鏈格孢變應(yīng)原皮試液用于鏈格孢變態(tài)反應(yīng)性疾病診斷的有效性和安全性

王瑞琦，王良錄，李　宏，孫勁旅，文利平，顧建青，關(guān)　凱，尹　佳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，北京 100730)

鏈格孢(Alternariaalternata)屬半知菌亞門、絲孢菌綱、絲孢菌目、暗色孢科、鏈格孢屬，其孢子可在空氣中廣泛播散，是我國常見的致敏真菌。真菌變態(tài)反應(yīng)的患病率與地理及氣候條件相關(guān)，在某些地區(qū)可高達30%[1]，但鏈格孢引起變態(tài)反應(yīng)性疾病的患病率目前尚不清楚。Mari等[2]對4962例呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病患者的調(diào)查結(jié)果顯示，19%的患者對一種或多種真菌變應(yīng)原皮膚試驗陽性，真菌變應(yīng)原皮膚試驗陽性患者中66%對鏈格孢皮試陽性。岳鳳敏等[3]對28種常見氣傳真菌致敏性分析結(jié)果顯示，200例真菌變態(tài)反應(yīng)患者中105例鏈格孢皮內(nèi)試驗陽性(52.5%)。國外研究結(jié)果顯示，應(yīng)用鏈格孢進行免疫治療，可有效緩解鏈格孢變態(tài)反應(yīng)患者的鼻炎及哮喘癥狀[4]。

鏈格孢變應(yīng)原注射原液(Alternariaalternataextract)是進行鏈格孢皮內(nèi)試驗和免疫治療的基礎(chǔ)制劑，北京協(xié)和醫(yī)院研制的鏈格孢變應(yīng)原注射原液已在臨床安全應(yīng)用逾50年，本研究用鏈格孢變應(yīng)原注射原液1∶100稀釋液對受試者做皮內(nèi)試驗，分別以變態(tài)反應(yīng)?？漆t(yī)生臨床綜合診斷和血清特異性IgE(specific IgE，sIgE)檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)和相對金標(biāo)準(zhǔn)，回顧性評價該皮內(nèi)試驗用于診斷鏈格孢變態(tài)反應(yīng)的有效性及安全性。

材料和方法

病例選擇

入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)受試者年齡為4～75歲(含4歲和75歲)，男女不限；(2)2009年4月至2010年8月在北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科就診者；(3)于入選當(dāng)天已在北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科完成20種常規(guī)吸入變應(yīng)原皮內(nèi)試驗者；(4)于入選當(dāng)天已在北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科用Thermo Fisher公司Immuno CAP?系統(tǒng)完成至少一種吸入變應(yīng)原血清sIgE檢測者；(5)已簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)僅有吸入變應(yīng)原皮內(nèi)試驗結(jié)果；(2)僅有變應(yīng)原血清sIgE試驗結(jié)果；(3)使用非Thermo Fisher公司Immuno CAP?系統(tǒng)檢測血清sIgE；(4)在進行皮膚試驗前3 d內(nèi)曾口服短效抗組胺藥物或3周內(nèi)口服長效抗組胺藥物；(5)有嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)性疾病史者；(6)有皮膚劃痕征者；(7)做皮內(nèi)試驗時正患或2周內(nèi)曾患皮膚濕疹、皮膚感染、皮炎或外傷者；(8)試驗前1 d內(nèi)口服超過相當(dāng)于潑尼松10 mgd劑量的糖皮質(zhì)激素者；(9)試驗前1 d內(nèi)在將進行皮膚試驗的上臂部使用糖皮質(zhì)激素油膏者；(10)4周內(nèi)服用全身糖皮質(zhì)激素者；(11)有嚴(yán)重影響全身狀態(tài)的疾病者；(12)處在變態(tài)反應(yīng)性疾病急性發(fā)作期者，如變應(yīng)性哮喘；(13)有腎上腺素禁忌證者；(14)妊娠期及哺乳期婦女；(15)研究者認(rèn)為不適合參加試驗的其他情況。

剔除標(biāo)準(zhǔn)：(1)皮膚試驗中陽性對照為陰性或陰性對照為陽性結(jié)果者；(2)無任何記錄者。

觀察方法

2009年4月10日至2010年8月10日在北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科就診并已完成20種常規(guī)吸入變應(yīng)原(包括鏈格孢)皮內(nèi)試驗和至少1種吸入變應(yīng)原(包括鏈格孢)血清sIgE檢測的患者至少1000例。對其鏈格孢皮內(nèi)試驗和血清sIgE結(jié)果進行登記，由登記的變態(tài)反應(yīng)?？漆t(yī)生做出臨床綜合診斷(以患者病史、癥狀、體征結(jié)合鏈格孢血清sIgE結(jié)果綜合判斷)。登記入組當(dāng)天詳細詢問患者在完成皮內(nèi)試驗之后是否出現(xiàn)不良反應(yīng)。

