復合酶條件優(yōu)化對煙梗品質提升研究

楊乾栩， 和智君， 楊 蕾， 張?zhí)鞐潱?曽曉鷹， 王保興， 楊 清*

（1.云南中煙工業(yè)有限責任公司 技術中心，云南 昆明 650231；2.昆明理工大學 環(huán)境科學與工程學院，云南 昆明650500）

1.2.3 緩沖溶液配置 精確稱量檸檬酸19.21 g，檸檬酸鈉29.41 g，分別加入1 L純凈水，即配置為0.1 mol/L緩沖溶液。量取0.7、3.2、4.6、5.7、6.6、8.0、9.3和10.0 mL的檸檬酸，并分別加入9.3、6.8、5.4、4.3、3.4、2.0、0.7和0.0 mL的檸檬酸鈉中，即配置得pH分別為6.6、5.4、4.8、4.4、4.0、3.4、3.0、2.0的檸檬酸-檸檬酸納緩沖溶液。

1.2.4 單一酶作用參數考察 稱量果膠酶、酸性蛋白酶、纖維素酶各960 mg，分別溶解于60 mL緩沖溶液中為母液，其中果膠酶和酸性蛋白酶分別溶于pH3.4的緩沖溶液，纖維素酶溶于pH 4.8的緩沖溶液；將各母液依次二倍稀釋為16，8，4，2，0.4 mg/ mL。取30 mL酶液，噴灑于120 g煙梗上，此時每個煙梗中酶質量分數為 0.4%，0.2%，0.1%，0.05%，0.01%；將處理后的煙梗裝密封袋，于48℃下，保存6~24 h。

1.2.5 單一酶水解模型建立 通過單一酶作用參數試驗，確定每個酶作用的最佳濃度和時間后，固定每個酶作用時間為所有酶中最優(yōu)作用時間最長者為準，作弄濃度為每個酶各自的最優(yōu)濃度，考察不同pH和溫度條件下，每個酶的水解率。

水解率=（對照樣品被檢測物質質量分數-被檢測物質質量分數）/對照樣品被檢測物質質量分數

試驗所選3種酶的pH和溫度范圍分別為2.5~ 6.0，10~60℃，最優(yōu)pH值和溫度分別是3.5~4.8，50℃，因此試驗參數圍繞此范圍設定如下均勻試驗（見表2）。

復合酶條件優(yōu)化對煙梗品質提升研究

楊乾栩1， 和智君1， 楊 蕾2， 張?zhí)鞐?， 曽曉鷹1， 王保興1， 楊 清*1

（1.云南中煙工業(yè)有限責任公司 技術中心，云南 昆明 650231；2.昆明理工大學 環(huán)境科學與工程學院，云南 昆明650500）

為提升煙梗品質，降低煙梗中大分子蛋白質、果膠和纖維素含量，發(fā)展了煙梗的酸性蛋白酶-果膠酶-纖維素酶的復合酶水解方法，并采用全局搜索方法對復合酶的水解條件進行了優(yōu)化和驗證。結果表明：不同酶對不同參數的響應不同，3個酶對pH均很敏感，尤以酸性蛋白酶最為敏感，作用區(qū)間較窄，果膠酶和纖維素酶對溫度較為敏感，酸性蛋白酶受溫度影響較小。整體上，3個酶在限定范圍內達到最優(yōu)水解率時的作用參數均不相同；參數優(yōu)化后的復合酶對煙梗中的大分子物質具有較好的水解效果，總水解效率達28.34%，且感官品質較好；復合酶處理后的煙梗，其品質提升較為明顯；結合工業(yè)生產特點，感官品質需求，及煙梗中蛋白、果膠和纖維素含量特點，可以有目的的在限定條件下優(yōu)化煙梗水解效率及方向。

復合酶；參數優(yōu)化；煙梗；水解率

煙梗是卷煙生產中重要的副產物，約占煙葉的20%~25%。由于添加煙梗的卷煙其木質氣嚴重、灼熱感較強、刺激性較大，極大限制了煙梗的使用，使得煙梗的利用率一直較低，造成了資源的浪費。

