肺表面活性蛋白D基因多態(tài)性與華中地區(qū)過(guò)敏性鼻炎遺傳易感性

鄧玉琴，陶澤璋，孔勇剛，許　昱，陳始明，肖伯奎

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，武漢 430060)

過(guò)敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)已成為全球共同關(guān)注的疾病[1]。目前認(rèn)為，過(guò)敏性鼻炎是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同導(dǎo)致的多基因、免疫性疾病[2]。遺傳和環(huán)境因素共同決定疾病的發(fā)生，但對(duì)于大多數(shù)過(guò)敏性鼻炎患者其易感因素仍不清楚，尋找過(guò)敏性鼻炎易感基因己成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。

單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms，SNP)是人基因組最為廣泛的遺傳變異，它體現(xiàn)人群個(gè)體差異的DNA序列變化中最基本和最常見的形式，人DNA變異的90%由SNP貢獻(xiàn)。近年來(lái)，人們對(duì)肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白在肺外組織中顯示出的強(qiáng)大炎癥和免疫調(diào)節(jié)功能越來(lái)越關(guān)注[3-4]，特別是發(fā)現(xiàn)其家族成員的SNP與細(xì)支氣管炎、肺結(jié)核、肺泡蛋白沉積癥、囊性纖維病呈顯著相關(guān)性。肺表面活性蛋白D(surfactant protein D，SP-D)屬于肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白中的一員，人類SP-D基因位于染色體10q21～q24。目前，已鑒定人類SP-D編碼區(qū)存在3個(gè)位點(diǎn)SNP，即Met11Thr(rs721917)、Ala160Thr(rs2243639)和Ser270Thr(rs3088308)，其中已發(fā)現(xiàn)Met11Thr位點(diǎn)的SNP與結(jié)核[5]、呼吸道合胞體病毒[6]、呼吸窘迫綜合征[7]和甲型流感病毒[8]感染有關(guān)。研究顯示，SP-D的Met11Thr位點(diǎn)多態(tài)性可能與哮喘有關(guān)[9]。哮喘與過(guò)敏性鼻炎具有相似的遺傳學(xué)背景，SP-D的SNP是否與過(guò)敏性鼻炎有關(guān)，尚未見國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究報(bào)道。本研究收集具備相似生活環(huán)境的我國(guó)南方就診患者作為研究對(duì)象，利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)SP-D在上述3個(gè)位點(diǎn)的SNP，并分析3個(gè)位點(diǎn)不同基因型的血清總IgE和特異性IgE之間的關(guān)系，以探討SP-D的SNP與過(guò)敏性鼻炎的關(guān)聯(lián)性。

資料和方法

對(duì)象與分組

根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻喉科學(xué)分會(huì)武夷山會(huì)議過(guò)敏性鼻炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，選擇就診于武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科216例[113例女性，103例男性，平均年齡為(34.3±14.38)歲]過(guò)敏性鼻炎患者,所有患者均有過(guò)敏性鼻炎的典型癥狀，并經(jīng)粉塵螨、屋塵螨、艾蒿、豚草、花粉等8種過(guò)敏原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)檢測(cè)(阿羅格點(diǎn)刺液，德國(guó))和6種過(guò)敏原血清特異性IgE(戶塵螨/粉塵螨、矮豚草/高葎草、霉菌、動(dòng)物皮屑等)檢測(cè)，至少有1種過(guò)敏原反應(yīng)試驗(yàn)陽(yáng)性以上(表1)，試驗(yàn)結(jié)果與病史相一致。

正常對(duì)照組84名，其中40名女性，44男性，平均年齡為(43.3±11.53)歲。對(duì)照組均無(wú)過(guò)敏性鼻炎、哮喘等過(guò)敏性疾病病史，皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)和過(guò)敏原血清特異性IgE檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

表1　216例過(guò)敏性鼻炎患者過(guò)敏原檢測(cè)結(jié)果

所有研究對(duì)象均是漢族成年人群，居住在我國(guó)南方地區(qū)。通過(guò)問卷調(diào)查和當(dāng)場(chǎng)詢問的方式詢問每例患者的病史資料，包括家族史、母孕期有無(wú)致敏及用藥史、出生時(shí)是否早產(chǎn)、生活環(huán)境、是否養(yǎng)寵物等，建立詳盡的病史資料檔案。

