DNA技術(shù)中的設(shè)計(jì)進(jìn)展

張玲，王武

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

DNA Origami的操作涉及到：畫出目的物構(gòu)象輪廓；把目標(biāo)構(gòu)象演化為DNA分子折疊結(jié)構(gòu)；按照堿基配對原則，設(shè)計(jì)一級(jí)序列，退火處理，使DNA序列內(nèi)部自動(dòng)配對成型；對關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)加以“訂書釘”固定，即可得到預(yù)期的折紙納米結(jié)構(gòu)。對目的物成型效果的觀察則需要?jiǎng)佑孟冗M(jìn)的技術(shù)，如，超微掃描電鏡、同位素顯影分析、嵌合熒光指示物的熒光檢測等。目前，多款DNA折紙術(shù)結(jié)構(gòu)的軟件成熟，可指導(dǎo)折疊出更為復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)（如圖4）[29-30]。

DNA技術(shù)中的設(shè)計(jì)進(jìn)展

張玲，王武*

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

20世紀(jì)后半葉，隨著蛋白質(zhì)與核酸測序技術(shù)的問世，人類所掌握的生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的信息量暴漲，并逐漸進(jìn)入了理性設(shè)計(jì)序列，以達(dá)到建構(gòu)生物大分子功能性三級(jí)結(jié)構(gòu)的自由王國。隨著21世紀(jì)的到來，得益于多學(xué)科交叉集成，DNA技術(shù)中的創(chuàng)新性設(shè)計(jì)智慧此起彼伏。人類成功重裝了低等生命的基因組，設(shè)計(jì)基因組底盤、構(gòu)建人工進(jìn)化平臺(tái)，推出CRISPR基因編輯術(shù)，發(fā)明DNA折紙術(shù)，精確自組裝納米級(jí)三維DNA材料。另外，可將設(shè)計(jì)學(xué)的立體構(gòu)成原理與基于用戶體驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法應(yīng)用于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫建設(shè)。

DNA技術(shù)；設(shè)計(jì)智慧；基因組底盤；CRISPR；立體結(jié)構(gòu)；DNA折紙術(shù)

20世紀(jì)后半葉，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，蛋白質(zhì)與核酸測序技術(shù)的問世，人類所掌握的生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的信息量暴漲，生命科學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法學(xué)發(fā)生了翻天覆地的變化，研究內(nèi)涵的深度大大超乎原先的期待。生物技術(shù)本身跳出了“生物化學(xué)”、“分子生物學(xué)”的范疇，向物理學(xué)、立體幾何學(xué)、拓?fù)鋵W(xué)、微電子學(xué)等領(lǐng)域?qū)で蠼蝗?。在探知生物大分子結(jié)構(gòu)，重建新的生命功能的過程中，科學(xué)家應(yīng)用了設(shè)計(jì)學(xué)理論與方法，從定位剪接、巧妙拼合DNA序列，到全新設(shè)計(jì)生物大分子一級(jí)序列，以達(dá)到建構(gòu)大自然不存在的功能性蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的自由王國，可以說DNA測序、DNA人工合成、分子克隆、基因重組、人類基因組計(jì)劃等技術(shù)進(jìn)步的過程中，不時(shí)閃現(xiàn)出喜人的設(shè)計(jì)光芒。

進(jìn)入21世紀(jì)后，生物技術(shù)更是得益于多學(xué)科的交叉集成，創(chuàng)新設(shè)計(jì)思維此起彼伏，其中包括了人類精心設(shè)計(jì)、重新組合序列的支原體基因組，呈現(xiàn)出生命機(jī)能；基因工程師可以像設(shè)計(jì)電氣線路那樣，重新設(shè)計(jì)基因的線路（Genetic Circuit），以期待實(shí)現(xiàn)代謝的功能流程。這些設(shè)計(jì)的遺傳工程機(jī)器、基因組底盤等為合成生物學(xué)發(fā)展起到推進(jìn)作用；發(fā)明CRISPR基因編輯術(shù)，構(gòu)建出魔性手術(shù)刀，可用以剔除壞基因或抵制外源基因的惡性植入；發(fā)明DNA折紙術(shù)，自組裝精確折合成疊的納米級(jí)三維DNA材料；另外，可將設(shè)計(jì)學(xué)的立體構(gòu)成原理與基于用戶體驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法應(yīng)用于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫建設(shè)?？偨Y(jié)設(shè)計(jì)學(xué)與生物技術(shù)的交融互動(dòng)的成果，有助于從設(shè)計(jì)理論和方法學(xué)的維度，為生物技術(shù)發(fā)展開拓出更加寬闊的創(chuàng)新空間。

