世紀70年代初期，通?；蚩寺〖夹g(shù)是將來自不同生物的基因與能夠進行自我復制的載體DNA在體外進行人工拼接，構(gòu)建成新的cDNA文庫，常見的基因分離方法有基因文庫、基因芯片、功能蛋白組分離目的基因、聚合酶鏈式反應（PCR）、mRNA差別顯示、插入突變分離克隆目的基因、圖位克隆目的基因、酵母雙雜交系統(tǒng)分離克隆基因、生物信息學技術(shù)以及諸如基因表達系列分析（SAGE）、抑制性差減雜交（SSH）等的克隆基因新技術(shù)［1］。如今科研人員最常用的幾種主要方法為功能克隆法、轉(zhuǎn)座子標簽法、序列克隆法、圖位克隆法、mRNA差別顯示PCR法、差別篩選法和差減雜交等。這些分子生物學方法，并不是只能單獨使用，也能夠?qū)煞N或多種方法結(jié)合使用以提高目的基因分離的精度與純度。下面根據(jù)主要的熱帶果樹品種來闡述近年來基因分離與克隆技術(shù)成功應用的實例與總結(jié)。

1 熱帶果樹基因分離技術(shù)應用與總結(jié)

1.1 香蕉基因分離的研究

香蕉（Musa nana Lour.）是一種大眾普遍喜愛的熱帶水果，近年來，基因分離技術(shù)在香蕉選種育種中發(fā)揮了重要的作用，目前香蕉的基因組測序已經(jīng)完成，2012年，由法國研究人員領導的國際小組采用Roche454、Sanger和Illumina的測序方法成功繪制出了523 Mb的香蕉雙單倍體小果野蕉的基因組圖譜。張俊芳［2］在2013年通過SSH技術(shù)克隆出了香蕉乙烯應答因子結(jié)合蛋白（ethylene responsive factor binding protein，ERF）基因并命名為MaERF和決定表皮毛發(fā)育的關鍵轉(zhuǎn)錄因子MYB基因并命名為MaMYB基因，這些基因都與香蕉的果皮帶毛基因有關；趙巧陽［3］在其實驗中克隆了1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶（ACS）基因，ACS是乙烯合成中的限速酶，對今后香蕉品種的改良研究具有十分重要的價值。但是香蕉枯萎病讓大量的香蕉絕產(chǎn)，基因分離技術(shù)在香蕉病害的研究也日漸成熟，陳雅平等［4］通過運用抗病基因同源克隆技術(shù)（RGAs）發(fā)現(xiàn)，WNB1和WST1的表達量增加，表明這兩個同源抗病基因可能和香蕉枯萎病的抗性有一定關系；孫嘉曼［5］在其文章中提到運用高通量測序技術(shù)對香蕉枯萎病進行更加深入的研究。還有一些研究著重于香蕉自然抗性上，劉德兵［6］在實驗中用ADGE法分離了與冷誘導相關的基因；匡云波［7］在其實驗中克隆了大量的與香蕉葉片糖代謝有關的幾個關鍵酶基因（AMY、BMY、SPS、SSIII、SuSy、Inv和GBSSI），并研究了其在低溫脅迫下的表達；Wang等［8］克隆了8個鈣依賴性蛋白激酶（CDPK）基因，該基因在香蕉苗的生長與脅迫應答中扮演重要角色，Wang等［9］從香蕉中克隆了MaARF基因，并分析了其在香蕉成熟過程中的表達變化，實驗證明該基因在香蕉采后成熟過程中有誘導乙烯的合成的作用。

