副溶血性弧菌實時熒光單引物等溫擴增方法的建立

王建昌， 胡連霞， 段永生， 李 靜， 王金鳳

（河北出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心，河北 石家莊050051）

副溶血性弧菌實時熒光單引物等溫擴增方法的建立

王建昌， 胡連霞*， 段永生， 李 靜， 王金鳳

（河北出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心，河北 石家莊050051）

以副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）gyrB基因特異序列為靶序列，設計RNA-DNA組合引物和鏈終止序列，優(yōu)化反應體系，建立實時熒光單引物等溫擴增（Real-time fluorescence single primer isothermal amplification，實時熒光SPIA）檢測副溶血性弧菌的方法。實時熒光SPIA在40 min反應時間內(nèi)，對3株副溶血性弧菌和16株其他食源性致病菌進行實時熒光SPIA檢測，結(jié)果表明除3株副溶血性弧菌外，其他細菌均未擴增出熒光曲線。進一步研究表明，實時熒光SPIA檢測副溶血性弧菌純培養(yǎng)DNA的靈敏度為8.2 fg/μL，對副溶血性弧菌菌懸液的檢測靈敏度為13.5 CFU/mL；對鱈魚、海蟹、牡蠣和咸鴨蛋等4種模擬樣品中副溶血性弧菌的檢出限均為14.7 CFU/g。研究結(jié)果表明，實時熒光SPIA檢測副溶血性弧菌靈敏度高，特異性強，耗時短，方法簡便。

實時熒光單引物等溫擴增；副溶血性弧菌；gyrB基因

致病性弧菌是一類重要的食源性病原菌[1-2]，廣泛地存在于自然水環(huán)境，特別是海水中，對海產(chǎn)品有較大程度的污染。在弧菌屬中，危害較大或出現(xiàn)頻率較高的是O1型霍亂弧菌、副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌[3-4]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）最早是由Fujino等[5]于1953年從日本一個食物中毒患者初次分離得到的，是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，常呈多態(tài)性，有鞭毛，無莢膜和芽孢。在含3%～5%的食鹽培養(yǎng)基中，pH 7.5～8.5，37℃條件下生長最為良好并且對酸敏感。人食用污染有該菌的海產(chǎn)品后可引起急性胃腸炎，嚴重時還可引起敗血癥[6]。目前，在中國沿海地區(qū)的食物中毒病例中，副溶血性弧菌已成為微生物性食物中毒的首要病原菌[7]。快速準確地從海產(chǎn)食品中鑒定副溶血性弧菌，具有重要的醫(yī)學意義。

目前，食品中副溶血性弧菌檢驗主要依據(jù)GB 4789.7-2013，SN/T 0173-2010[8-9]對食品中的副溶血性弧菌進行檢測，大約需要3～7 d的時間，且容易出現(xiàn)交叉污染和假陽性。分子生物學技術(shù)具有快速、直觀、準確等優(yōu)勢，已在副溶血性弧菌檢測中得到廣泛應用[10-12]。隨著食品安全檢測標準的提高，尋找更加快速、準確、便捷的檢測技術(shù)顯得至關重要。

編碼促旋酶的 gyrB基因是單拷貝的看家基因，全長約為1.2～1.4 kb，平均堿基替換率為每100萬年變化0.7%～0.8%，比16S rDNA的每5 000萬年變化1%的速度快[13]。另外，由于其作為蛋白編碼基因，其所固有的遺傳密碼子的兼并性使得DNA序列可以發(fā)生較多的變異而不改變氨基酸序列，尤其是密碼子的第3位堿基，這就使得gyrB基因序列在區(qū)分和鑒定細菌近緣種方面[14]，比非蛋白編碼基因16S rDNA具有更高的分辨率。

單引物等溫擴增技術(shù) （Single primer isothermal amplification，SPIA）是近年報道的一種新型線性核酸等溫擴增技術(shù)[15]。該技術(shù)主要是通過一條3’端是DNA片段、5’端是RNA片段的組合引物、RNase H及具有強鏈置換活性的DNA聚合酶實現(xiàn)DNA的體外線性等溫擴增，經(jīng)過RNA降解、新引物結(jié)合、鏈置換的循環(huán)過程，實現(xiàn)模板互補序列的快速擴增，最終擴增出大量的具有高度忠實性的cDNA單鏈[16]。