分別以變態(tài)反應(yīng)?？漆t(yī)生臨床綜合診斷作金標(biāo)準(zhǔn)，以血清sIgE檢測結(jié)果作相對金標(biāo)準(zhǔn)，評價鏈格孢變應(yīng)原注射原液1∶100稀釋液皮內(nèi)試驗的靈敏度、特異度、陽性預(yù)期值和陰性預(yù)期值。

分析不良反應(yīng)發(fā)生情況，對鏈格孢變應(yīng)原注射原液1∶100稀釋液用于皮內(nèi)試驗的安全性進行評價。

皮內(nèi)試驗方法

鏈格孢變應(yīng)原注射原液及陽性對照液均由新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限公司提供，其中鏈格孢變應(yīng)原注射原液濃度為1∶20(WV)，陽性對照液分別為0.1 mgml和0.01 mgml磷酸組胺[5]。陰性對照液為變應(yīng)原溶媒，由山西太原制藥廠生產(chǎn)。進行皮內(nèi)試驗前，將鏈格孢變應(yīng)原注射原液與變應(yīng)原溶媒按1∶100新鮮配制成皮試液，2～8℃避光保存，有效期4周。所有皮內(nèi)試驗由5位有經(jīng)驗的護士完成。皮內(nèi)試驗方法和結(jié)果判讀詳見參考文獻[6]，陰性者以“-”表示，陽性者依反應(yīng)程度輕重分為4級，分別以“+”“++”“+++”“++++”表示。

血清sIgE檢測

采用Thermo Fisher公司Immuno CAP?系統(tǒng)(熒光酶聯(lián)免疫法)檢測。血清sIgE<0.35 kUAL(0級)者為陰性，血清sIgE≥0.35 kUAL者為陽性，依sIgE含量高低又可分為6級，即1級(≥0.35且<0.7 kUAL)，2級(≥0.7且<3.5 kUAL)，3級(≥3.5且<17.5 kUAL)，4級(≥17.5且<50 kUAL)，5級(≥50且<100 kUAL)，6級(≥100 kUAL)。

不良反應(yīng)分類

局部不良反應(yīng)：變應(yīng)原皮內(nèi)試驗后，局部出現(xiàn)風(fēng)團和紅暈，此為正常的陽性反應(yīng)，但若風(fēng)團和紅暈反應(yīng)過大(風(fēng)團直徑大于40 mm)，應(yīng)視為局部不良反應(yīng)。皮膚試驗5～6 h后在注射局部可出現(xiàn)遲發(fā)相反應(yīng)，輕者24 h可消退，重者則需2～3 d至1周方可逐漸消退，遲發(fā)相反應(yīng)也應(yīng)視為局部不良反應(yīng)。

全身不良反應(yīng)：指皮內(nèi)試驗后在注射處以外的組織和(或)器官出現(xiàn)癥狀[7-8]。輕度全身反應(yīng)可表現(xiàn)為變態(tài)反應(yīng)性鼻結(jié)膜炎癥狀，如噴嚏、流涕、眼癢、結(jié)膜腫脹等；中度全身反應(yīng)可表現(xiàn)為在出現(xiàn)局部不良反應(yīng)的同時，伴有急性蕁麻疹或血管性水腫，亦可表現(xiàn)為干咳、胸悶、憋氣和哮喘發(fā)作；重度全身反應(yīng)表現(xiàn)為過敏性休克。

統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，對連續(xù)變量描述觀察值的數(shù)量、均值、標(biāo)準(zhǔn)差、中位數(shù)、最小值和最大值，對分類變量描述其每一種類的例數(shù)和百分比。以皮膚試驗的反應(yīng)程度作為診斷變量，通過四格表形式給出診斷試驗結(jié)果，計算靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確度等，并繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC曲線)，計算ROC曲線下面積。對sIgE檢測陽性組的數(shù)據(jù)，進行sIgE陽性級別與皮膚試驗反應(yīng)程度的等級相關(guān)性分析。未作特殊說明，統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，檢驗水準(zhǔn)為0.05。