1.2 番木瓜基因分離的研究

番木瓜（Carica papaya L.）是一種常見的并且含有豐富營養(yǎng)成分的大眾非常喜愛的熱帶水果。2008年，首個番木瓜基因草圖被成功繪制出來，這張草圖是由南開大學和美國的研究機構(gòu)一起進行的聯(lián)合研究。該草圖成功繪制出了90%的番木瓜基因編碼序列，番木瓜是到目前為止有詳細基因組信息的第5個被子植物。其它的幾種植物分別為擬南芥、水稻、白楊和葡萄。番木瓜屬于呼吸躍變型水果，Mason等［10］從番木瓜中分離了兩個ACC合成酶基因的cDNA全長，Lin等［11］、Hidalgo等［12］也都克隆了ACS基因，申艷紅［13］克隆了內(nèi)參基因CpActin全長cDNA序列，番木瓜果實半定量RT-PCR分析技術(shù)體系也成功建立了；李澤友［14］克隆了與番木瓜芐基硫苷類物質(zhì)（benzyl glucosinolate，BG）生物合成相關的基因它們分別是（CP-CYP79A2.1、CPCYP79A2.2、CP-CYP83B、CP-C-S、CP-UDP-T及CPST5a），這些相關基因可編碼產(chǎn)生有防癌抗癌功能的異硫氰酸酯類物質(zhì)；言普等［15］克隆了番木瓜的IF（iso）4E基因；林瑩［16］在實驗中克隆出了具有抗軟化功能的果膠裂解酶基因（pectinlyase，PL），為耐貯藏番木瓜的育種工作打下了基礎；申艷紅利用cDNA-AFLP技術(shù)克隆出了番木瓜半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease，CP）的CpCP基因，該基因?qū)儆贑1肽酶家族中的C1A亞家族，與番木瓜果實成熟衰老進程有關［17］；趙新偉［18］利用RACE和RT-PCR技術(shù)克隆了類胡蘿卜素生物合成途徑相關的PDS、ZDS和LCY-B的cDNA 序列，為番木瓜果肉顏色形成機理研究奠定了分子基礎；Vallejo-Reyna 等［19］克隆了乙烯影響因子ERF轉(zhuǎn)錄因子基因，并分析了其在不同組織中的表達差異；番木瓜環(huán)斑花葉病是一種流傳于番木瓜間的病毒性病害，杜中軍等［20］根據(jù)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類（serine/threonine protein kinase，STK）抗病基因產(chǎn)物催化結(jié)構(gòu)域I和IX的氨基酸保守序列設計簡并引物，克隆了gPK1-gPK5和cPK1-cPK4基因；與抗病有關的同源基因（Resistance Gene，R）也從番木瓜中被成功克??；徐兵強［21］運用了根據(jù)保守序列設計簡并引物尋找R基因同源序列（resistance gene analogs，RGA）的方法從番木瓜中成功克隆出了2條NBS-LRR類（Nucleotide bindingsite-leucine-rich repeats）RGAs序列和5條STK類RGAs序列。

1.3 芒果基因分離的研究

芒果（Mangifera indica L.）是一種熱帶漆樹科常綠大喬木果樹，在中國的南方的邊疆六?。êＤ?、廣東、廣西、云南、福建和臺灣）都有種植，原產(chǎn)自印度，孟加拉、中南半島和馬來西亞也有種植，世界各地廣為流傳，中國栽培已達40余個品種，對于芒果的研究一般集中在芒果成熟及其抗性相關基因上。李運合等［22］采用RT-PCR結(jié)合RACE方法從芒果品種紫花芒中分離了乙烯受體基因MiETR1b，并對此基因進行分析，得出MiETR1b為ETR1家族同源基因，參與調(diào)控不定根的形成；肖潔凝等［23］采用SSH方法分離了芒果中與子葉切段不定根形成相關的基因，這些基因與轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及酶基因的DNA序列同源；趙常志［24］采用RTPCR和RACE方法從芒果果實中克隆得到了查爾酮異構(gòu)酶基因（CHI）的全長cDNA序列，該酶是類黃酮化合物合成途徑中的關鍵酶；趙常志用3' RACE和5' RACE法分離得到了芒果果實PAL的基因序列，PAL是酚類物質(zhì)合成的第一個酶，對不同芒果品種的PAL基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，紅色貴妃品種該基因的表達量高，而綠色桂七品種中該基因的表達量低［25］；魏軍亞［26］利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1，SOC1）基因，該基因有調(diào)控植物開花的作用，命名為MSOC1；劉洋等［27］從金煌芒基因組DNA中分離得到了10條具有潛在功能的抗病基因片段；張波等［28］運用同源克隆的方法克隆了與調(diào)控花色苷合成有關的DRF基因，并分析了不同芒果品種中該基因的表達差異；董龍等［29］對四季芒不同逆境脅迫處理樣品做基因差異顯示研究，設計引物，從中克隆了類黃酮磺基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid sulfotransferase）基因（MiST），類黃酮磺基轉(zhuǎn)移酶這一基因可能與芒果中的黃酮生物合成有關。余海霞等［30］根據(jù)芒果cDNA-SCoT差異顯示中發(fā)現(xiàn)的cDNA片段設計特異引物，通過運用RACE技術(shù)獲得了芒果MiNAC基因的全長cDNA序列，該基因參與芒果逆境脅迫的分子調(diào)控；張宇等［31］采用RTPCR和RACE技術(shù)順利從芒果的枝梢中分離出了芒果的肉桂酰輔酶-A還原酶基因（CCR），該基因參與木質(zhì)素生物合成，后又對此基因進行了生物信息學分析；Nakagawa等［32］從芒果中分離了與成花有關的基因FT-like和GA代謝相關的基因GA3-ox，MiFT被認為是芒果開花的關鍵基因，該基因的表達調(diào)控經(jīng)由GA代謝來實現(xiàn)；Ish-Shalom等［33］分離了乙烯受體基因ERS1，并命名為MiERS1，并指出MiERS1具有的特殊功能，調(diào)控小果的脫落。

