基于磁性納米粒子的糧油制品真?zhèn)舞b別技術(shù)研究

葛文亮， 王文彬， 胥傳來

（1.無錫市第二人民醫(yī)院，江蘇 無錫214002；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

基于磁性納米粒子的糧油制品真?zhèn)舞b別技術(shù)研究

葛文亮1， 王文彬2， 胥傳來2

（1.無錫市第二人民醫(yī)院，江蘇 無錫214002；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

通過PCR檢測食用油中內(nèi)源性DNA是鑒定食用植物油品種真實屬性，檢測食用油摻假的一種有效方法。然而由于精煉的食用油中DNA含量極低，如何有效富集食用油中的DNA是實現(xiàn)PCR鑒別糧油的關(guān)鍵。因此，作者研究了磁珠法富集食用油中的DNA并通過實時熒光PCR檢測芝麻油、菜籽油、稻米油的內(nèi)源基因。結(jié)果表明經(jīng)過5次乳化后和磁珠進一步富集水相中的DNA，實時熒光PCR成功檢測到了食用油中的內(nèi)源性基因，瓊脂糖凝膠電泳分析進一步證明實現(xiàn)了上述3種食用植物油的定性鑒定。

磁珠；PCR；食用油；DNA提取

食用油脂是我國重要的糧油產(chǎn)品，也是居民不可缺少的營養(yǎng)品之一[1]。我國的食用植物油主要有大豆油、菜籽油、花生油、芝麻油、稻米油、棕櫚油、橄欖油、茶油等。由于價格差異，近年來市場上食用油中如芝麻油、稻米油中常常出現(xiàn)摻假甚至造假的現(xiàn)象，給市場環(huán)境和消費者帶來極大的負(fù)面影響。因此，建立主要糧油品種鑒定方法，實現(xiàn)摻假檢測是十分必要的。

目前，氣相色譜法[2-4]、紫外分光光度法[5]、紅外光譜法[6]、拉曼光譜法[7]以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）[8-9]已被研究用于糧油摻假的檢測。在這些方法中，PCR方法相對簡便而且根據(jù)品種的保守基因不同設(shè)計引物，可以適用于所有食用油的鑒別[10]。而由于DNA本身易溶于水，經(jīng)過水化、水洗等精煉過程后食用油中DNA的殘留量很低[11]。因此，有效提取、富集食用油中的DNA是影響PCR成功鑒別糧油的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的DNA提取方法無法將食用油中低含量的DNA片段提取并用PCR檢測到，而磁性納米材料用于提取DNA的優(yōu)勢主要是自身粒徑較小、比表面積大、分散性好，與DNA結(jié)合效率高，同時具有超順磁性，操作簡便、迅速[12-13]。目前磁珠多用于提取微生物等的基因組DNA，而用于提取糧油樣品DNA的研究比較少。作者以多次乳化和磁珠富集為基礎(chǔ)建立了糧油中DNA提取方法并通過實時熒光PCR成功鑒定了芝麻油、菜籽油、稻米油以及調(diào)和油中的這幾種糧油成分，瓊脂糖凝膠電泳進行了進一步確認(rèn)了檢測結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

芝麻油、菜籽油、稻米油以及調(diào)和油：市售（見表1）；乙二胺四乙酸（EDTA）：購于Sigma公司；氯仿（AR），聚乙二醇 20000（PEG20000），無水乙醇（AR）：購于國藥集團公司；表面羧基修飾的磁珠（500 nm）：作者所在實驗室合成；實時熒光PCR超混液：諾唯贊公司產(chǎn)品；檢測芝麻油、菜籽油、稻米油內(nèi)源基因所用引物序列：生工生物有限公司合成。

1.2 主要儀器

CFX96TM實時熒光定量 PCR檢測系統(tǒng)：Bio-Rad公司產(chǎn)品；恒溫烘箱：上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；搖床：江蘇金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司產(chǎn)品；Heal Force Neofuge 18R臺式高速冷凍離心機：上海力新儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 磁性納米材料 表面帶COOH磁珠的制備是采用溶劑熱法加入檸檬酸鈉一步法制備[14-15]。該制備方法步驟簡單，合成的粒子分散性好，較為穩(wěn)定。

