融合β-甘露聚糖酶基因的構(gòu)建、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的分析

王春娟， 李劍芳， 唐詩涵， 董運(yùn)海， 鄔敏辰

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

融合β-甘露聚糖酶基因的構(gòu)建、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的分析

王春娟1， 李劍芳1， 唐詩涵1， 董運(yùn)海1， 鄔敏辰*2

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

宇佐美曲霉 （Aspergillus usamii）YL-01-78的糖苷水解酶 5家族 β-甘露聚糖酶（AuMan5A）是一種僅含催化域 （CM）的單結(jié)構(gòu)蛋白。為改善其酶學(xué)性質(zhì)，基于理性設(shè)計將海棲熱胞菌 （Thermotoga maritima）MSB8的27家族碳水化合物結(jié)合域 （CBM27）融合至AuMan5A的C-端，并采用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建融合酶基因Auman5A-cbm27。分別將Auman5A-cbm27和Auman5A在畢赤酵母GS115中進(jìn)行表達(dá)，對重組表達(dá)產(chǎn)物reAuMan5A-CBM27和reAuMan5A進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)測定。結(jié)果表明，reAuMan5A-CBM27和reAuMan5A的最適溫度均為68℃；兩者分別在68和60℃及以下穩(wěn)定。同時，前者較后者具有更廣泛的pH穩(wěn)定范圍。reAuMan5ACBM27對角豆膠的Km值由融合前的1.7 mg/mL降至0.7 mg/mL，表明AuMan5A的底物親和力得到了提高。

β-甘露聚糖酶；催化域；碳水化合物結(jié)合域；熱穩(wěn)定性；底物親和力

β-甘露聚糖酶是內(nèi)切β-1，4-D-甘露聚糖酶（endo-β-1，4-D-mannanase，EC 3.2.1.78）的簡稱，根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)和疏水簇分析，幾乎所有β-甘露聚糖酶可歸為糖苷水解酶5、26和113家族（http：// www.cazy.org/fam/acc_GH.html）[1]。β-甘露聚糖酶廣泛存在于動植物和微生物中，它在食品、醫(yī)藥、飼料、造紙、紡織和能源開發(fā)等諸多領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值[2-3]。然而，大多數(shù)商品化的β-甘露聚糖酶存在或多或少的缺陷，如底物親和力弱、催化活性低、對極端環(huán)境耐受性差等，這些已成為制約β-甘露聚糖酶發(fā)展的瓶頸[4]。目前利用蛋白質(zhì)/基因工程技術(shù)對酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以獲取催化活性高和酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的工程酶，已成為眾多研究者關(guān)注的熱點。

多數(shù)β-甘露聚糖酶結(jié)構(gòu)是由催化域 （CM）、碳水化合物結(jié)合域 （CBM）以及連接兩個區(qū)域的連接肽組成，但有些酶僅含CM的單結(jié)構(gòu)蛋白[5]。由于CBM具有特異性結(jié)合碳水化合物的功能，所以可以通過其具有的吸附作用而增強(qiáng)酶對底物的可及度，提高底物附近的酶濃度，進(jìn)而提高酶降解底物的表觀效率。目前基于經(jīng)驗或理性設(shè)計，借助連接肽將酶的CM與CBM融合，從而達(dá)到改善酶學(xué)性質(zhì)的目的，已有一些成功的實例。Pham等[6]借助一種天然連接肽將黑曲霉 （Aspergillus niger）纖維二糖水解酶B的CBM1融合至微刺曲霉（A.aculeatus）β-甘露聚糖酶 （Man）的C-端。結(jié)果表明，重組融合酶Man-CBM1的底物親和力和熱穩(wěn)定性均有明顯的提高。李相前等研究發(fā)現(xiàn)，將源自海棲熱袍菌 （T. maritima）的內(nèi)切葡聚糖酶Cel12B與來自同一菌株木聚糖酶XynA的CBM融合，能顯著提高Cel12B的熱穩(wěn)定性[7]。