1 基因技術(shù)領(lǐng)域經(jīng)典的設(shè)計(jì)智慧

應(yīng)用物理學(xué)、立體幾何學(xué)、拓?fù)鋵W(xué)、邏輯學(xué)等原理，進(jìn)行藝術(shù)創(chuàng)作是現(xiàn)代設(shè)計(jì)學(xué)的新手段。了解功能DNA分子的立體幾何構(gòu)象和微尺度，為精準(zhǔn)研判DNA序列、結(jié)構(gòu)和功能的對應(yīng)關(guān)系奠定了不可或缺的基礎(chǔ)。后續(xù)人們對DNA的處理，實(shí)際上就是從點(diǎn)、線、面、體的對應(yīng)關(guān)系入手，進(jìn)行巧妙的結(jié)構(gòu)與重組，甚至立體構(gòu)成操作。20世紀(jì)70年代出現(xiàn)的基因工程的三大基本技術(shù)是：DNA分子切割與鏈接；分子克隆與表達(dá)；DNA序列測序。

1.1 “標(biāo)記”設(shè)計(jì)帶來DNA克隆技術(shù)的突飛猛進(jìn)

除了DNA重組的剪接技術(shù)外，“遺傳標(biāo)記設(shè)計(jì)”是基因工程中最重要的機(jī)巧，它涉及到重組子的直觀篩選。分子克隆與表達(dá)技術(shù)的成功，在很大的程度上得益于克隆載體裝入了理想的“標(biāo)記”。簡單的一類遺傳標(biāo)記是抗生素抗性基因，如分別降解氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素的水解酶基因安插入隆載體后，在抗生素平板上能夠生長的可能是目的克隆子。另一個(gè)經(jīng)典的遺傳“標(biāo)記”例子是藍(lán)白斑篩選標(biāo)記，質(zhì)粒載體DNA中裝有大腸桿菌lac操縱子的lacZ'基因，其帶有人工合成的多位點(diǎn)插入序列，當(dāng)外源基因插入此處后，用含有誘導(dǎo)物IPTG和底物類似物X-gal（也是一種顯色劑）的培養(yǎng)基篩選克隆子，若lacZ'基因中間插入一段外來的基因序列，則破壞了lacZ'編碼的半乳糖苷酶活性，出現(xiàn)的克隆子菌落呈白色。若外源基因插入失敗，則半乳糖苷酶活性未破壞，X-gal被水解致使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。還有后期開發(fā)的熒光標(biāo)記等，這類“色別標(biāo)記”的系統(tǒng)設(shè)計(jì)非常智慧，使得克隆操作者很方便地甄別陽性克隆子。

1.2 DNA測序原理設(shè)計(jì)充滿智慧

就像 “0與1”二進(jìn)制帶來海闊天空的信息世界，生物基因組DNA的A、T、G、C共4個(gè)單元組成了卷帙浩繁的生命天書，DNA測序技術(shù)似 “芝麻開門”咒語，成為打開生命知識(shí)寶庫的金鑰匙。40年來，DNA測序的設(shè)計(jì)真正體現(xiàn)了多學(xué)科交叉的成功。