1.3.2 實時熒光PCR檢測方法建立及優(yōu)化 芝麻[16]、菜籽[17-18]、稻米[16]的內(nèi)源基因?qū)?yīng)的引物序列參考文獻(xiàn)獲得并由上海生工生物有限公司合成，并列于表2。芝麻、菜籽、稻米用液氮在陶瓷研缽中研磨，然后采用天根（北京）植物基因組DNA提取試劑盒提取種子中的基因組DNA。將提取的基因組DNA用滅菌的超純水進行3倍梯度稀釋后作為模板DNA。RT-PCR采用 20 μL體系，即 10 μL 2X 的VazymeTMSuperMix，0.4 μL 10 μmol/L的正向引物，0.4 μL 10 μmol/L的反向引物，模板DNA 2 μL，7.2 μL的滅菌超純水。之后用移液槍混勻樣品并進行RT-PCR檢測，擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進行確證。由于采用的RT-PCR超混液中已含有適宜濃度的Taq DNA酶、dNTPs、MgCl2、熒光染料、反應(yīng)緩沖液等，影響實驗效果的主要因素即為引物濃度和PCR擴增條件（退火溫度）。因此，實驗研究了引物濃度，退火溫度對RT-PCR的影響。

1.3.3 磁珠法提取食用植物油中DNA 取15 mL pH 8.5的 50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA到50 mL離心管中，加入30 mL食用油樣品，充分震蕩后置于搖床上，室溫震蕩條件下乳化1 h。8 000 r/min，10 min離心，去除上層油脂并添加30 mL食用油樣品。重復(fù)步驟1和2直至乳化150 mL食用油樣品。如離心后出現(xiàn)水油乳化層，可通過65℃溫浴破乳，吸去剩余乳化層并添加pH 8.5的50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA使得水相體積保持在15 mL。向乳化后的水相中添加等體積的氯仿，充分混勻后8 000 r/min離心10 min保留下層水相。該步驟可重復(fù)一次以保證充分去除水相中的食用油，避免磁珠發(fā)生聚集降低產(chǎn)率。1 mL水相中加入550 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)27%PEG和6 mol/L NaCl溶液，100 μL 10%的SDS，30 μL磁珠，70℃水浴15 min。磁分離去除上清，并用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌磁珠3次，37℃烘箱15 min烘干后加入50 μL pH 7.3的10 mmol/Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，65℃水浴15 min。磁分離，吸取上清即為提取的糧油樣品DNA。研究所用磁珠為粒徑在400~500 nm，表面修飾的Fe3O4磁性材料，與市售磁珠相比分散性，磁相應(yīng)性更好，-COOH修飾的磁珠比-OH、-NH2修飾的磁珠相比提取效果更好。針對目前糧油DNA提取樣品量大、提取效率低的特點，首先采用轉(zhuǎn)相的方法將油中殘留DNA富集到水相，再利用磁珠超順磁性和快速、高效富集DNA的特點從較少糧油樣本中成功提取了DNA，方便后續(xù)采用PCR手段檢測糧油種屬特性、轉(zhuǎn)基因等。

1.3.4 糧油內(nèi)源基因?qū)崟r熒光PCR檢測方法的建立 磁珠提取食用油中DNA后參考1.3.1中的方法進行檢測，檢測結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳進行確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻、菜籽、稻米種子內(nèi)源基因?qū)崟r熒光PCR檢測方法建立及優(yōu)化

提取的種子基因組DNA經(jīng)微量紫外（Thermo scientific，上海）測定提取DNA的A260nm/A280nm均在1.7~1.9之間，質(zhì)量濃度在0.66~1.2 μg/L之間，滿足實驗需要。實驗采用的靶標(biāo)基因2S Albumin、SPS、PE3-PEPcase分別是芝麻、稻米、菜籽的內(nèi)源基因，具有種屬特異性，選用這些靶標(biāo)基因和對應(yīng)的引物進行PCR擴增檢測可以很好的區(qū)分不同糧油作物的品種，從而提高糧油品種鑒定的特異性和準(zhǔn)確性。引物濃度的優(yōu)化說明400 nmol/L/L時容易出現(xiàn)引物二聚體的情況；引物濃度在200 nmol/L/L時熒光信號強度適中，并可以減少引物二聚體的影響；引物濃度在100 nmol/L/L時熒光強度顯著下降至1 000左右。因此RT-PCR體系中最終使用的引物濃度為200 nmol/L/L。退火溫度對于擴增效率和減少引物二聚體影響較大，實驗發(fā)現(xiàn)對于芝麻基因組DNA擴增，60℃時RT-PCR效率較高。但對于稻米和油菜籽基因組DNA擴增，退火溫度為55℃時RT-PCR擴增效率比58℃和60℃時高。優(yōu)化后芝麻、菜籽、稻米種子內(nèi)源基因?qū)崟r熒光PCR的擴增條件見表3。