作者所在實驗室已克隆了A.usamii YL-01-78的5家族β-甘露聚糖酶基因Auman5A，由該基因編碼的β-甘露聚糖酶AuMan5A是一個不含CBM的單結(jié)構(gòu)域蛋白[8]。作者采用同源建模、分子對接模擬和結(jié)合自由能計算等手段，對AuMan5A的定向改造進(jìn)行理性設(shè)計。在此基礎(chǔ)上采用重疊PCR技術(shù)實施了融合酶基因Auman5A-cbm27的構(gòu)建、在P. pastoris中的表達(dá)及重組融合酶reAuMan5A-CBM27酶學(xué)性質(zhì)的測定。該理性設(shè)計并結(jié)合基因融合技術(shù)用于改善AuMan5A酶學(xué)性質(zhì)的實驗方案和結(jié)果，迄今為止未見有國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，可為β-甘露聚糖酶乃至其它酶的定向改造及其機(jī)制的研究提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coli JM109和DH5α、畢赤酵母Pichia pastoris GS115和表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K：均購自Invitrogen公司；克隆質(zhì)粒pUCm-T：購自上海Sangon公司；重組質(zhì)粒pUCm-T-Auman5A和pPIC9K-Auman5A：作者所在研究室構(gòu)建和保存。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker和蛋白質(zhì) Marker：購自大連TaKaRa公司；質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒、酵母粉、蛋白胨、酵母基礎(chǔ)氮源和Geneticin G418：購自上海Sangon公司；角豆膠、甘露糖和考馬斯亮藍(lán)R-250：Sigma公司產(chǎn)品；Sephadex G-75：Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品；其它試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。LB、MD、YPD、YPD-G418、BMGY和BMMY培養(yǎng)基的配制參照 Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊。

1.3 融合酶的理性設(shè)計

1.3.1 CBM數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及進(jìn)化樹的構(gòu)建 基于氨基酸的序列相似性，CAZy數(shù)據(jù)庫 （Carbohydrate-Active enZYmes Database，http：//www.cazy.org/）中的45 072種碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域 （carbohydratebindingmodule，CBM）被分為71個家族，超過15個家族的CBM具有纖維素親和力，5個家族的CBM具有甘露糖結(jié)合力。研究表明，27家族的CBM對催化域具有一定的熱保護(hù)作用[9]，并可以特異性地結(jié)合甘露聚糖[10]。隨機(jī)選取多條27家族CBMs序列，利用MEGA4.0軟件構(gòu)建CBM27進(jìn)化樹。

1.3.2 CBM與模型分子的分子對接和分子動力學(xué)模擬 根據(jù)CBM27進(jìn)化樹，從每個CBM27亞家族中分別選擇多個具有代表性的CBM，利用AutoDock 4.2程序 （http：//autodock.scripps.edu）將它們與甘露五糖模型分子進(jìn)行分子對接模擬[11]，再使用Gromacs 4.5軟件進(jìn)行分子動力學(xué)模擬分析，并計算它們之間的結(jié)合自由能。當(dāng)配體與受體之間的結(jié)合自由能越低，表明兩者之間的親和力越強(qiáng)[12]。依據(jù)CBM27與模型分子間的結(jié)合自由能大小，最終選定1個自由能最高的CBM27。為實現(xiàn)CBM27的高效表達(dá)，根據(jù)畢赤酵母GS115的密碼子偏好性（http：//www.kazusa.or.jp/codon/）對 CBM27進(jìn)行密碼子優(yōu)化，由TaKaRa公司合成（pUCm-T-cbm27）。

1.4 融合酶基因的構(gòu)建

基于上述理性設(shè)計結(jié)果，根據(jù)Auman5A序列（登錄號：HQ839639）及Trichoderma reesei纖維二糖水解酶I的連接肽基因序列 （登錄號：GL985084），設(shè)計合成Auman5A-cbm27基因所需的4條引物（見表1）。