從化學成分的角度來看，煙梗具有與煙葉基本一致的化學信息，但不同成分含量差異顯著。其中，煙梗中含量明顯高于煙葉且對感官品質不利的主要成分有木質素、纖維素、蛋白、果膠等大分子含量顯著高于煙葉（圖1）。因此發(fā)展可降低煙梗中主要大分子含量的方法，對轉化煙?；瘜W成分向煙葉趨近，提升煙梗品質有重要作用。由于酶的選擇專一性，因此煙梗的酶前處理研究也是煙梗前處理的研究熱點[1-5]。

通過已有研究不難發(fā)現，單一酶由于可以最大條件調節(jié)其作用參數，因而對其目標降解物具有較強的水解效果。復合酶在作用時，雖然每個酶不能達到各自最大的水解效果，但由于不同酶的共同作用，其整體水解后煙?；蚬＝z品質往往具有較大提升，在生產中應用往往應用更大。然而從目前的煙梗酶水解參數選擇研究來看，均是通過有限次數的水解參數試驗選定較優(yōu)的參數組合，未考慮到不同參數間的交互作用。針對目前研究尚存在的不足，作者發(fā)展了基于酶水解數學模型的復合酶的參數優(yōu)化方法，并根據不同的條件優(yōu)化了復合酶作用的水解參數。研究結果表明，數學模型可以從一定范圍內對單酶和復合酶水解效果有較好的擬合效果。根據模型，并結合實際情況，可以在限定條件下考察復合酶的最佳水解條件，達到最佳水解效率。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

2008年紅大GBBX煙梗：紅河卷煙廠產品；酸性蛋白酶，果膠酶，纖維素酶：和氏璧生物試劑公司產品。

Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司產品；XP404S型電子天平 （感量：0.1 mg）：瑞士Mettler Toledo公司產品。

1.2 方法

1.2.1 實驗酶選擇 根據和氏璧生物試劑公司官網提供的酶最優(yōu)參數范圍（表1），以pH和溫度為主要參考因素，結合最終復合酶所需的參數一致性原則，選擇果膠酶（pH 3.2~5.0，10~50℃），纖維素酶（pH 4.0~5.5，30~60℃），酸性蛋白酶 （pH 2.5~ 6.0，10~55℃）為最終的試驗酶。

1.2.2 蛋白質、果膠、纖維素檢測方法 蛋白質的測定參照 《煙草及煙草制品 蛋白質的測定 連續(xù)流動法》YC/T 249-2008進行；果膠的測定參照文獻[4-5]的相關方法進行；樣品中的纖維素的測定參照《煙草及煙草制品中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸洗木質素的測定洗滌劑法》YC/T 347-2010進行。

1.2.3 緩沖溶液配置 精確稱量檸檬酸19.21 g，檸檬酸鈉29.41 g，分別加入1 L純凈水，即配置為0.1 mol/L緩沖溶液。量取0.7、3.2、4.6、5.7、6.6、8.0、9.3和10.0 mL的檸檬酸，并分別加入9.3、6.8、5.4、4.3、3.4、2.0、0.7和0.0 mL的檸檬酸鈉中，即配置得pH分別為6.6、5.4、4.8、4.4、4.0、3.4、3.0、2.0的檸檬酸-檸檬酸納緩沖溶液。

1.2.4 單一酶作用參數考察 稱量果膠酶、酸性蛋白酶、纖維素酶各960 mg，分別溶解于60 mL緩沖溶液中為母液，其中果膠酶和酸性蛋白酶分別溶于pH3.4的緩沖溶液，纖維素酶溶于pH 4.8的緩沖溶液；將各母液依次二倍稀釋為16，8，4，2，0.4 mg/ mL。取30 mL酶液，噴灑于120 g煙梗上，此時每個煙梗中酶質量分數為 0.4%，0.2%，0.1%，0.05%，0.01%；將處理后的煙梗裝密封袋，于48℃下，保存6~24 h。