優(yōu)化后芝麻、菜籽、稻米種子內(nèi)源基因RT-PCR擴增曲線和溶解曲線如圖1所示。芝麻內(nèi)源基因2S Albumin RT-PCR擴增在33個循環(huán)以后的擴增梯度較差，產(chǎn)物的解鏈溫度為81.5℃。大米內(nèi)源基因SPS RT-PCR擴增在36個循環(huán)以后的擴增梯度較差，產(chǎn)物的解鏈溫度為81℃。油菜種子內(nèi)源基因PE3-PEPcase RT-PCR擴增在30個循環(huán)以后的擴增梯度較差，產(chǎn)物的解鏈溫度為83℃。單一的溶解溫度說明擴增的特異性較好，引物二聚體影響較小。

瓊脂糖凝膠電泳（圖2）分析實時熒光PCR擴增產(chǎn)物表明RT-PCR擴增產(chǎn)物均為單一條帶，擴增產(chǎn)量隨原始基因組濃度（自左向右）降低而降低；芝麻內(nèi)源基因2S Albumin擴增產(chǎn)物相對分子質(zhì)量在75 bp左右，與文獻(xiàn)報道66 bp一致[16]。大米內(nèi)源SPS基因擴增產(chǎn)物相對分子質(zhì)量在75~100 bp之間，與文獻(xiàn)報道81 bp一致[16]。油菜種子內(nèi)源PE3-PEPcase基因擴增產(chǎn)物相對分子質(zhì)量在100~150 bp之間。產(chǎn)物長度與文獻(xiàn)報道121 bp一致[17-18]。因此，芝麻、稻米、菜籽種子內(nèi)源基因?qū)崟r熒光PCR擴增體系成功建立，可以用于芝麻油、稻米油、菜籽油中內(nèi)源基因的擴增。

2.2 實時熒光PCR鑒定純芝麻油、菜籽油、稻米油糧油品種

純芝麻油、菜籽油、稻米油樣品均先采用磁珠法進行提取并用于RT-PCR檢測。擴增曲線，擴增產(chǎn)物的溶解溫度（圖3）以及瓊脂糖凝膠電泳（圖4）顯示檢測結(jié)果與對應(yīng)種子基因組擴增產(chǎn)物的溶解溫度和片段大小保持一致，進而說明測試的3種芝麻油、3種菜籽油、3種稻米油可以成功擴增出芝麻油、油菜籽、大米相應(yīng)的內(nèi)源基因。由于購買的食用油既有壓榨工藝也有溶劑浸出，說明不同工藝下的純芝麻油、菜籽油、稻米油中DNA均可以用已建立的磁珠法提取出來，并實現(xiàn)這3種食用植物油的品種的鑒定。

2.3 實時熒光PCR鑒定調(diào)和油中芝麻油、菜籽油、稻米油成分

為進一步驗證該方法可以鑒定糧油品種真實性，3種調(diào)和油糧油樣品均先采用磁珠法進行提取并用于RT-PCR檢測。擴增曲線，擴增產(chǎn)物的溶解溫度（圖5）以及瓊脂糖凝膠電泳（圖6）顯示3種調(diào)和油中均可以檢測到芝麻內(nèi)源基因，與商品標(biāo)簽標(biāo)識一致；僅福臨門五谷調(diào)和油可以檢測到大米內(nèi)源基因，與商品標(biāo)簽標(biāo)識一致（金龍魚調(diào)和油和香滿園調(diào)和油成分標(biāo)識中無稻米油成分）；3種調(diào)和油中均可以檢測到油菜內(nèi)源基因，其中金龍魚調(diào)和油和福臨門調(diào)和油與商品標(biāo)簽標(biāo)識一致，香滿園調(diào)和油中標(biāo)識未含有菜籽油但檢出菜籽油內(nèi)源基因，具體原因需要進一步確認(rèn)。所有檢測結(jié)果與對應(yīng)種子基因組擴增產(chǎn)物的溶解溫度和片段大小保持一致，表明測試的3種調(diào)和油中芝麻油、菜籽油、稻米油成分的內(nèi)源基因可以成功擴增出，進而實現(xiàn)對于調(diào)和油中糧油品種的鑒定。