以質(zhì)粒pUCm-T-Auman5A為模板、AMan5AF1和AMan5A-R1為引物，PCR擴(kuò)增出融合酶的上游基因片段Auman5A；同時以pMD19-T-cbm27質(zhì)粒為模板、Tman5A-F2和Tmman5A-R2為引物，擴(kuò)增出下游基因片段cbm27。上下游兩片段互為引物和模板，按等摩爾數(shù)混合，PCR擴(kuò)增，融合上下游片段，加入引物AMan5A-F1與Tman5A-R2，大量擴(kuò)增融合基因Auman5A-cbm27。獲得的目的PCR產(chǎn)物與 pUCm-T連接，得重組質(zhì)粒 pUCm-TAuman5A-cbm27。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

EcoRⅠ和NotⅠ分別雙酶切質(zhì)粒pUCm-TAuman5A-cbm27與pPIC9K，回收目的條帶，用T4連接酶將兩者連接，得重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KAuman5A-cbm27。

1.6 重組β-甘露聚糖酶的表達(dá)

pPIC9K-Auman5A-cbm27 和 pPIC9KAuman5A分別用SalⅠ線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母，具體操作參見基因脈沖儀 （Bio-Rad公司）說明書。重組酵母鑒定、多拷貝篩選及誘導(dǎo)表達(dá)參見Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手冊。

1.7 重組β-甘露聚糖酶的純化

重組畢赤酵母經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1%甲醇誘導(dǎo)96 h，4℃，8 000 r/min冷凍離心15 min，保留上清液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%的 （NH4）2SO4進(jìn)行沉淀，離心收集沉淀，取適量20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 6.0），溶解沉淀，經(jīng)透析、超濾濃縮 （膜截留相對分子質(zhì)量為10 000，Millipore公司產(chǎn)品），上樣至Sephadex G-75層析柱（1.6 cm×80 cm）。

1.8 重組β-甘露聚糖酶活性和蛋白質(zhì)的分析

β-甘露聚糖酶活性測定參見文獻(xiàn)[4]。每分鐘釋放1 μmol還原糖（以甘露糖計）所需的酶量為一個酶活力單位 （U）。純化后的重組表達(dá)產(chǎn)物SDSPAGE分析采用Laemmli法[13]。蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法[14]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9 重組β-甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.9.1 最適pH及pH穩(wěn)定性 配制一系列不同pH的緩沖液，pH 2.0~13.0，底物用去離子水配成質(zhì)量濃度1 g/dL，將底物與不同pH的緩沖液1∶1混合，按酶活力測定方法測定。將酶液分別用不同pH的緩沖液稀釋，40℃保溫1 h，測定不同pH的樣品酶活性。

1.9.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 以0.5 g/dL為底物質(zhì)量濃度，在40~80℃范圍內(nèi)測定酶活性，得到最適宜酶反應(yīng)的溫度。將酶液用緩沖液適當(dāng)稀釋后，分別置于45、50、55、60、65、70、75℃下，保溫1 h，測定不同溫度的樣品酶活性，作者將殘余酶活性在85%以上定義為熱穩(wěn)定[15]。

1.9.3 酶動力學(xué)參數(shù)測定 以pH 3.6的檸檬酸-磷酸氫二鈉配制的不同質(zhì)量濃度 （1.0~10 mg/mL）的角豆膠溶液為底物，在50℃的條件下酶解反應(yīng)15 min，測定酶活性。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，求出酶的Km及Vmax值。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合酶的理性設(shè)計

利用MEGA4.0軟件構(gòu)建27家族CBMs進(jìn)化樹（圖1）。從中選取8個CBM27作為候選對象，利用Modeller 9.9軟件進(jìn)行3-D結(jié)構(gòu)同源建模。同時，利用AutoDock 4.2程序?qū)?個候選的CBM27分別與甘露五糖分子進(jìn)行分子對接，計算其結(jié)合自由能，結(jié)果如表2所示。表中可以看出，來自于T. maritima MSB8的CBM27與甘露五糖的結(jié)合自由能最低（-209.99 kcal/mol）。因此，選擇此CBM27融合至AuMan5A的C端。

