鐵皮石斛堿溶性和水溶性多糖的比較研究

黃凱偉，嚴(yán)慕賢，李運(yùn)容，陶盛昌，吳成鳳，柯漢女，魏剛，黃月純

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.佛山市中醫(yī)院 廣東 佛山，528000； 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510006)

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鐵皮石斛堿溶性和水溶性多糖的比較研究

黃凱偉1，嚴(yán)慕賢2，李運(yùn)容1，陶盛昌1，吳成鳳1，柯漢女1，魏剛1，黃月純3

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.佛山市中醫(yī)院 廣東 佛山，528000； 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 建立鮮鐵皮石斛的堿溶性和水溶性多糖柱前衍生HPLC特征圖譜，并初步比較其單糖組成及活性的差異。方法 采用高效液相色譜法測定，比較鐵皮石斛2種多糖的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)-HPLC特征圖譜、單糖的組成、相似度。應(yīng)用WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(WST-1法)測定2種多糖的抗氧化活性，根據(jù)其清除羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)的能力，評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果 鐵皮石斛水溶性多糖的單糖組成以D-甘露糖和D-葡萄糖為主；堿溶性多糖的單糖組成以D-甘露糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-木糖為主。生物活性初步研究表明鐵皮石斛堿溶性多糖和水溶性多糖均具有一定的抑制Hela細(xì)胞增殖的作用。鐵皮石斛堿溶性多糖清除羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)的能力均強(qiáng)于水溶性多糖。結(jié)論 鐵皮石斛堿溶性和水溶性多糖的特征圖譜、生物活性均有差異，而引起兩者活性差異的原因可能跟單糖組成有關(guān)。

關(guān)鍵詞:鐵皮石斛； 堿溶性多糖； 水溶性多糖； 指紋圖譜； 生物活性

堿溶性多糖，是一種含有酸性基團(tuán)(主要是糖醛酸、硫酸根)的多糖，又稱酸性多糖，跟水溶性多糖一樣，有來源廣泛、副作用小等特點(diǎn)，除了含酸性基團(tuán)外，可能還含有中性單糖或堿性單糖[1]，而堿溶性多糖中酸性基團(tuán)的比例、酸度目前均無明確規(guī)定[2]?，F(xiàn)代研究表明硫酸根和糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)跟多糖活性有一定相關(guān)性，含酸性基團(tuán)的堿溶性多糖具有較強(qiáng)的抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等生物活性[3-4]，其結(jié)構(gòu)、生物活性、構(gòu)效關(guān)系為現(xiàn)代研究熱點(diǎn)。

2015年版《中國藥典》將鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo獨(dú)立建立品系[5]，可見其藥用價(jià)值高。現(xiàn)代研究表明，鐵皮石斛含多糖、鐵皮石斛素、氨基酸、菲類、酚類等成分[6]，其中多糖是鐵皮石斛主要成分，在提高人體免疫能力、抗衰老、抗腫瘤、補(bǔ)五臟虛勞、改善糖尿病癥狀和治療萎縮性胃炎等方面發(fā)揮重要作用[7]。然而，現(xiàn)代很多關(guān)于鐵皮石斛多糖的研究僅局限于水溶性多糖，對(duì)堿溶性多糖研究則較少。

本研究比較了鐵皮石斛堿溶性多糖和水溶性多糖的PMP-HPLC特征圖譜，并對(duì)2種多糖的活性進(jìn)行探討，進(jìn)一步分析2種多糖的特征異同點(diǎn)，為鐵皮石斛多糖的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1儀器、材料與試劑

LC-20AT(DAD)型高效液相色譜儀(日本島津公司)；TU1810型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；AB204-N型分析天平(德國sartorius公司)；iMark型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad 公司)。