結(jié)　　果

一般情況

入組受試者共1043例，剔除16例(剔除原因為組胺對照陰性或變應(yīng)原溶媒對照陽性)，最終有效性評價1027例，安全性評價1043例。

1043例受試者中，男469例，女574例；年齡4～75歲，平均年齡(33.40±14.46)歲(1例受試者年齡資料缺失)。所有受試者中變應(yīng)性鼻炎患者占87.34%(9111043)，變應(yīng)性哮喘患者占57.05%(5951043)，變應(yīng)性結(jié)膜炎患者占30.58%(3191043)，蕁麻疹、變應(yīng)性咳嗽和濕疹患者分別占4.99%(521043)、3.84%(401043)和1.73%(181043)，其他變態(tài)反應(yīng)性疾病患者占0.58%(61043)。

有效性評價

主要評價指標(biāo)：以變態(tài)反應(yīng)專科醫(yī)生臨床綜合診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)。以鏈格孢皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“+”為診斷界值時，臨床綜合診斷和鏈格孢皮內(nèi)試驗均為陽性者78例，均為陰性者661例，鏈格孢皮內(nèi)試驗靈敏度為0.886 4(95%可信區(qū)間為0.820 1～0.952 7)，特異度為0.894 5(95%可信區(qū)間為0.872 3～0.916 6)，陽性預(yù)測值為0.500 0，陰性預(yù)測值為0.985 1，準(zhǔn)確度為0.893 6。以鏈格孢皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“++”為診斷界值時，臨床綜合診斷和鏈格孢皮內(nèi)試驗均為陽性者51例，兩者均為陰性者731例，鏈格孢皮內(nèi)試驗靈敏度為0.579 5(95%可信區(qū)間為0.476 4～0.682 7)，特異度為0.989 2(95%可信區(qū)間為0.981 7～0.996 6)，陽性預(yù)測值為0.864 4，陰性預(yù)測值為0.951 8，準(zhǔn)確度為0.945 6(表1～3)。

以變態(tài)反應(yīng)專科醫(yī)生臨床綜合診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，鏈格孢皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“+”為診斷界值時，ROC曲線下面積為0.915，95%可信區(qū)間為(0.874～0.956)(圖1)。

次要評價指標(biāo)：以血清sIgE檢測結(jié)果作為相對金標(biāo)準(zhǔn)。以鏈格孢皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“+”為診斷界值時，血清sIgE和鏈格孢皮內(nèi)試驗均為陽性者77例，均為陰性者34例，鏈格孢皮內(nèi)試驗靈敏度為0.927 7(95%可信區(qū)間為0.872 0～0.983 4)，特異度為0.531 3(95%可信區(qū)間為0.409 0～0.653 5)，陽性預(yù)測值為0.719 6，陰性預(yù)測值為0.850 0，準(zhǔn)確度為0.755 1。以鏈格孢皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“++”為診斷界值時，血清sIgE和鏈格孢皮內(nèi)試驗均為陽性者47例，兩者均為陰性者61例，鏈格孢皮內(nèi)試驗靈敏度為0.566 3(95%可信區(qū)間為0.459 6～0.672 9)，特異度為0.953 1(95%可信區(qū)間為0.901 3～1.000 0)，陽性預(yù)測值為0.940 0，陰性預(yù)測值為0.628 9，準(zhǔn)確度為0.734 7(表4～6)。

表1　皮內(nèi)試驗結(jié)果與臨床綜合診斷比較

表2　以皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“+”為界值的診斷價值*

*以變態(tài)反應(yīng)專科醫(yī)生臨床綜合診斷為金標(biāo)準(zhǔn)

探索性研究：鏈格孢血清sIgE陽性組中，血清sIgE水平與鏈格孢變應(yīng)原注射液原液1∶100稀釋液皮膚試驗反應(yīng)程度的等級相關(guān)系數(shù)為0.628 00(P<0.000 1)(表7)，在α=0.05水準(zhǔn)下可以認(rèn)為血清sIgE水平與皮膚試驗反應(yīng)程度存在正相關(guān)。

圖1鏈格孢皮內(nèi)試驗受試者工作特征曲線

FigFig1Receiver operating characteristic curve of intradermal test withAlternariaalternateextract

表3　以皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“++”為界值的診斷價值*

*以變態(tài)反應(yīng)專科醫(yī)生臨床綜合診斷為金標(biāo)準(zhǔn)

表4　皮內(nèi)試驗結(jié)果與血清sIgE結(jié)果比較

安全性分析

1043例受試者中，僅5例在進行皮內(nèi)試驗后出現(xiàn)與鏈格孢變應(yīng)原有關(guān)的不良反應(yīng)，占0.48%，均為局部不良反應(yīng)，其中1例注射部位持續(xù)紅腫超過24 h，1例出現(xiàn)注射部位硬結(jié)，均占總?cè)藬?shù)的0.01%。未發(fā)現(xiàn)與鏈格孢變應(yīng)原有關(guān)的全身性不良反應(yīng)。