方法

基因組DNA提取：采外周靜脈血5ml，EDTA-K2抗凝，-20℃暫存，按基因組DNA提取試劑盒(血液DNA提取試劑盒，北京天根生物工程有限公司)操作說(shuō)明提取DNA，-20℃保存。

引物設(shè)計(jì)和合成：所有寡核苷酸引物均由大連寶生物公司合成，設(shè)計(jì)引物序列見表2。

聚合酶鏈反應(yīng)：聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體積50 μl，含10×PCR反應(yīng)緩沖液4 μl，25mM MgCl2、25mM dNTP各1 μl，100 μM PCR正向引物及反向引物各1 μl，Taq DNA聚合酶2U及2 μl(約200 ng)基因組DNA模板。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共循環(huán)30次，隨后72℃延伸5 min。所有過(guò)程均在ABI公司9700型PCR儀上完成。

單鏈DNA模板的制備：rs3088308的PCR反向引物為5′端生物素標(biāo)記，rs721917及rs2243639的引物均為正向。在40 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入36 μl結(jié)合緩沖液(Pyrosequencing AB公司試劑)及4 μl鏈親和素(strepta-vidin)包被的磁珠，室溫下孵育5 min，用Pyrosequencing AB公司專用單鏈純化裝置吸取吸附有PCR產(chǎn)物的瓊脂糖珠。依次用70%乙醇，變性緩沖液，清洗緩沖液各清洗15 s，然后將瓊脂糖珠轉(zhuǎn)移到預(yù)先加有45 μl退火緩沖液(含0.3uM測(cè)序引物)的pyro96孔板中。

焦磷酸測(cè)序：實(shí)時(shí)焦磷酸測(cè)序在PSQ96微測(cè)序儀進(jìn)行，采用Pyrosequencing公司PSQ96 SQATM試劑盒，參照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。將PSQTM 96孔板中，置于80℃變性2 min，待冷卻至室溫后，將96孔板放入PSQ96測(cè)序儀樣本艙中，PSQ96-SQATM酶混合物(包括DNA Polym erase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)加入SQA反應(yīng)筒中，測(cè)序反應(yīng)自動(dòng)進(jìn)行[11-12]。測(cè)序反應(yīng)圖像和數(shù)據(jù)由PSQ96 MA2.1軟件分析處理，得到SNP測(cè)定結(jié)果。

血清IgE檢測(cè)：利用人免疫球蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)血清中總IgE水平。采用敏篩過(guò)敏原定量檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)患者血清中戶塵螨/粉塵螨等6種過(guò)敏原特異性IgE水平。血清特異性IgE水平>0.35 kU/L表示該過(guò)敏原陽(yáng)性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SHEsis在線軟件(http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析是否符合Hardy-Weinberg平衡定律和連鎖不平衡。基因型和等位基因頻率采用頻率計(jì)數(shù)法計(jì)算，基因型及組間等位基因頻率比較采用四格表χ2檢驗(yàn)或四格表確切概率法。使用SPSS(13.0版本)軟件中方差分析(ANOVA)比較不同基因型與血清特異性IgE之間的關(guān)系，所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

焦磷酸測(cè)序分析及基因型鑒定

過(guò)敏性鼻炎組和對(duì)照組SP-D 3個(gè)位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(均P>0.05)。

過(guò)敏性鼻炎組rs721917位點(diǎn)CC基因型頻率及等位基因C的頻率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.007和0.006)。rs2243639及 rs3088308位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在過(guò)敏性鼻炎組和對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表3)。

表2　肺表面活性蛋白D單核苷酸多態(tài)性引物序列

*：生物素標(biāo)記；F：正向引物；R：反向引物

表3　兩組肺表面活性蛋白D基因位點(diǎn)基因型、等位基因比較

表4　肺表面活性蛋白D單核苷酸多態(tài)性與血清總IgE及特異性IgE的關(guān)系

利用SHEsis軟件對(duì)SP-D3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行兩兩LD分析，結(jié)果顯示位點(diǎn)rs721917與rs2243639之間D′=0.048，D′<0.7；rs2243639及rs3088308位點(diǎn)之間D′=0.078，D′<0.7。無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的連鎖不平衡現(xiàn)象，因而未行單倍體分析。