鐵皮石斛藥材來源見表1，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)魏剛研究員鑒定為蘭科植物鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)。D-甘露糖(批號(hào)：140671-201303)、D-葡萄糖(批號(hào)：110873-201406)、D-半乳糖(批號(hào)：100221-201507)均購自中國藥品生物制品檢定所；L-巖藻糖(批號(hào)：120927)、D-半乳糖醛酸(批號(hào)：121206)、D-木糖(批號(hào)：121126)、D-核糖(批號(hào)：121202)、D-阿拉伯糖(批號(hào)：121203)均購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。乙腈為色譜純(批號(hào)：JA030130，德國Merk公司)；其他試劑均為分析純。

人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)：8115054)、胰蛋白酶(批號(hào)：8083652)、WST-1試劑盒(批號(hào)：C0035)購自碧云天生物技術(shù)研究所；H2O2(批號(hào)：20140609)與FeSO4(批號(hào)：20140321)均購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

表1　10批鐵皮石斛藥材的來源

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5C18柱(250 mm×4.6 mm，E59382)；流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol/L的乙酸銨溶液(冰乙酸調(diào)pH=6.7)；A(乙腈)-B(0.02 mol/L乙酸銨)梯度洗脫，0～18 min，83.2%B；18～18.2 min，83.2%B→88%B；18.2～22 min，88%B；22～23 min，88%B→78%B；23～25 min，78%B；25～26 min，78%B →80%B；26～42 min，80%B；42～45 min，80%B→70%B；45～60 min，70% ；流速：1 mL/min；檢測波長：250 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2供試品溶液的制備

2.2.1水溶性粗多糖溶液的制備取鐵皮石斛粉末0.5 g，精密稱定，依次用80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、石油醚超聲處理1 h，濾過，重復(fù)2～3次，濾渣烘干。加100 mL蒸餾水煎煮1 h，趁熱抽濾，殘?jiān)脽崴礈?次，重復(fù)煎煮數(shù)次，合并濾液與洗液，濃縮至10 mL，濾渣保留。濾液加4倍無水乙醇沉淀(慢加快攪)，置冰箱中放置過夜，離心10 min，棄上清液，沉淀烘干，熱水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得水溶性粗多糖溶液。

2.2.2堿溶性粗多糖溶液的制備取“2.2.1”項(xiàng)下濾渣加入0.5 mol/L的NaOH溶液100 mL冷浸過夜，翌日熱回流提取1 h，濾過，重復(fù)多次，合并濾液，HCl中和，濃縮至10 mL，加4倍無水乙醇沉淀，置冰箱中放置過夜，離心，棄上清液，沉淀分別加80%乙醇、無水乙醇洗滌2次，每次10 mL，離心，棄上清液，沉淀熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，放冷，加H2O至刻度，搖勻，即得堿溶性粗多糖溶液。

2.2.3粗多糖水解溶液的制備分別精密吸取上述水溶性粗多糖和堿溶性粗多糖溶液各1 mL，分別置于5 mL安瓿瓶中，精密加入3 mol/L HCl溶液0.5 mL，密封，110 ℃水解1 h，取出，放冷，加入3 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，分別得水溶性粗多糖水解溶液、堿溶性粗多糖水解溶液。

2.2.4PMP衍生化方法分別取水解多糖溶液、單糖對(duì)照品溶液(0.45 mg/mL)或者混合單糖對(duì)照品溶液(0.45 mg/mL)400 μL，分別置于5 mL的離心管中，精密加入0.3 mol/L NaOH溶液400 μL和0.5 mol/L的PMP甲醇溶液250 μL，混勻，在70 ℃條件下衍生反應(yīng)100 min，取出放冷后加入0.3 mol/L的HCl溶液450 μL，渦旋混勻。加入三氯甲烷2 mL，渦旋混勻，離心，棄三氯甲烷層，重復(fù)加入三氯甲烷萃取3次，至三氯甲烷層無顏色，水層即為供試品溶液。水溶性粗多糖水解溶液、堿溶性粗多糖水解溶液、單糖對(duì)照品溶液、混合單糖對(duì)照品溶液PMP衍生化后所得供試品溶液分別命名為供試品溶液a、b、c、d。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗(yàn)精密吸取由S1制得的供試品溶液b 10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下方法測定，結(jié)果所測得的指紋圖譜與所得共有模式的相似度均大于0.999，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD<5%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD<3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取由S1制得的供試品溶液b 10 μL，分別在制備0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下方法測定，結(jié)果所測得的指紋圖譜與所得共有模式的相似度均大于0.997，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD<5%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD<3.0%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品(S1) 0.5 g，共6份，精密稱定，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測定，結(jié)果所測的指紋圖譜與所得共有模式的相似度均大于0.995，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD<5%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD<3.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4不同產(chǎn)地的鐵皮石斛水溶性多糖和堿溶性多糖PMP-HPLC特征圖譜的分析