表5　以皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“+”為界值的診斷價值*

*以sIgE檢測結(jié)果為相對金標(biāo)準(zhǔn)

表6　以皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“++”為界值的診斷價值*

*以sIgE檢測結(jié)果為相對金標(biāo)準(zhǔn)

討　　論

變應(yīng)原特異性診斷包括體內(nèi)試驗和體外試驗兩大類：體內(nèi)試驗包括皮膚試驗和變應(yīng)原激發(fā)試驗；體外試驗特指血清變應(yīng)原sIgE檢測。嚴(yán)格意義而言，只有規(guī)范的激發(fā)試驗才是變應(yīng)原特異性診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于該試驗存在潛在的危險性，對醫(yī)護人員及搶救設(shè)備條件要求較高，不能廣泛開展，因而在臨床實踐中很少使用。皮膚試驗是一種古老的變應(yīng)原檢測方法，至今應(yīng)用已有百余年。目前，Thermo Fisher公司Immuno CAP?系統(tǒng)采用熒光酶聯(lián)免疫法檢測變應(yīng)原sIgE的方法，是國際上公認(rèn)的最可靠的變應(yīng)原體外診斷方法。據(jù)文獻報道，皮膚試驗與熒光酶聯(lián)免疫法sIgE檢測有較好的相關(guān)性[9-11]。在激發(fā)試驗不可行的前提下，變應(yīng)原特異性診斷的金標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)涵蓋臨床病史、癥狀和體征，變應(yīng)原體內(nèi)試驗和變應(yīng)原體外試驗等項內(nèi)容，只有綜合參考上述臨床和體內(nèi)、體外檢查結(jié)果才能做出比較準(zhǔn)確的變應(yīng)原特異性診斷[12]。

本研究采用臨床病史、癥狀、體征和血清sIgE檢測做出的臨床綜合診斷作為變應(yīng)原特異性診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，評價用鏈格孢變應(yīng)原原液1∶100稀釋液皮內(nèi)試驗診斷鏈格孢變態(tài)反應(yīng)的臨床應(yīng)用價值，同時以sIgE檢測結(jié)果作為相對金標(biāo)準(zhǔn)，評價鏈格孢變應(yīng)原皮內(nèi)試驗診斷鏈格孢變態(tài)反應(yīng)的臨床價值。

當(dāng)以臨床綜合診斷作金標(biāo)準(zhǔn)時，分別以皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“+”和≥“++”為診斷界值，鏈格孢變應(yīng)原原液1∶100稀釋液皮內(nèi)試驗的靈敏度分別為0.886 4和0.579 5；特異度分別為0.894 5和0.989 2，準(zhǔn)確度分別為0.893 6和0.945 6，陽性預(yù)測值分別為0.500 0和0.864 4，陰性預(yù)測值分別為0.985 1和0.951 8?？梢?，以皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“++”為診斷界值比以≥“+”為診斷界值的準(zhǔn)確度和特異度稍高，但靈敏度明顯降低，陽性預(yù)測值明顯升高。

表7　血清sIgE水平與皮膚試驗反應(yīng)程度

＊臨床上變應(yīng)原皮內(nèi)試驗風(fēng)團直徑<5 mm，但接近5 mm時判斷為“±”，表示可疑陽性

ROC曲線下面積可以綜合評價一個診斷試驗的靈敏度和特異度，可以通過檢驗總體ROC曲線下面積是否等于0.5來評價某診斷試驗是否有價值。本試驗中，以皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“+”為診斷界值的AUC(曲線下面積)為0.915，95%的可信區(qū)間為(0.874～0.956)，因此可以認(rèn)為鏈格孢變應(yīng)原原液1∶100稀釋液皮內(nèi)試驗診斷鏈格孢變態(tài)反應(yīng)的臨床應(yīng)用診斷價值較高。

以鏈格孢sIgE檢測結(jié)果作為相對金標(biāo)準(zhǔn)，分別以皮內(nèi)試驗結(jié)果≥“+”和≥“++”為診斷界值，鏈格孢變應(yīng)原原液1∶100稀釋液皮內(nèi)試驗的靈敏度分別為0.927 7和0.566 3；特異度分別為0.531 3和0.953 1，準(zhǔn)確度分別為0.755 1和0.734 9，陽性預(yù)測值分別為0.719 6和0.940 0，陰性預(yù)測值分別為0.850 0和0.628 9?？梢姡云?nèi)試驗結(jié)果≥“++”為診斷界值比以≥“+”為診斷界值的準(zhǔn)確度差異不大，但特異度明顯升高，靈敏度明顯降低，陽性預(yù)測值明顯升高。