1.4 菠蘿基因分離的研究

菠蘿（Ananas comosus Linn. Merr.）是鳳梨屬鳳梨科植物，多年生常綠草本，適應熱帶和亞熱帶氣候，明末清初傳入中國南方等地［34］。DNA克隆技術(shù)在菠蘿中的應用很廣泛，如菠蘿花發(fā)育相關基因的克隆、菠蘿果實發(fā)育相關基因的克隆、菠蘿抗逆相關基因的克隆等。馬均等［35，36］克隆并分析了菠蘿的體細胞胚發(fā)生類受體蛋白激酶（SERK）基因，該基因與早期的體胚誘導與形成有關，并將AcSERK2與AcSERK1進行了比較；王尉等［37］利用生物信息學分析已構(gòu)建的菠蘿果實不同發(fā)育時期的cDNA文庫，對未知基因序列重復同源性檢索、拼裝，用RT-PCR驗證目的基因的正確性，克隆了與菠蘿果實發(fā)育相關的RFD1基因；蔡元保等［38］利用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)，從菠蘿花中分離出了一個新的與菠蘿花器官發(fā)育和開花誘導過程中起重要作用的MADS-box基因，并分析了此基因在菠蘿果肉以及花器官的雌蕊、花瓣和萼片中的表達量；楊祥燕等［39］通過RT-PCR結(jié)合RACE方法從菠蘿幼苗中克隆獲得了一個新的菠蘿鋅指蛋白基因的cDNA全長，并命名為AcRCHY1；Lv等［40］分離了FT基因的全長，命名為AcFT基因，并分析了其表達差異；Raimbault等［41］從菠蘿的果肉中分離了天冬氨酸蛋白酶基因AcAP1，該基因與菠蘿的低溫脅迫有關。

1.5 荔枝基因分離的研究

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）原產(chǎn)于中國南部，是亞熱帶果樹，不耐儲藏，坐果期易落果，與香蕉、菠蘿、龍眼并稱“南國四大果品”。吳建陽等［42］用RT-PCR和RACE擴增技術(shù)相結(jié)合的方法克隆了ACO基因，首次從荔枝中分離得到的ACO基因命名為Lc-ACO1，該基因可能與荔枝幼果的脫落密切相關；丁峰等［43，44］用RT-PCR方法首次克隆得到荔枝AP1同源基因cDNA全長，第二次得到兩個荔枝FT同源基因cDNA全長，分別命名為LcFT1和LcFT2，LcAP1基因可能參與荔枝營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，花發(fā)育過程及營養(yǎng)生長調(diào)控過程，F(xiàn)T基因是長日照途徑中決定植物開花時間的關鍵基因，是一個重要的光周期途徑和春花途徑的整合因子；張靜等［45］從荔枝中分離出了一個與成熟衰老有關的誘導基因，命名為LcAsr，該基因作為缺水的保護性分子發(fā)揮著重要作用，有利于今后輔助研究采后荔枝果實失水的分子機理；王凌云等［46］利用RTPCR從荔枝組織中克隆了9個質(zhì)膜水孔蛋白基因（LcPIP）的cDNA全長序列，并研究了其組織特異性表達。