2.4.1混合單糖對(duì)照品的PMP-HPLC分析精密吸取由混合單糖對(duì)照品制得的供試品溶液d 10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，混合單糖分離度良好，所得色譜圖見圖1。

80.7911.6823.1934.7945.3857.9807654321t/minmAU

1.D-甘露糖； 2.L-鼠李糖； 3.D-半乳糖醛酸； 4.D-葡萄糖； 5.D-半乳糖； 6.D-木糖； 7.L-巖藻糖。

圖1混合單糖對(duì)照品的PMP-HPLC色譜圖

Figure 1PMP-HPLC chromatogram of mixed monosaccharides references

2.4.2共有峰的確定及相似度的分析采用國家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)，以均值法生成指紋圖譜共有模式，對(duì)10批鐵皮石斛的水溶性多糖PMP-HPLC指紋圖譜進(jìn)行特征圖譜分析(見圖2)，結(jié)果標(biāo)定2個(gè)共有特征峰，經(jīng)對(duì)照品保留時(shí)間定位鑒別為D-甘露糖和D-葡萄糖。以共有模式為對(duì)照分析樣品相似度，S1～S10 10批樣品的相似度分別是0.990、1.000、0.997、0.997、0.984、0.999、0.992、0.995、0.997、0.990。10批鐵皮石斛的相似度除S5(0.984)以外，均≥0.990，提示10批樣品的水溶性多糖的單糖組成較穩(wěn)定。

將10批鐵皮石斛的堿溶性多糖的特征圖譜導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)，見圖3。結(jié)果標(biāo)定5個(gè)共有特征峰，經(jīng)對(duì)照品保留時(shí)間定位分別鑒別為D-甘露糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖。但是10批樣品與共有模式相似度較低(0.399～0.920)，表明10批鐵皮石斛藥材的堿溶性多糖存在差異；推測可能為S1、S2、S3、S4、S5、S6的D-葡萄糖(峰3)比較高所導(dǎo)致。于是把10批鐵皮石斛的堿溶性多糖分為2組(批次S1、S2、S3、S4、S5、S6為A組，批次S7、S8、S9、S10為B組)，分組后再分別進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)分析，S1、S2、S3、S4、S5、S6與A組共有模式的相似度分別為0.958、0.935、0.927、0.954、0.923、0.958，S7、S8、S9、S10與B組共有模式的相似度分別為0.996、0.992、0.966、0.935；A、B組內(nèi)堿溶性多糖供試品液圖譜相似度分別高于0.923和0.935，表明2個(gè)組內(nèi)各鐵皮石斛的多糖質(zhì)量相近。

2111.6823.1934.7945.3857.980t/min621.09465.42309.75154.08-1.59S10S9S8S7S6S5S4S3S2S1mAU

1.D-甘露糖； 2.D-葡萄糖。

圖2 10批鐵皮石斛水溶性多糖的PMP-HPLC特征圖譜

Figure 2 HPLC overlapping fingerprints of water-soluble polysaccharides from ten batches ofD.officinale

11.6823.1934.7945.3857.980t/minS1S2S3S4S5S6S7S8S9S101955.531466.48977.42488.37-0.69mAU54321

1.D-甘露糖； 2.D-半乳糖醛酸； 3.D-葡萄糖； 4.D-半乳糖；5.D-木糖。

圖310批鐵皮石斛堿溶性多糖的PMP-HPLC特征圖譜

Figure 3HPLC overlapping fingerprints of alkali-soluble polysaccharides from ten batches ofD.officinale