諾獎(jiǎng)大師Gilbert拋出的Maxam－Gilbert化學(xué)降解法[1]，一反化學(xué)降解反應(yīng)追求完全徹底的思路，盡可能將反應(yīng)條件控制為，使得單個(gè)DNA分子序列上僅有個(gè)別的堿基斷裂。將待測DNA序列分為4組，設(shè)置4種對應(yīng)的斷鏈反應(yīng)條件，事先為DNA分子打上單端同位素標(biāo)記后，4組DNA隨機(jī)斷鏈混合物經(jīng)凝膠電泳分離，呈現(xiàn)出長短不一的條帶，4組斷鏈條帶的接龍，就讀出了DNA堿基排列。另一經(jīng)典測序技術(shù)，是Sanger雙脫氧核苷酸補(bǔ)鏈終止法[2]。樣品打上同位素或熒光標(biāo)記，分A、T、C、G 4組，帶引物的酶法補(bǔ)鏈體系中，加如少量分組對應(yīng)的雙脫氧核苷三磷酸（ddTNP）作為補(bǔ)鏈終止劑，理論上每條模板鏈的任何一個(gè)堿基的對側(cè)可能補(bǔ)上某種ddTNP終止劑，4組補(bǔ)鏈的終結(jié)果就形成了長短不一、互相接龍的條帶分布。經(jīng)顯影后，就能讀出補(bǔ)鏈片段的堿基排列順序。Sanger測序法得到了廣泛的應(yīng)用，在此基礎(chǔ)上誕生出核酸序列自動(dòng)測定儀。

為滿足高通量、低成本的DNA測序需求，創(chuàng)新設(shè)計(jì)的探針芯片測序法，如寡核苷酸微矩陣DNA測序法（Oligonucleitide Array）[3-4]。如基于八聚核苷酸的全排列探針庫與目標(biāo)DNA雜交的設(shè)計(jì)思路，使每條探針定點(diǎn)固定于微芯片中的不同點(diǎn)陣，全排列的八聚核苷酸探針種類為65 536種。理論上能夠與目標(biāo)DNA雜交的8位核苷酸序列的落點(diǎn)代表著確定的序列信息，經(jīng)過計(jì)算機(jī)接龍后，目標(biāo)DNA中的全序很快就讀出。這種方法速度快，效率高，適于測定不太長（小于10 000核苷酸）的片段，用于檢測DNA序列中的變異點(diǎn)非常便捷，但這種方法難以應(yīng)用于長序列、重復(fù)序列，乃至基因組全序的測定。

納米孔單分子測序技術(shù) （Single Molecule Sequencing，SMS）[5-6]，無需對DNA進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)處理，基于單鏈DNA分子穿過納米孔通道而進(jìn)行測序，4種不同的堿基穿過通道口所引起的電化學(xué)參數(shù)變化可檢測，單鏈DNA的堿基序列就能快速讀?。ㄒ妶D1）。牛津大學(xué)科學(xué)家已經(jīng)根據(jù)此原理，開發(fā)出微型MinIon DNA測序儀，盡管對DNA長鏈測序的準(zhǔn)確率還有待提高，但已在很大的程度上提高了測序的速度和效率。同樣的原理又被美國亞利桑那州立大學(xué)開發(fā)成肽鏈測序技術(shù)。DNA測序技術(shù)在短短的40年內(nèi)，不斷設(shè)計(jì)創(chuàng)新，實(shí)現(xiàn)了從技術(shù)到效益的跨越突破，為高通量、快速讀取“生命天書”的所有信息密碼奠定了重要的基礎(chǔ)。

2 簡單生命基因組的減負(fù)和重排設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)生命曾是生命科學(xué)家的夢想?！叭绻讶梭w比作一臺(tái)計(jì)算機(jī)，DNA就是其中的軟件。軟件被編輯好后，轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)就會(huì)按照預(yù)定的編輯程序進(jìn)行”。在徹底摸清生命基因組序列與基因功能，有效鑒別必須基因和非必需基因的前提下，重新整理基因組序列，壓縮基因與基因之間的空檔區(qū)域，調(diào)整基因位點(diǎn)（loci）排列順序，設(shè)計(jì)出更合理的基因路線圖，優(yōu)化蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控元件等，設(shè)計(jì)生命已經(jīng)有了技術(shù)上的可行性。