2.2 融合酶編碼基因的構(gòu)建

分別從質(zhì)粒pUCm-T-Auman5A及pMD19-T-cbm27上擴(kuò)增出1 050 bp的Auman5A和530 bp的cbm27條帶，通過重疊PCR方法擴(kuò)增出約1 630 bp融合基因Auman5A-cbm27 （包含EcoR I和Not I酶切位點），連接至 pUCm-T。測序結(jié)果顯示，Auman5A-cbm27長度為1 629 bp，與預(yù)期一致。Auman5A-cbm27基因序列編碼547個氨基酸的AuMan5A-CBM27，包括含 347個氨基酸的AuMan5A、29個氨基酸的連接肽和171個氨基酸的CBM27（圖2），其理論相對分子質(zhì)量與等電點pI分別為：60 164和4.41。將融合基因克隆至pPIC9K，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-Auman5A-cbm27。

2.3 重組β-甘露聚糖酶的表達(dá)和純化

經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇誘導(dǎo)重組畢赤酵母96 h后，離心，取發(fā)酵上清液按1.8方法測定酶活性，分別得到AuMan5A-CBM27和AuMan5A表達(dá)最高的重組子，其酶活性分別為21.75、33.84 U/mL。將篩選得到的AuMan5A-CBM27和reAuMan5A發(fā)酵上清液分別經(jīng)（NH4）2SO4分級沉淀、陰離子交換層析、超濾及凝膠過濾層析進(jìn)行純化，對純化后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，純化后的目的蛋白reAuMan5A-CBM27和reAuMan5A分別在60 200和19 800 kDa（表觀相對分子質(zhì)量）顯示出單一條帶 （圖3泳道2，4）。按1.8方法測得電泳純的reAuMan5A-CBM27和reAuMan5A的比酶活分別為170、231 U/mg。

2.4 重組β-甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 最適pH及pH穩(wěn)定性 在不同pH值條件下分別測定reAuMan5A與reAuMan5A-CBM27活性，結(jié)果如圖4（a）所示，reAuMan5A與reAuMan5ACBM27的最適 pH均為 4.0。將 reAuMan5A與reAuMan5A-CBM27在不同pH值中保溫1 h，測其酶活性，結(jié)果如圖4（b）所示，reAuMan5A-CBM27在pH 2.0~9.0范圍之間仍然具有較好的穩(wěn)定性，殘余酶活超過85%，而AuMan5A在pH 2.5~7.5范圍內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 在不同溫度下分別測定reAuMan5A與reAuMan5A-CBM27酶活性，結(jié)果如圖5（a）所示，reAuMan5A與reAuMan5ACBM27的最適溫度均為68℃。將reAuMan5A與reAuMan5A-CBM27在不同溫度中分別保溫1 h，測其酶活性，結(jié)果如圖5（b）所示，當(dāng)溫度在60℃及以下時，前者穩(wěn)定，而后者在68℃及以下穩(wěn)定，表明CBM27在一定程度上可以提高了reAuMan5A的熱穩(wěn)定性。

2.4.3 酶動力學(xué)參數(shù)測定 由1.8.3所述方法測得reAuMan5A-CBM27的 Km值為 0.7 mg/mL，較reAuMan5A 的 1.7 mg/mL 降 低 了 58.8% ；reAuMan5A-CBM27的 Vmax值為 249.3 U/mg，較reAuMan5A的325.7 U/mg略有降低。結(jié)果表明，CBM27對甘露五糖特有的結(jié)合力使得融合酶與底物更易結(jié)合，從而提高了酶對底物的親和力。