2.5多糖對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用[8]

將對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞(細(xì)胞代數(shù)5-9)懸液接種于96孔培養(yǎng)板中(100 μL/孔)，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后按要求加入不同質(zhì)量濃度鐵皮石斛(S1)水溶性和堿溶性多糖100 μL/孔；同時(shí)設(shè)溶劑培養(yǎng)液為對(duì)照孔(空白組)，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，試驗(yàn)終止前4 h每孔加入5 mg/mL的WST-1溶液20 μL，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h；振蕩1 min，酶標(biāo)儀490 nm波長下測定吸光度值。求平均值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(D對(duì)照組-D實(shí)驗(yàn)組)/(D對(duì)照組-D空白組)×100%。見表2。

表2鐵皮石斛堿溶性多糖和水溶性多糖對(duì)Hela細(xì)胞生長的影響

Table 2The effect of alkali-soluble and water-soluble polysac-charides fromD.officinaleon the growth of Hela cells

ρ/(mg·mL-1)吸光度水溶性多糖堿溶性多糖抑制率/%水溶性多糖堿溶性多糖0.10.692±0.0280.528±0.010-20.2733.780.20.694±0.0330.597±0.018-10.5415.140.30.693±0.0330.622±0.017-11.088.380.40.681±0.0230.636±0.019-10.814.590.50.669±0.0150.64±0.022-7.573.510.60.643±0.0130.669±0.012-4.32-4.320.70.618±0.0240.67±0.0172.70-4.590.80.606±0.0290.674±0.0189.46-5.680.90.581±0.0210.706±0.02112.70-14.32

鐵皮石斛水溶性多糖溶液在低質(zhì)量濃度(0.1～0.6 mg/mL)時(shí)對(duì)Hela細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用，推測當(dāng)鐵皮石斛水溶性多糖質(zhì)量濃度為0.1～0.6 mg/mL時(shí)，能部分被Hela細(xì)胞吸收、利用，促進(jìn)其快速分裂生長。而當(dāng)多糖溶液質(zhì)量濃度≥0.7 mg/mL時(shí)，Hela細(xì)胞分裂、生長速度開始減慢，細(xì)胞生長受到了一定的抑制作用，質(zhì)量濃度越大，抑制作用越明顯，抑制率達(dá)到12.70%。

鐵皮石斛堿溶性多糖溶液與水溶性多糖溶液的測定結(jié)果有所不同，當(dāng)多糖溶液質(zhì)量濃度較低(0.1～0.5 mg/mL)時(shí)，Hela細(xì)胞分裂、生長速度減慢，細(xì)胞生長受到了一定的抑制作用，質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的效果最好，抑制率達(dá)到33.78%。當(dāng)鐵皮石斛堿溶性多糖溶液質(zhì)量濃度≥0.6 mg/mL時(shí)，Hela細(xì)胞開始有所增長。

2.6體外抗氧化活性的比較

文獻(xiàn)[9-10]試驗(yàn)同一質(zhì)量濃度(2 mg/mL)的鐵皮石斛水溶性多糖、堿溶性多糖溶液清除H2O2/Fe2+產(chǎn)生的·OH、H2O2的能力，比較二者的抗氧化活性。結(jié)果見表3。

表3鐵皮石斛堿溶性多糖和水溶性多糖的抗氧化活性比較

多糖類別清除率/%·OHH2O2水溶性多糖69.40±0.5818.69±0.83堿溶性多糖113.43±0.2537.09±0.62

由上可知，鐵皮石斛堿溶性多糖清除·OH、H2O2的能力均強(qiáng)于水溶性多糖，說明堿溶性多糖的抗氧化活性優(yōu)于水溶性多糖。

3討論

2015年版《中國藥典》規(guī)定鐵皮石斛的水溶性多糖中的單糖組分，甘露糖與葡萄糖的峰面積之比需在2.4～8.0之間[5]， 本文10批鐵皮石斛的水溶性多糖甘露糖與葡萄糖峰面積比值在3.026～7.181間，說明收集的樣品符合藥典要求。本文結(jié)果表明，鐵皮石斛水溶性多糖和堿溶性多糖的單糖組分及單糖的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所不同，水溶性多糖主要含甘露糖和葡萄糖，且甘露糖的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于葡萄糖；而堿溶性多糖含有甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖，且堿溶性多糖中的各單糖相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨產(chǎn)地的不同而變化，規(guī)律性較差。