2.1 人造細(xì)胞設(shè)計(jì)——全合成的基因組呈現(xiàn)生命功能

隨著史上最小的生物——生殖支原體（Mycloplasma Genitalium）的基因組測序完成，很多科學(xué)家開始關(guān)注于比較基因組學(xué)的概念，并萌生出合成最原始、最簡單、最緊湊的生物細(xì)胞基因組的理念，這是基因組裝工程的起點(diǎn)。

2010年5月，美國生物學(xué)家J.Craig Venter等在《Science》雜志發(fā)表了題為：“由化學(xué)合成基因組控制的細(xì)胞”的報(bào)道[7]。該團(tuán)隊(duì)選擇支原體作為實(shí)驗(yàn)對象，人工合成供體的基因組DNA。對蕈狀支原體Mycoplasma mycoides進(jìn)行全基因組測序，計(jì)算機(jī)軟件精密計(jì)算后，將全基因組序列信息分解成1 078條平均長度為1 kb的DNA片段 （片段間具有 80 bp的部分DNA重疊）。人工合成這一千多條基因片段并進(jìn)行改造，例如去除14個(gè)不重要基因片段、添加插入序列和便于區(qū)分于天然序列母本的 “水印”標(biāo)記 （Watermark）[8]。將以上人工設(shè)計(jì)合成的DNA片段在酵母細(xì)胞內(nèi)通過同源重組實(shí)現(xiàn)拼接。將拼接好的基因組轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。基因組來源的蕈狀支原體生長較慢，研究者選取生長較快的山羊支原體Mycoplasma capricolum為受體細(xì)胞，將改造后的基因組植入。細(xì)胞在分裂傳代過程中，具有天然基因組的細(xì)胞在含抗生素標(biāo)記的培養(yǎng)基中無法長出，同時(shí)生長出的即為含有人造基因組的細(xì)胞。該人造細(xì)胞“Synthia”明顯表現(xiàn)出蕈狀支原體的生長特性。這就是第一個(gè)人造細(xì)胞JCVI-syn1.0，親本來自電腦，卻能自我復(fù)制的生物物種！

2016年3月，該團(tuán)隊(duì)成功在JCV-syn1.0（含基因組1 079 kp）的基礎(chǔ)上，將基因組減到531 kb，473個(gè)基因，產(chǎn)生了JCVI-syn3.0，保留了轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的關(guān)鍵基因，而且還包含149個(gè)功能尚未探明的基因[9-10]，這是目前人工得到的含有最簡約基因組的支原體。

2.2 編排“基因線路”，設(shè)計(jì)各類遺傳工程化平臺(tái)

美國麻省理工學(xué)院2003年創(chuàng)辦國際性學(xué)術(shù)競賽國際遺傳工程機(jī)器大賽 iGEM（International Genetically Engineered Machine Com-petition），是以合成生物學(xué)為核心，交叉計(jì)算機(jī)科學(xué)、數(shù)學(xué)、生物學(xué)、藝術(shù)設(shè)計(jì)等多學(xué)科的國際科技競賽?？茖W(xué)家設(shè)計(jì)出單元的生物模塊BioBrick[11]，一段含有特殊酶切位點(diǎn)和特定功能序列的一段DNA。由3部分組成：前序（prefix），主序（body）和后序（suffix）。其中主序部分是特定功能的DNA序列，如調(diào)控基因，蛋白質(zhì)編碼基因，終止子等，也可以是它們的組合。前序和后序是兩個(gè)特殊的酶切位點(diǎn)序列，起到接頭的作用。2005年，D.Endy等人建立了標(biāo)準(zhǔn)化的生物模塊BioBrick登記數(shù)據(jù)庫，登記收集各種各樣的標(biāo)準(zhǔn)化生物零件，方便各國iGEM參賽者的使用。獲準(zhǔn)登記的標(biāo)準(zhǔn)化生物零件的數(shù)目目前已達(dá)幾千種。有了合成生物學(xué)工程化的設(shè)計(jì)理念，又有了可利用的標(biāo)準(zhǔn)化生物模塊，合成生物學(xué)設(shè)計(jì)師就能像設(shè)計(jì)電氣線路那樣，設(shè)計(jì)出各種各樣的基因線路（Genetic Circuit）[12]裝入細(xì)胞，使之執(zhí)行新的職能。