1.6 龍眼基因分離的研究

龍眼（Dimocarpus longan L.）屬于無患子科龍眼屬多年生木本植物，果實肉質(zhì)柔滑，沁口味甜，是我國具有重要經(jīng)濟價值與藥用價值的名特優(yōu)果樹。龍眼果實集中在八月到九月期間上市，由于其上市時間的過于集中，因此龍眼的生長調(diào)控相關基因的研究也便具有了重要意義。李慧華等［47，48］克隆了胚性愈傷組織ACO氧化酶基因，還克隆了龍眼的胚性愈傷組織生長素受體基因TIR1和生長素結(jié)合蛋白基因ABP1；孟珊等［49］從四季蜜龍眼中分離了LFY基因的啟動子，LFY基因與四季蜜的成花特性有關；陳虎等［50］克隆了龍眼咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶DLCCoAOMT基因，該基因可能參與低溫脅迫后植物的生理變化調(diào)控；Winterhagen等［51］從龍眼中分離了兩個和成花有關的DlFT1和DlFT2基因，并且還分離了DlAP1-1 和DlAP1-2基因，并做了進一步的分析。

1.7 椰子基因分離的研究

椰子（Cocos nucifera L.）棕櫚科椰子屬植物，原產(chǎn)于亞洲東南部、印度尼西亞至太平洋群島，是熱帶木本油料作物之一。具有極高的經(jīng)濟價值，全株各個部分都有重要用途。韓闖等［52］根據(jù)SOD基因保守序列進行PCR擴增，分離出了Cu·Zn-SOD基因片段，超氧化物歧化酶（SOD）催化超氧陰離子（O2-）發(fā)生歧化反應，該過程能夠?qū)Ｒ磺宄矬w內(nèi)的超氧陰離子；肖勇等［53］克隆了椰子的硫脂酶相關基因（Acyl-ACP）；張琳［54］克隆了椰子胚乳中WRI1-like類轉(zhuǎn)錄因子CoWRI1基因；Gao等［55］從椰子胚乳中分離出了CocoFAD基因，該基因與十六碳烯酸和十八碳烯酸的生物合成有關；Yuan等［56］從椰子的胚乳中分離出來了植物溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶LPAAT基因，并命名為CnLPAAT，CnLPAAT基因在Kennedy途徑中的第二步有著重要的催化作用，使酰基鏈從酯酰-CoA轉(zhuǎn)移到溶血磷脂酸（LPA）的sn-2位，后產(chǎn)生的磷脂酸可以進行脫磷反應合成三酰甘油（TAG）和進入磷脂合成途徑參與形成生物膜結(jié)構(gòu)［57］。

1.8 優(yōu)稀果樹基因分離的研究

優(yōu)稀果樹的栽培面積小，對優(yōu)稀果樹在基因分離方面的相關研究少，因此下面只做部分介紹。

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.），?？啤⒉ぬ}蜜屬常綠喬木，是熱帶果樹，也是世界上單果重量最重的水果。汪永保等［58］利用RACE技術(shù)從菠蘿蜜中分離出了β-半乳糖苷酶基因（β-GAL），并對其進行了生物信息學分析。近些年發(fā)現(xiàn)，該基因是與果實成熟與軟化有密切關系的糖苷酶類物質(zhì)。

番荔枝（Annona squamosa L.），是熱帶、亞熱帶水果，可鮮食，其根部可藥用，治療赤痢等病，營養(yǎng)價值頗高。番荔枝的花器官發(fā)育過程中牽涉到大量基因的表達和調(diào)控，其中AGAMOUS（AG）是C類MADS-box家族的轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)控雌蕊與雄蕊發(fā)育的功能，是控制花器官形成的一個重要的基因，劉鍇東等［59，60］通過試劑盒提取RNA運用RACE方法從番荔枝花器官中克隆出了AGAMOUS基因的全長序列，克隆了與花器官發(fā)育初期發(fā)揮重要作用的LEAFY基因。