3 結(jié)語

借助各種生物數(shù)據(jù)庫和生物計算軟件，通過CBM27數(shù)據(jù)庫及進(jìn)化樹的構(gòu)建，采用同源建模、分子對接模擬和結(jié)合自由能計算等手段對AuMan5A分子的定向改造進(jìn)行理性化設(shè)計，借助重疊PCR技術(shù)克隆出了編碼AuMan5A-CBM27的基因，并在畢赤酵母GS115中實現(xiàn)異源表達(dá)。獲得的AuMan5ACBM27與原酶AuMan5A相比，酶學(xué)性質(zhì)表明，融合酶比原酶能夠在更寬的pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定性，同時，其溫度耐受性也較原酶提高了8℃。這表明，融合酶在工業(yè)生產(chǎn)上更具有應(yīng)用潛力。另外，融合酶對角豆膠的Km值為0.7 mg/mL，較原酶的1.7 mg/ mL有明顯的降低，表明融合酶對底物的親和力有了較大程度的提高。雖然融合酶的酶活性較原酶有所下降，但其具有的更優(yōu)越的pH性質(zhì)，更高的熱穩(wěn)定性及底物親和力，表明其具有很大的應(yīng)用潛力，同時也為β-甘露聚糖酶進(jìn)一步的應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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會議信息

會議名稱(中文)：第六屆全國微生物基因組學(xué)學(xué)術(shù)研討會

所屬學(xué)科：動植物微生物學(xué),遺傳與發(fā)育生物學(xué)

開始日期：2016-12-16 結(jié)束日期：2016-12-19

所在城市：海南省 樂東黎族自治縣

具體地點：樂東縣九所鎮(zhèn)

主辦單位：中國微生物學(xué)會農(nóng)業(yè)微生物專業(yè)委員會 中國微生物學(xué)會基礎(chǔ)微生物專業(yè)委員會

承辦單位：海南省微生物學(xué)會 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室

聯(lián)系人：吳 悅女士18040555549 聯(lián)系電話：027-87287254

E-MAIL：nercmp@mail.hzau.edu.cn

會議網(wǎng)站：http://csm.im.ac.cn/templates/team/introduction.aspx?nodeid=9&page=ContentPage&contentid=3912

會議背景介紹：微生物基因組學(xué)已成為當(dāng)前生物學(xué)前沿的研究熱點。為了及時交流研究進(jìn)展，加強(qiáng)合作，推廣新的研究技術(shù)和分析方法，推動我國在該領(lǐng)域的進(jìn)步，由中國微生物學(xué)會農(nóng)業(yè)微生物專業(yè)委員會和基礎(chǔ)微生物專業(yè)委員會主辦，海南省微生物學(xué)會、中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室共同承辦的“第六屆全國微生物基因組學(xué)學(xué)術(shù)研討會”將于2016年12月16--19日在海南省樂東縣九所鎮(zhèn)召開。熱忱歡迎全國各地的微生物基因組學(xué)及合成微生物學(xué)專家、同行參會，交流學(xué)術(shù)研究成果。

Expression and Enzymatic Properties Analysis of a Fusion β-Mannanase

WANG Chunjuan1， LI Jianfang1， TANG Shihan1， DONG Yunhai1， WU Minchen*2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Wuxi Medical School，
Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

AuMan5A，which belongs to the glycoside hydrolase family 5 β-mannanase from Aspergillus usamii YL-01-78，only contains a catalytic module （CM）.To improve its enzymatic properties，a fusion β-mannanase （AuMan5A-CBM27）was well designed by fusing a family 27carbohydrate-binding module（CBM27）from Thermotoga maritima MSB8 into the C-terminus of AuMan5A.A fusion gene（Auman5A-cbm27）constructed by the overlapping PCR was expressed in Pichia pastoris GS115.The enzymatic properties of the purified reAuMan5A-CBM27 and reAuMan5A were investigated.The optimal temperatures of both reAuMan5A-CBM27 and reAuMan5A were determined at 68℃.They were respectively thermo-stabled at 68℃or 60℃and below.A wider pH tolerant range was observed for reAuMan5A-CBM27，whose Kmvalue to locust bean dropped from 1.7 mg/mL to 0.7 mg/mL.The increase of substrate affinity of AuMan5A wasconfirmed.

β-mannanase，catalytic module，carbohydrate-binding module，thermostability，substrate affinity

TS 201.25

A

1673—1689（2016）11—1135—07

2015-01-16

國家自然科學(xué)基金項目 （31271811）。

*通信作者：鄔敏辰 （1962—），男，江蘇無錫人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶工程與基因工程研究。E-mail：bioch@163.com