2.3 設(shè)計(jì)基因組底盤（chassis）和“有生計(jì)算機(jī)”，構(gòu)建人工進(jìn)化平臺(tái)

基因線路設(shè)計(jì)是否成功，需要將其轉(zhuǎn)入某個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)，被稱為底盤“Chassis”。理想的底盤生物基因組帶著這個(gè)生命所需的最小基因組，將成為一個(gè)巨大的實(shí)驗(yàn)工具。自我復(fù)制的細(xì)胞代表早期、相對原始細(xì)胞生活的形式。如果添加基因和復(fù)雜的功能，可將細(xì)胞轉(zhuǎn)換成更復(fù)雜的有機(jī)體，制造一系列可被利用的微生物，例如可吸收CO2和SO2的微生物，生產(chǎn)藥物或合成疫苗的細(xì)菌，可生產(chǎn)生物燃料的微生物等。中國科學(xué)家建立了生物必需基因數(shù)據(jù)庫DEG（Database of Essential Genes）[13]。從DEG出發(fā)，集合某種微生物的必需基因作構(gòu)建底盤生物基因組，這就建立了人工進(jìn)化平臺(tái)。未來，生命體可能通過人工設(shè)計(jì)合成的方式跨越式地實(shí)現(xiàn)進(jìn)化，這是非常神奇的，不過這類技術(shù)對于大自然本身的生態(tài)平衡會(huì)產(chǎn)生什么樣的沖擊，需要理性權(quán)衡。

科學(xué)家通過基因線路設(shè)計(jì)出一種細(xì)菌計(jì)算機(jī)[14]，能夠解決復(fù)雜的數(shù)學(xué)難題——漢密爾頓路徑問題（Hamiltonian Path Problem），速度遠(yuǎn)比硅芯片計(jì)算機(jī)運(yùn)算速度快。為了測驗(yàn)基因線路設(shè)計(jì)的優(yōu)劣，在不同的細(xì)胞個(gè)體內(nèi)裝上不同的基因線路，細(xì)菌計(jì)算機(jī)的繁殖力和運(yùn)算能力成正相關(guān)，在一定的培養(yǎng)條件下，基因路線最合理的細(xì)胞品系個(gè)體長得最快，發(fā)出最亮的黃色熒光，則代表著最佳的“漢密爾頓路徑”設(shè)計(jì)。

新興的合成生物學(xué)是一個(gè)高度的交叉學(xué)科，設(shè)計(jì)者需將生物學(xué)與工程學(xué)，特別是控制工程學(xué)和數(shù)學(xué)緊密地結(jié)合在一起，對新的生物零件進(jìn)行重新設(shè)計(jì)、構(gòu)建和組裝，并對天然存在的生物體基因組底盤進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化設(shè)計(jì)和改造，使之執(zhí)行新的生物機(jī)能，造福人類社會(huì)。

3 基因組編輯的新型魔術(shù)刀--CRISPR編輯技術(shù)

3.1 CRISPR-Cas9技術(shù)的誕生

CRISPR是一種源自古細(xì)菌的自我保護(hù)不受病毒侵害的免疫防御系統(tǒng)。CRISPR/Cas系統(tǒng)全名為“成簇、規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列體系”，具有高超的基因組定位能力。該位點(diǎn)能表達(dá)與入侵病毒基因組序列相匹配的RNA小分子。當(dāng)微生物感染了病毒，RNA小分子就能通過相匹配的互補(bǔ)序列結(jié)合病毒的基因組，并表達(dá)核酸酶（即Cas酶），能切割病毒DNA，阻止病毒完成其功能。