蓮霧（Syzygium samarangense）是熱帶常綠果樹，果實成熟期從11月到翌年4月，是一種優(yōu)質(zhì)特色水果，營養(yǎng)價值非常高。韓繼成等［61］從蓮霧的基因組DNA中分離出了乙烯受體基因（osers）的保守片段，對蓮霧的保鮮貯藏有重要作用，可以用于今后進行蓮霧果實發(fā)育及采后保鮮儲藏等方面的研究。

枇杷（Eriobotrya japonica Thunb. Lindl）原產(chǎn)中國東南部，果肉香甜，且具有藥用價值。楊岑等［62］從枇杷中克隆和鑒定了8個新S-RNase基因，并根據(jù)分離的這8個基因進行了同源性的推導。

2 展望

隨著分子生物技術(shù)的不斷進步，人們對基因的認識越來越深刻，高通量測序技術(shù)的不斷改進與完善，擴大了熱帶果樹目的基因分離的研究范圍。目的基因的分離，有利于直接對其進行結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控等一系列問題的進一步研究?，F(xiàn)今，基因測序技術(shù)諸如RNA-seq等已經(jīng)廣泛地應用到了熱帶果樹植物（包括一些木本和草本果樹植物）特別是非模式生物中，使熱帶果樹的目的基因分離技術(shù)研究進入到了一個迅速發(fā)展的時期。高通量生物技術(shù)的快速發(fā)展及與多學科的融合，已經(jīng)可以運用系統(tǒng)生物學來揭示和闡明植物部分生理生化反應或代謝機制。轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學及代謝組學等方面研究，有望能夠更全面系統(tǒng)地揭示植物的各項生命活動分子機理，但這些系統(tǒng)研究還需進一步深化。技術(shù)的不斷普及與推廣，使分離完整目的基因序列的精度不斷提高，但仍存在著3個重要的問題：一是熱帶果樹目的基因的分離與克隆只能借鑒模式植物和大田作物，目前已經(jīng)成功克隆和分離的目的基因或片段絕大多數(shù)與果實的發(fā)育、成熟衰老過程有關；二是熱帶果樹目的基因的分離與克隆方法，與大田作物和模式植物對比分析不難看出，兩者存在著很大的差異性，因此會產(chǎn)生一些特殊情況，除少數(shù)草本水果外，大多數(shù)熱帶果樹為木本植物，受遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)的限制，使其在轉(zhuǎn)基因方面的研究相當困難，因此，應積極尋找適合熱帶木本果樹遺傳轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)的方法，使其逐漸形成一條有計劃的科學的系統(tǒng)研究體系；三是基因分離技術(shù)及方法各自有其優(yōu)點，但也存在著不可避免的缺陷，農(nóng)業(yè)科研人員應該根據(jù)自身的需要進行選擇，還可根據(jù)實際要求將多種技術(shù)進行有機的結(jié)合，如將SSH與cDNA芯片聯(lián)合使用等，是今后基因分離與克隆技術(shù)研究發(fā)展的方向所在。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Gene Isolation and Clone Technology of Tropical Fruit Tree

AN Na WU You-gen CHEN Ping
（Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources（Hainan University），Ministry of Education，College of Horticulture and Landscape Architecture, Hainan University，Haikou 570228）

Firstly, we summarized the isolations of the genes from several common tropical fruits’ genes（banana, papaya, mango, pineapple, litchi, etc.）by frequently used technologies of rapid-amplification of cDNA ends（RACE）and reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）, also the analyses and expressions of cloned target genes and fragments. Finally, we discussed the advantages and disadvantages of gene isolating and cloning technologies, and prospected the new gene isolating and cloning technologies, aiming at laying the foundation for studying tropical fruit tree and agriculture at biological level of genetic molecule.

tropical fruit tree；gene；isolation；clone

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.009

2016-06-22

國家自然科學基金項目（31560544），海南省自然科學基金項目（20153061），海南省高等學?？茖W研究項目（HNJG2014-05）

安娜，女，碩士研究生，研究方向：熱帶果樹與農(nóng)業(yè)生物技術(shù)；E-mail：960089206@qq.com

陳萍，女，博士，副教授，研究方向：熱帶果樹與農(nóng)業(yè)生物技術(shù)；E-mail：chenping199607@163.com