作者在普通SPIA的基礎上，以副溶血性弧菌gyrB為靶基因，設計RNA-DNA組合引物和鏈終止序列，在單引物等溫擴增技術(shù)（SPIA）的基礎上加入熒光染料SYBER GreenⅡ，建立了實時熒光單引物等溫擴增（Real-time fluorescence SPIA）檢測副溶血性弧菌的方法。通過實時熒光分析儀對熒光信號進行實時檢測，具有操作簡單、耗時短、實時監(jiān)控等優(yōu)點。目前國內(nèi)外關于SPIA方法的報道比較少，實時熒光單引物等溫擴增方法更未見到報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 3株副溶血性弧菌和16株非副溶血性弧菌：分別購自美國典型菌種保藏中心（ATCC）、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（CMCC）；菌株2為河北國際旅行衛(wèi)生保健中心贈送；菌株3為參加CNCA能力驗證時分離。具體信息如表1所示。

1.1.2 主要試劑 BstDNA聚合酶、RNase H、RNA酶抑制劑、Mgcl2、dNTPs、SYBER GreenⅡ等購自于上海生工生物工程有限公司；基因組DNA提取試劑盒：購自北京天根生化科技有限公司；培養(yǎng)基：購自北京陸橋有限責任公司；鱈魚、海蟹、牡蠣和咸鴨蛋樣品：購自當?shù)爻小?/p>

1.1.3 主要設備 ABI7500實時熒光PCR儀：美國AB公司產(chǎn)品；PCR擴增儀 （Whatman T Gradient基因擴增儀）：德國Biometra公司產(chǎn)品；核酸蛋白分析儀（Eppendorf Biophotometer plus）：德國 Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.1.4 RNA/DNA組合引物和Blocker的設計和合成 根據(jù)Genebank中副溶血性弧菌gyrB基因 （基因號：KC542972.1）己知序列，對其進行同源性分析，確定其保守序列，用Primer premier5.0設計組合引物和相應鏈終止序列，如表2所示。組合引物和Blocker由大連TAKARA公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 副溶血性弧菌的培養(yǎng) 取保藏的副溶血性弧菌在CHROMID VIBRIO弧菌顯色培養(yǎng)基上進行劃線，恒溫箱36℃培養(yǎng)12 h，傳代培養(yǎng)2次。挑取單菌落接種至新鮮無菌的SPB肉湯中，36℃過夜培養(yǎng)。

1.2.2 副溶血性弧菌基因組DNA的提取 采用普通熱裂解法[17]、蛋白酶K法[18]、飽和酚提取法[19]和天根試劑盒法對純培養(yǎng)的副溶血性弧菌進行基因組DNA的提取，并測定濃度。

1.2.3 副溶血性弧菌實時熒光SPIA反應體系和反應條件的建立 建立副溶血性弧菌實時熒光SPIA檢測25 μL反應體系，優(yōu)化反應體系中RNA/DNA組合引物以期確定各組分的最佳工作濃度，建立副溶血性弧菌實時熒光SPIA最佳反應體系。

將副溶血性弧菌基因組DNA模板、組合引物、Blocker及反應緩沖液的混合液經(jīng)99℃，90 s處理后降溫至60℃，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在ABI7500實時熒光PCR儀上55~65℃，反應30~60 min（每循環(huán)30 s），反應過程中實時監(jiān)測熒光信號，以期確定最佳反應溫度和時間，建立副溶血性弧菌實時熒光SPIA檢測方法。

1.2.4 副溶血性弧菌實時熒光SPIA檢測方法的特異性分析 取表1中19株過夜培養(yǎng)菌懸液1 mL，用熱裂解法提取基因組DNA作為模板，根據(jù)1.2.3中所建立的反應體系和條件進行檢測，對所建立的實時熒光SPIA方法進行特異性分析。