該系統(tǒng)起重要作用的兩部分：一是Cas酶，用于切斷靶標(biāo)DNA；另一個(gè)是能互補(bǔ)結(jié)合靶標(biāo)DNA的RNA序列，稱之為向?qū)?RNA（Guide RNA，gRNA），與Cas酶形成復(fù)合體，指導(dǎo)Cas酶到達(dá)正確的剪切位點(diǎn)。CRISPR系統(tǒng)并不復(fù)雜，將帶質(zhì)粒（能表達(dá)Cas和gRNA）的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，就可完成簡單的局部剪裁，CRISPR/Cas系統(tǒng)譽(yù)為 “基因組編輯的魔術(shù)刀”[15-16]。

該技術(shù)的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)合成特異性的gRNA 5’端的前20個(gè)核苷酸（使其對應(yīng)于靶標(biāo)DNA），指導(dǎo)Cas酶成功識(shí)別靶標(biāo)DNA（見圖2）。設(shè)計(jì)要求是gRNA上要有一個(gè)片段，能與由任意5'末端兩個(gè)胞嘧啶核苷酸（-NCC）的DNA結(jié)合。這種-NGG序列被稱為PAM結(jié)構(gòu)（protospacer adjacent motif）。專門用于 gRNA設(shè)計(jì)的軟件使這一技術(shù)（http：//www. genome-engineering.org/）更加便捷地應(yīng)用到日常操作中[17]。另外，專門設(shè)計(jì)改造的Cas蛋白也使得CRISPR編輯系統(tǒng)的脫靶率大大降低。目前這一技術(shù)進(jìn)入應(yīng)用階段，可對特定基因組位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)刪除、修復(fù)、替換，成為合成生物學(xué)、基因（多重基因）定向干擾和基因治療等領(lǐng)域的頗受歡迎的技術(shù)。

3.2 CRISPR彩虹標(biāo)記技術(shù)可實(shí)時(shí)追蹤活細(xì)胞中的染色體位點(diǎn)拓?fù)潢P(guān)系

科學(xué)家除了利用CRISPR作為基因編輯工具外，近期還利用它標(biāo)記染色體位點(diǎn)并追蹤活細(xì)胞中的染色體位點(diǎn)拓?fù)潢P(guān)系。

傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)基因標(biāo)記技術(shù)一次最多只能夠追蹤活細(xì)胞中染色體的3個(gè)位點(diǎn)，對于觀察染色體自身重組的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化或?qū)ν饨绱碳に鸬慕Y(jié)構(gòu)變動(dòng)，尚不夠理想。為了克服這個(gè)技術(shù)難題，研究人員對CRISPR/Cas9復(fù)合體進(jìn)行改造，使Case酶鈍化，并對gRNA進(jìn)行熒光蛋白標(biāo)記。根據(jù)太陽光的色系分解原理，構(gòu)建了7種彩虹色系熒光標(biāo)記，當(dāng)它們組合在一起則生成白色，該技術(shù)能同時(shí)確定多達(dá)7種不同的染色體DNA位點(diǎn)，每種位點(diǎn)對應(yīng)于其中的一種熒光色系，由此誕生了CRISPR彩虹技術(shù)（CRISPRainbow）[18]。采用這種技術(shù)在活細(xì)胞中追蹤染色體動(dòng)態(tài)拓?fù)渥儞Q，對于染色體組學(xué)以及生命遺傳動(dòng)態(tài)過程研究具有重要的意義。

3.3 第二代基因編輯器CRISPR/Cpf1與NgAgogDNA

2015年美國哈佛大學(xué)的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一種比CRISPR/Cas9更簡單的系統(tǒng)CRISPR/Cpf1，該系統(tǒng)中酶Cpf1表現(xiàn)出雙重切割活性：不僅切割DNA，而且也切割RNA[19]。近期，中國科學(xué)家黃志偉教授解析出Cpf1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，并揭示了其運(yùn)行機(jī)制[20]。該編輯系統(tǒng)就像文字編輯軟件“修改文檔”一樣來“修正”基因，甚至能讓人們更加高效地對基因進(jìn)行“關(guān)閉”、“恢復(fù)”和“切換”等精準(zhǔn)“手術(shù)”，這一發(fā)現(xiàn)預(yù)示著未來人類可以對癌癥和艾滋病等疾病的基因進(jìn)行“刪除”、“修改”等“編輯”，而“編輯”過的基因可以遺傳到下一代，使人類徹底“消滅”癌癥和艾滋病等疾病成為可能。