本研究初步測定了鐵皮石斛的堿溶性多糖和水溶性多糖對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用和體外抗氧化活性，結(jié)果表明2種多糖均具有一定的抑制Hela細(xì)胞增殖和抗氧化的作用，且堿溶性多糖的活性優(yōu)于水溶性多糖。

大量文獻(xiàn)報(bào)道酸性基團(tuán)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)跟多糖的藥效密切聯(lián)系，含有硫酸根、糖醛酸的多糖具有較強(qiáng)的抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等生物活性[3-4，11-12]。為了探討2種多糖藥效存在差異的緣由，本研究還測定了2種多糖中糖醛酸和硫酸根的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明鐵皮石斛水溶性多糖和堿溶性多糖的硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)差別不大(分別是1.03%和1.04%)，但堿溶性多糖糖醛酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則高于水溶性多糖(分別是7.10%和5.95%)。因此，推測2種多糖生物活性差異的原因可能跟糖醛酸和單糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定的相關(guān)性。但多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)特征對(duì)活性有很大的影響，因此，鐵皮石斛堿溶性多糖的具體結(jié)構(gòu)特征以及結(jié)構(gòu)與生物活性之間的構(gòu)效關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：劉曉涵)

Comparison between alkali-soluble and water-soluble polysaccharides fromDendrobiumofficinale

HUANG Kaiwei1,YAN Muxian2,LI Yunrong1,TAO Shengchang1,WU Chengfeng1,KE Hannyu1,WEI Gang1,HUANG Yuechun3

(1.SchoolofChineseHerbalMedicine,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 2.FoshanHospitalofTraditionalChineseMedicine,Foshan528000,China; 3.TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To establish the HPLC characteristic spectra of water-soluble and alkali-soluble polysaccharides from D. officinale and analyze the difference of the monosaccharide composition and bioactivity. Methods The PMP-HPLC fingerprints of both polysaccharides were established,then the difference of their spectra,monosaccharide composition and similarity were analyzed. The WST-1 method was used to evaluate the anti-tumor activity of polysaccharides. The antioxidant activity of polysaccharides were evaluated according to the ability of clearing ·OH and H2O2. Results The water-soluble polysaccharides were mainly composed of D-mannose and D-glucose,while alkali-soluble polysaccharides contained D-mannose,galacturonic acid,D-glucose,D-galactose and D-xylose. The bioactivity studies demonstrated that both alkali-soluble and water-soluble polysaccharides could inhibit the proliferation of Hela cells. However,the antioxidant activities of alkali-soluble polysaccharides were more significant than the water-soluble polysaccharides. Conclusion There are differences between alkali-soluble and water-soluble polysaccharides on the characteristic spectra and activities,which may be caused by the different monosaccharides compositions.

Key words:Dendrobium officinale; alkali-soluble polysaccharides; water-soluble polysaccharides; fingerprint chromatogram; bioactivity

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015101901

中圖分類號(hào):R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):1006-8783(2016)01-0046-05

作者簡介：黃凱偉(1990—)，男，2013級(jí)碩士研究生，從事中藥新藥研究與指紋圖譜分析研究，電話：020-39358519，Email： huangkaiweifeng@163.com；通信作者：魏剛(1969—)，研究員，博士生導(dǎo)師，從事中藥新藥研究與指紋圖譜分析研究，Email：weigang021@163.com。

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B060400022)

收稿日期：2015-10-19

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-15 18:29網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1829.008.html