SP-D單核苷酸多態(tài)性與血清總IgE及特異性IgE的關(guān)系

所有血清總IgE及特異性IgE值均轉(zhuǎn)化為以e為底的自然對(duì)數(shù)值(loge)進(jìn)行比較。過(guò)敏性鼻炎組上述3個(gè)位點(diǎn)不同基因型間血清總IgE及戶塵螨/粉塵螨和霉菌特異性IgE間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)(表4)。

討　　論

人類基因組SNP研究所揭示的人種、人群和個(gè)體之間DNA序列的差異以及這些差異所表現(xiàn)的意義將對(duì)疾病的診斷、治療和預(yù)防帶來(lái)革命性的變化[13]。焦磷酸測(cè)序技術(shù)正是新一代DNA序列差異分析技術(shù)之一，具體原理是：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)熒光信號(hào)的形式實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列。該技術(shù)的特點(diǎn)是對(duì)DNA的序列分析無(wú)須進(jìn)行電泳，DNA片段無(wú)須熒光標(biāo)記。

已報(bào)道的SP-D單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法有多種，其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)應(yīng)用得最多[14-15]，這種方法結(jié)果可靠但存在許多不足，實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要酶切，延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間；檢測(cè)過(guò)程繁瑣；不能精確確定突變位置及突變類型等。本研究焦磷酸測(cè)序在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增后，可在2 h內(nèi)對(duì)結(jié)果進(jìn)行自動(dòng)化分析，明顯縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。另外，傳統(tǒng)的測(cè)序法1周期只能做十幾個(gè)樣品，而PSQ96MA系統(tǒng)一次可完成96個(gè)樣品的分析，具有高通量的特點(diǎn)。因此，焦磷酸測(cè)序適用于大樣本量人群的相關(guān)基因DNA單核苷酸多態(tài)性的分析。

國(guó)外已有研究提示SP-D的SNP與過(guò)敏性哮喘及氣道炎性疾病的關(guān)系[5-9，16]，研究對(duì)象大多為居住在西方國(guó)家的人群。然而，SP-D的SNP與亞洲人群過(guò)敏性鼻炎的關(guān)系尚未見報(bào)道。為避免不同種族人群之間的基因差異和生活環(huán)境差異，本研究實(shí)驗(yàn)對(duì)象均為漢族并生活在中國(guó)南方地區(qū)。在本研究中，過(guò)敏性鼻炎組rs721917位點(diǎn)的CC基因型頻率及等位基因C的頻率顯著高于對(duì)照組，從基因型頻率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)現(xiàn)，CC基因型患過(guò)敏性鼻炎的風(fēng)險(xiǎn)是TT型的2.847倍(比值比=2.847，95%可信區(qū)間為1.313～6.176)，有C等位基因者患過(guò)敏性鼻炎的危險(xiǎn)性增加了1.633倍(比值比=1.633，95%可信區(qū)間為1.153～2.397)，提示rs721917位點(diǎn)等位基因C可能是中國(guó)漢族人群過(guò)敏性鼻炎的易感基因。rs2243639及rs3088308位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在過(guò)敏性鼻炎組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明這兩個(gè)位點(diǎn)在過(guò)敏性鼻炎中不起關(guān)鍵性的作用。