1.2.5 不同模板DNA提取方法對副溶血性弧菌實時熒光SPIA檢測結(jié)果的影響 使用1.2.2中4種方法提取副溶血性弧菌基因組DNA，作為模板進行實時熒光SPIA檢測，以分析不同的DNA提取方法對檢測結(jié)果的影響。

1.2.6 副溶血性弧菌實時熒光SPIA檢測方法的靈敏性分析 挑取顯色培養(yǎng)基上36℃培養(yǎng)12 h的單菌落，制備成一定濃度菌懸液。用生理鹽水進行10倍系列稀釋，采用稀釋平板法，測定其純培養(yǎng)物活菌數(shù)為1.35×108CFU/mL；同時取1 mL上述菌懸液直接用熱裂解法提取副溶血性弧菌基因組DNA，測得DNA質(zhì)量濃度為82 ng/μL，用滅菌DEPC水進行10倍系列稀釋，進行SPIA靈敏性試驗。

1.2.7 副溶血性弧菌實時熒光SPIA檢測方法在模擬樣品中檢出限分析 在鱈魚、海蟹、牡蠣和咸鴨蛋樣品中分別添加副溶血性弧菌作為模擬污染樣品進行檢出限分析。進行添加前，鱈魚、海蟹、牡蠣和咸鴨蛋樣品已按GB 4789.7-2013常規(guī)檢驗法證實副溶血性弧菌陰性。挑取顯色培養(yǎng)基上36℃培養(yǎng)12 h的單菌落，制備成一定濃度菌懸液，用生理鹽水進行10倍系列稀釋后，選取系列稀釋濃度

菌懸液1 mL分別添加到各個樣品勻漿中（10 g樣品于90 mL質(zhì)量分數(shù)3%氯化鈉堿性蛋白胨水中）?；靹?，分別取1 mL模擬樣品，采用稀釋平板法，測定其活菌添加范圍為 1.47×105~1.47×10-2CFU/mL。同時分別取1 mL模擬樣品，直接用熱裂解法提取副溶血性弧菌基因組DNA，進行副溶血性弧菌實時熒光SPIA方法對模擬污染鱈魚樣品的檢出限分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血性弧菌實時熒光SPIA反應體系和反應條件的建立

如圖1所示，經(jīng)過各種反應體系和條件的優(yōu)化，設計合成的組合引物及Blocker（Pvrn+Bv）對副溶血性弧菌出現(xiàn)擴增曲線，且最佳反應體系為：RNA/DNA 組 合 Pirmer 5.6 μmol/L、Blocker 1.0 μmol/L、10×Bst Buffer 2.5 μL、Bst DNA polymerase 12 U、10×RNaseH Buffer 2.5μL、RNaseH 5 U、dNTPs 0.2 μmol/L、Mgcl25.0 μmol/L、RNase Inhibitor 16 U、DNA模板1 μL、SYBER GreenⅡ0.5 μL（300×稀釋），其余用滅菌DEPC水補足體系；最佳反應條件為57.0℃，反應40 min。

2.2 副溶血性弧菌實時熒光SPIA檢測方法的特異性分析

特異性試驗結(jié)果顯示，僅副溶血性弧菌出現(xiàn)典型的熒光擴增曲線，其他細菌檢測均未產(chǎn)生擴增曲線，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明作者建立的檢測方法具有良好的特異性。

2.3 不同模板DNA提取方法對副溶血性弧菌實時熒光SPIA檢測結(jié)果的影響

如圖3所示，使用所建立的副溶血性弧菌實時熒光SPIA檢測方法對4種不同方法提取的模板DNA進行檢測，均出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值（起峰時間）沒有明顯差異。結(jié)果表明，該方法檢測副溶血性弧菌時對模板質(zhì)量要求不苛刻，能適應廣大的基層和現(xiàn)場檢測。

2.4 副溶血性弧菌實時熒光SPIA檢測方法的靈敏性試驗

如圖4所示，當DNA模板用量為8.2×103~8.2 fg/μL時，即副溶血性弧菌濃度為1.35×103~1.35CFU/mL時，均出現(xiàn)典型的擴增曲線；當模板用量為0.82 fg/μL時，即副溶血性弧菌濃度為1.35 CFU/mL則無擴增曲線。該方法對副溶血性弧菌DNA的檢測靈敏度為8.2 fg/μL，對菌液的檢測靈敏度為1.35 CFU/mL。