皮膚試驗結(jié)果受皮試液、皮試設(shè)備、操作者手法，受試者皮膚條件以及合并用藥等多方面影響，有可能出現(xiàn)假陽性或假陰性反應(yīng)[13-14]。傳統(tǒng)認(rèn)為，皮內(nèi)試驗的靈敏度高，但容易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。假陽性反應(yīng)與皮試操作者的技術(shù)，變應(yīng)原浸液的純度和生物效價，患者的皮膚反應(yīng)狀態(tài)等因素有關(guān)。皮內(nèi)試驗的假陰性結(jié)果，可能與皮試操作者的技術(shù)，患者接受免疫治療以及皮膚條件和試驗部位相關(guān)。有文獻報告，免疫治療可使皮膚對相應(yīng)變應(yīng)原的反應(yīng)性降低，幼兒和50歲以上個體的皮膚反應(yīng)性降低，上臂肘窩處的皮膚比腕部敏感，尺側(cè)皮膚較橈側(cè)敏感，上背部的皮膚比下背部敏感[15]。本研究的皮內(nèi)試驗由5位護士操作，由于個體操作手法的誤差，可能導(dǎo)致假陽性和假陰性結(jié)果。

以臨床綜合診斷作金標(biāo)準(zhǔn)，以皮試≥“+”作診斷界值，鏈格孢變應(yīng)原原液1∶100稀釋液皮內(nèi)試驗的特異度、陰性預(yù)測值，以及準(zhǔn)確度均達90%左右，且ROC曲線下面積為0.915，說明皮內(nèi)試驗≥“+”具有較高診斷價值。無論以臨床綜合診斷還是以血清sIgE檢測作標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)以皮試≥“+”作診斷界值時，試驗靈敏度都很高，但陽性預(yù)測值低；當(dāng)以≥“++”作診斷界值時，試驗靈敏度明顯降低，但陽性預(yù)測值升高。可見，皮內(nèi)試驗的假陽性率較高。當(dāng)不具備sIgE檢測條件，單純應(yīng)用皮內(nèi)試驗結(jié)合臨床病史診斷變態(tài)反應(yīng)性疾病時，選擇皮內(nèi)試驗≥“++”作為診斷界值，可明顯降低將非變態(tài)反應(yīng)誤診為變態(tài)反應(yīng)的可能性。但一味提高皮膚試驗的診斷界值，會降低靈敏度，造成將變態(tài)反應(yīng)誤診為非變態(tài)反應(yīng)的可能，故綜合評估皮膚試驗、sIgE檢測，以及臨床病史才能更準(zhǔn)確的做出變應(yīng)原特異性診斷。

對鏈格孢血清sIgE陽性水平與皮膚試驗反應(yīng)程度所做的等級相關(guān)性研究顯示，sIgE陽性1級者，皮試多為“+”(66.7%)；sIgE陽性3級、4級者，皮試多為“++”(63.3%和64.0%)；皮試≥“+++”者共5例，sIgE均≥3級。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，血清sIgE陽性水平與鏈格孢變應(yīng)原注射液原液1∶100稀釋液皮膚試驗反應(yīng)程度的等級相關(guān)系數(shù)為0.628 00(P<0.000 1)，說明兩者存在正相關(guān)。

在全部1043例受試者中，僅有5例在進行皮內(nèi)試驗后出現(xiàn)與鏈格孢變應(yīng)原有關(guān)的不良反應(yīng)(皮試結(jié)果均≥“+++)，均為局部不良反應(yīng)，占受試者總?cè)藬?shù)的0.48%。其中1例注射部位持續(xù)紅腫超過24小時，1例出現(xiàn)注射部位硬結(jié)，均占總?cè)藬?shù)的0.01%。未發(fā)現(xiàn)與鏈格孢變應(yīng)原有關(guān)的全身性不良反應(yīng)。

綜上所述，鏈格孢變應(yīng)原注射原液1∶100稀釋液進行皮膚試驗，具有操作簡單，安全，高靈敏度，高特異性的優(yōu)點，可用于鏈格孢引起的變應(yīng)性疾病的輔助診斷，還可為特異性免疫治療提供可靠的客觀依據(jù)。

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