UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)快速鑒定瑤藥別旁茶提取物的化學(xué)成分

王鳳云，韓亮，宋雨鴻

(1.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣州市第一人民醫(yī)院 中醫(yī)科，廣東 廣州 510180)

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UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)快速鑒定瑤藥別旁茶提取物的化學(xué)成分

王鳳云1，韓亮1，宋雨鴻2

(1.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣州市第一人民醫(yī)院 中醫(yī)科，廣東 廣州 510180)

摘要:目的 采用UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)快速分析和鑒定瑤藥別旁茶的化學(xué)成分。方法 采用AQUITY UPLC/Q-TOF micro聯(lián)用儀，以0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，ESI正負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，以Masslynx4.1軟件分析數(shù)據(jù)，根據(jù)正、負(fù)離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)及元素組成分析，結(jié)合對(duì)照品和相關(guān)文獻(xiàn)得出結(jié)果。結(jié)果 共檢測(cè)了29個(gè)色譜峰，鑒定了其中的26個(gè)化合物。結(jié)論 UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)分析可獲得別旁茶中各類化學(xué)成分豐富的結(jié)構(gòu)信息，為這些化學(xué)成分的鑒定提供了一種快速有效的方法，為闡明別旁茶的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了有力依據(jù)。

關(guān)鍵詞:別旁茶； UPLC/Q-TOF-MS； 化學(xué)成分

扭肚藤為木犀科素馨屬植物扭肚藤Jasminumelongatum(Bergius) Willd.的干燥嫩莖及葉，瑤名別旁茶。因其善于治療濕熱腹痛瀉痢，故名扭肚藤；又因?yàn)槠浠榘咨?，形似素馨花，故又名為白花茶、假素馨。扭肚藤具有清熱利濕的作用，瑤族常用于治療濕熱腹痛、腸炎、痢疾、四肢麻痹腫痛、瘰癘、疥瘡，外用可以用于跌打骨折和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[1]。目前對(duì)扭肚藤的研究報(bào)道較少，化學(xué)成分所知甚少，國(guó)內(nèi)有報(bào)道采用HPLC法測(cè)定扭肚藤中東莨菪內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[2]，還有分別對(duì)復(fù)方扭肚藤片和腹可安片中的扭肚藤相關(guān)成分進(jìn)行研究的報(bào)道[3-4]；但是絕大部分的化學(xué)成分仍是未知的。為了明確別旁茶的活性成分并闡述該藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，有必要開展其化學(xué)成分研究。

超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的分離技術(shù)，具有超高壓、超高靈敏度、超高分離度等特點(diǎn)，在中藥等復(fù)雜體系的分離分析上具有明顯優(yōu)勢(shì)。飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q-TOF-MS)是高分辨串聯(lián)質(zhì)譜，其顯著特點(diǎn)是高靈敏度、高選擇性，能得到高質(zhì)量的質(zhì)譜圖和化合物的精確分子量；因此， UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)已成為目前中藥復(fù)雜體系中活性成分的快速分離和鑒定的有力手段。本試驗(yàn)首次應(yīng)用UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)，對(duì)瑤藥別旁茶進(jìn)行了研究分析，根據(jù)色譜保留時(shí)間、精確分子量、準(zhǔn)分子離子、碎片離子和相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)主要色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推斷和鑒定，為全面分析別旁茶化學(xué)成分、闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和控制質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1儀器與試藥

超高效液相串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)，Waters Aqpuity uplc beh C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，數(shù)據(jù)采集采用Masslynx4.1軟件；KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，頻率45/80 kHz，功率500 W)，BT-224S萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，TGL-16C高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，SK-1快速混勻器(常州澳華儀器有限公司)，0.22 μm溶劑過(guò)濾器(天津津騰儀器廠)。

乙腈、甲酸(UPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司)，甲醇(HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司)，娃哈哈蒸餾水。

別旁茶(廣東和翔制藥有限公司，批號(hào)：20151124)，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院潘利明副教授鑒定為木犀科素馨屬植物扭肚藤Jasminumelongatum(Bergius) Willd.的干燥嫩莖及葉。對(duì)照品東莨菪內(nèi)酯(批號(hào)：110768-200504，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號(hào)：MB2122，大連美侖生物技術(shù)有限公司)，橄欖苦苷(批號(hào)：81345-57-9)、苜蓿素(批號(hào)：96575-10-5)購(gòu)自天津一方科技有限公司。