1.2.5 單一酶水解模型建立 通過單一酶作用參數試驗，確定每個酶作用的最佳濃度和時間后，固定每個酶作用時間為所有酶中最優(yōu)作用時間最長者為準，作弄濃度為每個酶各自的最優(yōu)濃度，考察不同pH和溫度條件下，每個酶的水解率。

水解率=（對照樣品被檢測物質質量分數-被檢測物質質量分數）/對照樣品被檢測物質質量分數

試驗所選3種酶的pH和溫度范圍分別為2.5~ 6.0，10~60℃，最優(yōu)pH值和溫度分別是3.5~4.8，50℃，因此試驗參數圍繞此范圍設定如下均勻試驗（見表2）。

1.2.6 水解模型建立及參數估計 采用Levenberg-Marquardt算法，以均方根（RMSE）和R2（R-Square）為目標函數，選擇適合每個酶的關于pH和水解溫度的最佳數學模型。

1.2.7 復合酶解參數優(yōu)化 采用全局搜索算法（GlobalSearch），以水解率倒數為目標函數，對復合酶水解方程在限定條件下進行最大值求解。

1.2.8 感官評價 參照《卷煙 第四部分：感官技術要求》（GB5606.4-2005）對煙梗樣品進行感官評價分析。

2 結果與分析

2.1 酶作用時間及濃度考察

圖2反映了不同酶隨作用時間及作用濃度的水解效率變化。從圖中來看，不同參數對不同酶的影響不盡相同。酸性蛋白酶水解效率從6~24 h逐漸增加，但增長率有所減少。但在酶質量分數0.01%至0.4%范圍內穩(wěn)步增加，且增長率亦逐步增加；對于果膠酶，其在低質量分數和作用時間較低時的水解效率均較低且誤差較大，在較長作用時間和較大質量分數時，可達到12%左右的水解率；纖維素酶水解效率與水解時間的關系同酸性蛋白酶較為相似，但從酶質量分數來看，其水解效率則隨酶使用質量分數先增加后減小，但整體差異并不明顯。

從上面的分析來看，3個酶的作用時間均在24 h時，具有較好的水解效率。酸性蛋白酶和果膠酶作用質量分數為0.4%時，纖維素酶的作用質量分數為0.05%時，具有較好的水解效率。通過作用參數的單因素分析，確定了下一步每個酶作用的時間及質量分數。

2.2 單一酶水解方程

表3是固定水解時間為24 h，酸性蛋白酶和果膠酶質量分數為0.4%，纖維素酶質量分數為0.05%時，3個酶在不同pH和溫度條件下的水解率。

圖3反映了3個酶的水解率關于pH和水解溫度的三維網狀圖。從圖中來看，酸性蛋白酶的水解率受pH影響極大，其適合pH范圍在3.4~4.1間，此區(qū)間水解率為9%~12%，當pH為3.7時，達到最大水解率12.1%，溫度對酸性蛋白酶水解率影響極?。▓D3（a））；果膠酶的最適pH范圍在3.0~4.2之間，最適溫度在35~55℃，此區(qū)間水解率為9%~ 10%，其中在水解溫度46℃，pH 3.5時，達到最大水解率9.9%（圖3（b））；纖維素酶的最適pH范圍在2.9~3.9之間，最適溫度在34~50℃，此區(qū)間水解率大于9%，其中在水解溫度42.5℃，pH 3.3時，達到最大水解率9.7%（圖3（c））。

整體上pH對3個酶的水解率影響較大，尤其對酸性蛋白酶的影響最大，在pH 3.0~4.5范圍之外，水解率已小于4%，只有接近1.5個pH跨度的有效區(qū)間，而對于果膠酶和纖維素酶，則有接近3~4個跨度的區(qū)間；溫度對3個酶的水解率影響較少，尤其對酸性蛋白酶幾乎沒有影響。在試驗范圍內，溫度對果膠酶和纖維素酶的水解率都呈現逐漸遞減的效果。