3 結(jié)語

PCR方法鑒定糧油品種和摻假，具有適應(yīng)性強、易于推廣的優(yōu)點。食用油經(jīng)過壓榨、高溫或者化學(xué)溶劑處理，基因組DNA含量極低且多分解為小片段，普通的基因組DNA提取方法無法提取糧油樣品中的DNA。針對這些特點，作者首先通過乳化將油相中DNA轉(zhuǎn)移到水相中，再利用磁納米粒子的超順磁性以及其在高鹽濃度下可以特異性吸附DNA的特點進一步富集水相中DNA。該方法具有成本低、DNA富集效率高、樣本量小、簡便、適合高通量的特點。研究結(jié)果表明，經(jīng)實時熒光PCR檢測，市場上純芝麻油、菜籽油、稻米油以及調(diào)和油中的這些成分均可檢出，該方法為糧油品種真實性表征和摻假檢測提供了有效手段。

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科技信息

加拿大批準(zhǔn)廣布肉毒桿菌M35作為抑菌防腐劑

據(jù)加拿大衛(wèi)生部消息，10月13日加拿大衛(wèi)生部發(fā)布公告，批準(zhǔn)廣布肉毒桿菌（Carnobacterium divergens）M35作為防腐劑用于部分食品。

據(jù)了解，加拿大衛(wèi)生部收到一項食品添加劑申請，請求采用廣布肉毒桿菌M35抑制即食冷熏三文魚切片與即食冷熏鱒魚切片當(dāng)中的李斯特菌。

經(jīng)過相應(yīng)評估，加拿大衛(wèi)生部認(rèn)為，廣布肉毒桿菌M35作為李斯特菌抑制劑是安全的。加拿大衛(wèi)生部于6月7日就此發(fā)布提案，并設(shè)定了75天的評議期。在評議期內(nèi)，加拿大衛(wèi)生部收到一項意見，然而并未收到與加拿大衛(wèi)生部安全性評估不一致的資料。

因此，加拿大衛(wèi)生部批準(zhǔn)廣布肉毒桿菌M35作為抑制李斯特菌的防腐劑，用于即食冷熏三文魚切片與即食冷熏鱒魚切片。

［信息來源］食品伙伴網(wǎng).加拿大批準(zhǔn)廣布肉毒桿菌M35作為抑菌防腐劑[EB/OL].(2016-10-14).http://news. foodmate.net/2016/10/399565.html

Identification of Authenticity of Sesame Oil,Rapeseed Oil and Rice Oil Based on the Magnetic Beads

GE Wenliang1， WANG Wenbin2， XU Chuanlai2
（1.Wuxi No.2 People's Hospital，Wuxi 214002，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The detection of endogenous genes using PCR is one of the effective methods to detect the variety of edible vegetable oil and identify their adulteration.Due to the extremely low content of DNA in the refined oil,the effective extraction method to concentrate DNA is the crucial challenge concerning the authenticity identification based on PCR.The DNA concentrated method based on magnetic beads was established in this paper.DNA was extracted using this method from the edible oil including sesame oil,rapeseed oil and rice oil.Their endogenous genes was then characterized by real-time fluorescence PCR.The endogenous genes were successfully detected using concentrated DNA extracted after five emulsifications and further by magnetic beads.The results were further confirmed by the agarose gel electrophoresis.The qualitative identification of edible oil using magnetic beads was achieved.

Magnetic beads,PCR,edible vegetable oil,DNA extraction

TS 225.1；TS 207.3

A

1673—1689（2016）11—1224—08

2015-02-16

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAC01B07）。

葛文亮（1965—），男，江蘇無錫人，主任技師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)檢驗與免疫學(xué)研究。E-mail：2324999898@qq.com