2方法、結(jié)果與分析

2.1供試品溶液的制備

取別旁茶藥材50 g，精密稱定。粉碎過(guò)40目篩，依次加入50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇10倍、8倍量冷凝回流提取各1 h，合并2次提取液，濾過(guò)。濾液減壓蒸餾至浸膏狀，用甲醇稀釋至50 mL，備用。溶液進(jìn)樣前15 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.2對(duì)照品溶液的制備

分別取東莨菪內(nèi)酯、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、橄欖苦苷和苜蓿素對(duì)照品粉末1 mg，精密稱定，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱為Waters acquitytm uplc beh C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫條件為0～3 min，5%A→13%A；3～10 min，13%A→30%A；10～15 min，30%A→45%A；15～28 min，45%A→95%A；28～29 min，95%A→100%A；柱溫為35 ℃；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓為3 000 V；錐孔電壓為30 V；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣體溫度為350 ℃；裂解能量CE(±)為15～25 V。脫溶劑(N2) 流速為600 L/h，錐孔反吹N2，流速為60 L/h；溶劑氣為N2；碰撞氣體為Ar。采用Lock mass通路對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采集進(jìn)行實(shí)時(shí)校正，Lock mass對(duì)照品溶液為腦腓肽(10 μg/mL)，校正切換頻率為10次/s。掃描范圍為100～1 500，檢測(cè)時(shí)間為20 min。ESI正負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)。

2.4UPLC/Q-TOF-MS成分鑒定

按“2.3”項(xiàng)下條件對(duì)供試品、對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，得到別旁茶的正、負(fù)基峰離子(BPI)色譜圖，如圖1所示。總離子流圖中檢測(cè)出的各個(gè)色譜峰經(jīng)Masslynx4.1軟件進(jìn)行了檢索，正離子模式下檢測(cè)離子主要以[M+H]+、[M+NH4]+為主；負(fù)離子模式下檢測(cè)離子主要以[M-H]-、[M+HCOO]-為主。按上述色譜條件測(cè)定，別旁茶中不同極性化合物得到了較好分離。

96-4100-0強(qiáng)度/%10121416182022242468t/minAB

圖1別旁茶負(fù)(A)、正(B)離子模式下的UPLC/Q-TOF-MS總離子流圖

Figure 1BPI chromatograms of (-) ESI-MS mode (A) and (+) ESI-MS mode (B) ofJ.elongatum.

圖1總離子流圖中的29種成分的鑒別結(jié)果如表1所示。根據(jù)Masslynx4.1工作站給出的精確分子量、可能的分子式、二級(jí)質(zhì)譜碎片數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)，以及應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)資源scifinder及chemspider數(shù)據(jù)庫(kù)檢索數(shù)據(jù)，從別旁茶中共檢測(cè)分析出26種成分。除已知的東莨菪內(nèi)酯和3個(gè)未鑒別的成分外，其余成分均首次在別旁茶中被發(fā)現(xiàn)。主要包括環(huán)烯醚萜苷類成分，如峰1、10、11、14、15、17、18、22、23、27、29共11種，黃酮及其黃酮苷類成分，如峰5、20、21、23共4種，木脂素類成分，如峰6、7、13共3種，內(nèi)酯類成分，如峰4、16、19共3種，咖啡酸葡萄糖苷酯類成分，如峰8、9共2種，有機(jī)酸類成分，如峰2、25共2種，生物堿類成分，如峰24等。

表1　別旁茶化學(xué)成分的UPLC/Q-TOF-MS鑒定結(jié)果

續(xù)表1

2.5別旁茶中環(huán)烯醚萜苷類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律探討

從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，環(huán)烯醚萜苷類成分是別旁茶的主要活性成分，采用UPLC-MS/MS對(duì)這類成分進(jìn)行分析表征，探討其質(zhì)譜裂解規(guī)律，闡明其主要碎片離子的形成過(guò)程，對(duì)別旁茶中新的化合物的預(yù)測(cè)與發(fā)現(xiàn)有重要意義。峰10、18在正負(fù)離子模式下均有較高的響應(yīng)，圖2、圖3分別為峰10和峰18的質(zhì)譜分析圖，二者分別鑒定為橄欖苦苷和jasminoside。