2.5 副溶血性弧菌實時熒光SPIA檢測方法在模擬樣品中的檢出限試驗

對鱈魚、海蟹、牡蠣和咸鴨蛋4種樣品中人工添加的副溶血性弧菌進行了檢測。當4種樣品中副溶血性弧菌添加濃度為1.47×103~1.47 CFU/g時，均出現(xiàn)典型的擴增曲線，其平均Ct值如表3所示；當4種樣品中副溶血性弧菌添加濃度為1.47 CFU/g時，則均無擴增曲線。結(jié)果表明，該方法在鱈魚、海蟹、牡蠣和咸鴨蛋4種模擬樣品中檢出限均為14.7 CFU/g。3次重復試驗結(jié)果一致。

3 結(jié)語

侯曉麗等[20]對霍亂弧菌和副溶血弧菌分離菌株gyrB基因的系統(tǒng)發(fā)育關系分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)段的基因可以明顯區(qū)別開不同的菌株。Venkateswaran等[21]通過對1 258 bp的gyrB基因序列分析發(fā)現(xiàn)，副溶血性弧菌與溶藻弧菌的gyrB的相似率僅為86.8%，可以明顯區(qū)分出這兩種致病菌。Vuddhakul等[22]分析發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌與霍氏弧菌gyrB基的相似率為80%，可明顯看出兩者不同，而且用 PCR方法便可從其他菌中將霍氏弧菌鑒別出來。Kumar等[23]使用創(chuàng)傷弧菌的gyrB基因序列，設計特異引物可以快速準確地將該菌與其他種的弧菌或者非弧菌類微生物區(qū)分開，為該菌的檢測提供了便捷的方法。作者將副溶血性弧菌gyrB基因進行比對，找到保守序列設計組合引物和鏈終止序列，將副溶血性弧菌從其它弧菌中鑒定出來，特異性強。

作者建立的副溶血性弧菌實時熒光SPIA方法具有很好的敏感性和特異性，同時對模板DNA要求較低。

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Real-Time Fluorescence Single Primer Isothermal Amplification Established for the Vibrio parahaemolyticus Detection

WANG Jianchang， HU Lianxia*， DUAN Yongsheng， LI Jing， WANG Jinfeng
（The Technical Center of Inspection and Quarantine，Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shijiazhuang 050051，China）

The RNA-DNA primers and blockers were designed and synthesized based on the Vibrio parahaemolyticus gyrB gene.The reaction system was optimized.The real-time fluorescence single primer isothermal amplification （real-time fluorescence SPIA）was established for the detection of Vibrio parahaemolyticus.The typical fluorescence curves were observed for only 3 strains of Vibrio parahaemolyticus in the real-time fluorescent SPIA detection of 3 strains of Vibrio parahaemolyticus and 16 strains of other food borne bacteria within 40 mins.Further studies showed that the sensitivity of real-time fluorescent SPIA for the detection of Vibrio parahaemolyticus DNA in pure culture was 8.2 fg/μL，while 1.35×101CFU/mL for Vibrio parahaemolyticus bacteria suspension and 14.7 CFU/g for Vibrio parahaemolyticus in four simulated sample of codfish，crab，oysters and salted duck egg.The real-time fluorescence SPIA detection was demonstrated as a convenient method for the detection of Vibrio parahaemolyticus with high sensitivity，strong specificity and time saving.

real-time fluorescence SPIA，Vibrio parahaemolyticus，gyrB gene

TS 254.7

A

1673—1689（2016）11—1212—07

2015-01-14

國家質(zhì)檢公益性科研專項項目（201210128；201310126）。

王建昌（1981—），男，山東臨朐人，農(nóng)學博士，高級獸醫(yī)師，主要從事動物疫病病原、食源性致病菌的分子生物學檢測研究。E-mail：jianchangwang1225@126.com

*通信作者：胡連霞（1972—），女，河北石家莊人，高級工程師，主要從事有害微生物檢測控制研究。E-mail：hulianxia168@163.com