2.3 復合酶水解參數優(yōu)化

3酶混合后，作用時間設置為24 h，各酶的質量分數設置為各自的最優(yōu)質量分數，在不考慮存在的協(xié)同效應時，如果定義總水解率為蛋白質水解率、果膠水解率和纖維素水解率之和，則總水解率方程如下：

可以看出，由于蛋白質水解率、果膠水解率、纖維素水解率均是關于溫度T和pH的函數，煙梗的總水解率實際上也是關于溫度T和pH的函數。

圖4是煙?？偹饴赎P于水解溫度和水解pH的等高線圖。從圖中來看煙梗的總水解率，在實驗范圍內與水解溫度和水解pH均表現為開口朝上的拋物線關系，說明在實驗范圍內，煙?？偹饴逝c水解溫度和水解pH均表現為先增加后減小的關系，在試驗參數范圍內，煙?？偹饴视凶畲笾怠?/p>

從影響作用大小上來看，沿pH方向的等高線較密，變化較快，反映pH對煙梗總水解率影響較大，而相應的水解溫度對煙梗總水解率影響較小。說明整體上，pH對復合酶的影響較為重要，需要嚴格控制。

采用全局搜索算法（GlobalSearch）對煙?？偹饴蔬M行最大值求解，參數設置為：初始值[25，3]，最低邊界[20，1]，最高邊界[70，7]。經全局算法搜索，當水解溫度為43.8°C，水解pH為3.7時，具有最大的水解效率達31.64%，此時煙梗中蛋白質、果膠和纖維素的水解率分別為12.09%、9.9%和9.65%。

2.4 復合酶處理的煙?；瘜W成分

表4是，在溫度43.8℃，pH 3.7條件下，煙梗經復合酶處理后的果膠、蛋白質和纖維素的理論水解值和實際水解情況比較結果。

實際檢測結果表明，蛋白質、果膠和纖維素的水解率的理論值要略小于實際值，其原因可能是復合酶的構建，使得酶的實際作用濃度小于其理論濃度。從總水解率差異來看，作者構建的復合酶水解模型，可以較好的預測總水解率，具有較強的應用價值。

2.5 復合酶處理梗絲品質

按照優(yōu)化后的參數，對煙梗進行了復合酶處理，并對處理前后的煙梗制絲后進行了其感官品質分析，其中總分的計算參照下面公式：

感官質量總分=（香氣質×0.3+香氣量×0.3+雜氣×0.08+刺激性×0.15+余味×0.17）×11.1

從表5可見，經復合酶處理后煙梗的感官質量總分上提升約2分，其中在雜氣改善、刺激性降低和余味上提升明顯，具有較好的應用前景。

3 結語

作者研究了復合酶限定條件下的水解參數優(yōu)化方法，在較少的試驗次數下，即可實現對復合酶最大水解效率時水解參數的準確估計，避免了單因素參數試驗的結果不準確性。結果表明：酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶對pH均比較敏感，對溫度則只要在70℃下，效果均較好。整體上，3個酶在限定范圍內達到最優(yōu)水解率時的作用參數均不相同；經水解參數優(yōu)化后，復合酶的總水解效率達28.34%，且感官品質較好；經復合酶處理后的煙梗，其感官品質提升較為明顯，可用性提升較大；如果結合工業(yè)生產特點，感官品質需求，及煙梗中蛋白、果膠和纖維素含量特點，設定最合理的目標函數，可以有目的的在限定條件下優(yōu)化煙梗水解效率及方向。

[1]林凱.酶法對煙梗絲降解效果的研究[J].安徽農業(yè)科學，2011，39（11）：6500-6501. LIN Kai.Research on degradation effect of tobacco stem-silk by enzyme treatment[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences，2011，39（11）：6500-6501.（in Chinese）

[2]周瑢，陶紅，沈光林，等.堿氧與酶處理改善梗絲性質的研究[J].現代食品科技，2010，26（5）：463-465. ZHOU Rong，TAO Hong，SHEN Guanglin，et al.Using alkaline-hydrogen peroxide and enzymic treatment to improve the quality of cut stem[J].Modern Food Science&Technoloogy，2010，26（5）：463-465.（in Chinese）