100-0100-0100-0強(qiáng)度/%BACESI(-)ESI(-)ESI(+)100140180220260300340380420460500540580m/z

圖2峰10在ESI(+)和(-)模式下的二級(jí)(A)和一級(jí)(B、C)質(zhì)譜圖

Figure 2MS2data (A) and MS data (B,C) of positive and nagative ESI-MS modes of No.10

100-0100-0100-0強(qiáng)度/%BACESI(-)ESI(-)ESI(+)100140180220260300340380420460500540580m/z

圖3峰18在ESI(+)和(-)模式下的二級(jí)(A)和一級(jí)(B、C)質(zhì)譜圖

Figure 3MS2data (A) and MS data (B,C) of positive and nagative ESI-MS modes of No.18

峰10和峰18是環(huán)烯醚萜苷類成分的典型代表，二者質(zhì)譜裂解途徑相似，僅豐度上稍有差別，根據(jù)其質(zhì)譜分析圖推測(cè)二者可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖4～圖5。

通過(guò)峰10和峰18的質(zhì)譜裂解途徑，推斷環(huán)烯醚萜苷類成分首先脫去1位的葡萄糖或葡萄糖苷，隨著碎裂電壓的增大，而后脫去側(cè)鏈基團(tuán)如C9H9O2或C8H9O3，最后再丟失連接在母核的—CO2、—CH3或—OH等基團(tuán)。這為后期發(fā)現(xiàn)更多類型的環(huán)烯醚萜苷類成分奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖4　峰10的質(zhì)譜裂解途徑

圖5峰18的質(zhì)譜裂解途徑

Figure 5The mass spectrometry fragmentation pathways of peak No.18

3結(jié)論

本研究建立了別旁茶的UPLC/Q-TOF-MS分析方法，在正負(fù)離子模式下別旁茶的化學(xué)成分得到快速的分離和鑒定。運(yùn)用UPLC/Q-TOF-MS的數(shù)據(jù)庫(kù)匹配技術(shù)和相關(guān)文獻(xiàn)，共檢測(cè)到29種化學(xué)成分，并鑒定了其中的26種，包括環(huán)烯醚萜苷類成分11種，黃酮及黃酮苷類成分4種、木脂素類成分3種和內(nèi)酯類成分3種等，其中包括橄欖苦苷和jasminoside在內(nèi)的25種化學(xué)成分為首次從別旁茶中發(fā)現(xiàn)。本研究較為全面地分析和鑒定了別旁茶中的化學(xué)成分，為深入研究其藥理作用、尋找其藥效活性成分，進(jìn)而更好地開發(fā)應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的依據(jù)和前期研究基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：劉曉涵)

UPLC/Q-TOF-MS based rapid analysis and identification of chemical composition ofJasminumelongatum(Bergius) Willd.

WANG Fengyun1，HAN Liang1， SONG Yuhong2

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.GuangzhouFirstMunicipalPeople'sHospital,Guangzhou510180，China)

Abstract:Objective To make a qualitative analysis on chemical components in Jasminum elongatum (Bergius) Willd. by UPLC/Q-TOF-MS. Methods AQUITY UPLC/Q-TOF micro system was employed with gradient elution of 0.1% formic acid-methyl cyanides as the mobile phase under the ESI positive and negative modes. Data was analyzed by masslynx 4.1 software. Results 29 peaks were profiled and 26 compounds of J. elongatum were identified by UPLC-MS. Conclusion It provided an accurate and fast method to identify the main components from J. elongatum,as well as powerful support for clarifying the element composition.

Key words:Jasminum elongatum (Bergius) Willd.; UPLC/Q-TOF-MS; chemical components

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015122001

中圖分類號(hào):R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):1006-8783(2016)01-0055-06

作者簡(jiǎn)介：王鳳云(1979—)，女，博士，從事中藥資源開發(fā)及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，電話：020-39352182，Email:wfycn2000@163.com；通信作者：宋雨鴻(1981—)，男，博士，副主任醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合消化疾病治療，Email：562832197@qq.com。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81503352)

收稿日期：2015-12-20

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-19 16:01網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160119.1601.002.html