SP-D在抵御炎癥性細(xì)菌、病毒和抑制過(guò)敏性炎癥方面發(fā)揮著重要的作用[17]。有報(bào)道指出rs721917位點(diǎn)的CC基因型影響血漿SP-D水平，甚至可能影響SP-D正常的結(jié)構(gòu)及功能，與TT基因型相比，CC基因型血漿中SP-D含量要低得多[18]。國(guó)外學(xué)者也發(fā)現(xiàn)SP-D該位點(diǎn)的CC基因型多態(tài)性增加了結(jié)核病[5]及流感病毒A感染[8]的危險(xiǎn)性。因此，推測(cè)rs721917位點(diǎn)的CC基因型可能通過(guò)影響體內(nèi)SP-D水平，使SP-D抑制炎癥反應(yīng)的保護(hù)性功能降低，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)生過(guò)敏性鼻炎的危險(xiǎn)性增大。然而，與本研究不同的是，Krueger等[16]研究發(fā)現(xiàn)SP-D的rs721917，rs2243639及rs3088308三個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與法國(guó)兒童哮喘發(fā)生無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。另有研究發(fā)現(xiàn)，SP-D同一個(gè)位點(diǎn)的CC基因型與黑人兒童的遺傳過(guò)敏癥有相關(guān)性，但是CC基因型降低了該研究人群中發(fā)生遺傳過(guò)敏癥的機(jī)會(huì)[9]。究其原因，受試對(duì)象的遺傳學(xué)背景，種族，生活環(huán)境及不同年齡段特征存在差異，另外，本研究采用焦磷酸測(cè)序法也不同于以上兩位學(xué)者的研究，以上這些因素可能都會(huì)影響結(jié)果的不同。

研究顯示在炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)方面，與不同受體分子結(jié)合，SP-D發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)作用。當(dāng)SP-A及SP-D植物凝集素區(qū)(CRD區(qū)域)與上皮細(xì)胞或抗原遞呈細(xì)胞上的SIRP-α受體結(jié)合，可抑制炎性反應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子，維持抑炎性反應(yīng)環(huán)境；當(dāng)SP-A及SP-D膠原尾部與巨噬細(xì)胞上的鈣網(wǎng)織蛋白或CD91受體結(jié)合，可促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，加快對(duì)病原體的清除[19]。提示SP-D的rs721917位點(diǎn)SNP可能影響了SP-D膠原尾部或植物凝集素區(qū)的正常結(jié)構(gòu)，促使SP-D與不同的受體結(jié)合，發(fā)生促進(jìn)或抑制炎性反應(yīng)作用。正是因?yàn)镾P-D這種雙重調(diào)節(jié)作用，同時(shí)又從一側(cè)面解釋了為何SP-D SNP在本研究中增大了過(guò)敏性鼻炎的易感性，而在國(guó)外研究中降低了黑人兒童遺傳過(guò)敏癥的易感性。

體內(nèi)血清總IgE水平與過(guò)敏性疾病的發(fā)病密切相關(guān)。IgE是Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)最主要的介質(zhì)，總IgE即各種特異性IgE抗體的總和?？侷gE升高并不表示一定患有變態(tài)反應(yīng)性疾病，總IgE水平正常并不能排除過(guò)敏性疾病的可能，但其作為診斷參考仍具有重要參考價(jià)值。SP-D可阻止過(guò)敏原特異性IgE與肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞膜表面的Fc-RI相連接，抑制炎癥介質(zhì)生成(組胺、白三烯等)[3]。另外，由于不同地區(qū)過(guò)敏原的分布具有差異性，南方地區(qū)梅雨季節(jié)較長(zhǎng)，溫暖濕潤(rùn)，利于螨類和霉菌滋生，最常見的過(guò)敏原是螨類和霉菌[20]。因而，本研究分別比較過(guò)敏性鼻炎組3個(gè)位點(diǎn)不同基因型對(duì)應(yīng)的血清總IgE水平以及南方地區(qū)常見的過(guò)敏原螨類和霉菌血清特異性IgE值之間的差異。研究結(jié)果顯示，過(guò)敏性鼻炎患者rs721917、rs2243639及rs3088308這3個(gè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的血清總IgE水平以及特異性IgE值之間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示SP-D并不直接參與調(diào)控IgE的合成，其與過(guò)敏性鼻炎患者血清IgE水平的確切關(guān)系尚需進(jìn)一步大樣本的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究利用焦磷酸測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)，SP-D的rs721917位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與我國(guó)漢族南方地區(qū)人群的過(guò)敏性鼻炎的發(fā)生有關(guān)。對(duì)于SP-D基因多態(tài)性在過(guò)敏性鼻炎發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的可能作用仍需進(jìn)一步進(jìn)行大樣本、多地域、多民族廣泛深入的協(xié)同研究，從而為過(guò)敏性鼻炎的篩查、基因治療和發(fā)展特異性藥物療法奠定基礎(chǔ)，對(duì)防治過(guò)敏性鼻炎開辟新方向提供理論依據(jù)。

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