[3]戴麗君，施建在，鄭彬，等.應用復合酶工藝技術提高煙梗浸膏品質的研究[J].江西農業(yè)學報，2012，24（6）：135-138. DAI Lijun，SHI Jianzai，ZHENG Bin，et al.Study on applying complex enzyme technology to improve quality of tobacco stem concentrated solution[J].Acta Agriculturae Jiangxi，2012，24（6）：135-138.（in Chinese）

[4]徐志強，陳開波，蔡兵，等.酶解-流動分析法測定煙草中的果膠含量[J].煙草科技，2005（9）：26-28. XU Zhiqiang，CHEN Kaibo，CAI Bin，et al.Determination of pectin in tobacco with enzymolysis-autoanalyzer[J].Tobacco Science&Technology，2005（9）：26-28.（in Chinese）

[5]孔浩輝，程志穎，郭璇華，等.煙草中果膠含量連續(xù)流動測定方法的改進[J].煙草科技，2014（2）：57-60. SUN Haohui，CHENG Zhiying，GUO Xuanhua，et al.Improvement of continuous flow method for determining pectin in tobacco [J].Tobacco Science&Technology，2014（2）：57-60.（in Chinese）

科技信息

韓國天然氨基酸制造技術取得成功

2016年10月9日首爾韓聯社報道，韓國食品研究院功能性食品研究總部金鐘泰博士研究組的天然肉類蛋白質“氨基20”（amino 20）生產技術取得成功。

本次新開發(fā)的天然肉類蛋白質“氨基20”采用高壓酶加水分解技術，將日常生活中不太受人們歡迎的豬牛后腿肉、雞胸脯肉等保證其不氧化、不腐爛的環(huán)境下迅速合成蛋白質。這種天然蛋白質含有人類身體必需的9種 氨基酸和非必需的11種氨基酸。另外，和原有的氨基酸相比，天然氨基酸更容易被人體吸收，對消化不良患者及老弱病殘有著很好的治療效果。

該項研究將申請國際專利2項，并在韓國國內注冊專利完畢后進行產業(yè)技術轉讓，預計2017年開始正式投入商業(yè)化生產。據預測，2018年蛋白質銷售市場將實現40兆韓幣的市場價值。

［信息來源］食品伙伴網.韓國天然氨基酸制造技術取得成功 [EB/OL].(2016-10-11).http://news.foodmate.net/2016/ 10/399028.html

Optimization of Mixed Enzymes to Improve the Quality of Tobacco Stems

YANG Qianxu1， HE Zhijun1， YANG Lei2， ZHANG Tiandong1，ZENG Xiaoying1， WANG Baoxing1， YANG Qing*1
（1.R&D Center，China Tobacco Yunnan IndustrialCo.，Ltd.，Kunming 650231，China；2.College of Enviromental Science and Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

The study aimed to optimize the hydrolysis parameters for mixed enzymes to improve the quality of tobacco stems and reduce the contents of macromolecules protein，pectin and cellulose. Results showed that acid protease was more sensitive to pH than pectease and cellulase but much less affected by temperature.The optimized parameters resulted in the better degradation of macromolecules with a total hydrolysis efficiency of 28.34%and significantly improved the sensory quality of tobacco stems.These indicated that hydrolysis rate and direction of tobacco stems could be changed according to industrial manufacturing，the requirement of sensory quality and the contents of macromolecules.

mixed-enzyme，parameter optimization，tobacco stems，hydrolysis rate

TS 4

A

1673—1689（2016）11—1206—06

2015-01-02

云南中煙工業(yè)有限責任公司科技項目（20146CP03，2013GY02）。

楊乾栩（1987—），男，內蒙古呼倫貝爾人，理學博士，工程師，主要從事煙草化學、香精香料研究。E-mail：18314300710@126.com

＊通信作者：楊 清（1973—），男，云南紅河人，理學碩士，高級工程師，主要從事卷煙產品開發(fā)研究。E-mail：hkkxl@tom.com