近期，韓春雨報(bào)道了一種不同于CRISPR-Cas9的NgAgo-gDNA基因編輯新技術(shù)[21]，CRISPR-Cas9通過RNA尋找替換序列，而NgAgo-gDNA系統(tǒng)中，專門合成的 gDNA能夠與來自 Natronobacterium gregoryi的DNA內(nèi)切酶Argonaute（NgAgo）適配。當(dāng)向?qū)NA尋找到編輯目標(biāo)后，該酶可在基因組內(nèi)任何位置引入雙鏈斷裂，進(jìn)行基因編輯。該論文發(fā)表后引起國內(nèi)外學(xué)界與社會(huì)的廣泛關(guān)注，有關(guān)技術(shù)尚待重復(fù)試驗(yàn)與第三方驗(yàn)證。

發(fā)展迅速的基因編輯技術(shù)漸趨成熟，發(fā)展也更全面。該技術(shù)與生物工程技術(shù)相結(jié)合，可用于植物、動(dòng)物和微生物的基因改造[22-24]，與臨床醫(yī)學(xué)相結(jié)合開展腫瘤[25]、艾滋病[26]、糖尿病[27]或者一些遺傳性疾病的“基因治療”，在醫(yī)藥、農(nóng)林業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。此處，該技術(shù)與新能源開發(fā)、環(huán)境保護(hù)等方面的結(jié)合也具有良好的應(yīng)用前景。

4 通過DNA Origami精確設(shè)計(jì)自組裝DNA納米材料

折紙“Origami”這一古老技藝廣為人知，以簡單的一維或二維物件為基材，通過構(gòu)成想象、成型設(shè)計(jì)，使之成為復(fù)雜的、美觀的、甚至具有特殊用途的高維度結(jié)構(gòu)。美國NASA人造衛(wèi)星所配太陽電池板的收放，實(shí)際上是在折紙模型不斷演練的基礎(chǔ)上，逐步理想化的結(jié)果。

艾滋病毒、SARS病毒，還有寨卡病毒等都是單鏈的RNA病毒，線狀的RNA鏈通過內(nèi)部的堿基局部配對，形成了千奇百怪的立體結(jié)構(gòu)，而這類結(jié)構(gòu)的折疊和解折疊正是病毒調(diào)控生命活動(dòng)的關(guān)鍵和侵染人體的殺手锏。Nadrian Seeman早在20世紀(jì)80年代就提出，可以模仿病毒的基因組結(jié)構(gòu)，用單鏈DNA分子的內(nèi)部堿基配對去構(gòu)成二維的、甚至三維的納米分子。2006年，DNA折紙（DNA Origami）出現(xiàn)在“Nature”雜志的封面[28]。分子生物學(xué)家玩的DNA折紙術(shù)變成了新材料創(chuàng)新設(shè)計(jì)。加州理工學(xué)院的Paul Rothemund甚至設(shè)計(jì)出“分子訂書釘”（Staples），幫助不同結(jié)構(gòu)域之間的接合 （如圖3）。精準(zhǔn)設(shè)計(jì)的DNA分子可自組裝成各種形狀，如五角星、微笑面孔，還有比常見細(xì)菌更小的美國微型地圖[28]。

DNA Origami的操作涉及到：畫出目的物構(gòu)象輪廓；把目標(biāo)構(gòu)象演化為DNA分子折疊結(jié)構(gòu)；按照堿基配對原則，設(shè)計(jì)一級(jí)序列，退火處理，使DNA序列內(nèi)部自動(dòng)配對成型；對關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)加以“訂書釘”固定，即可得到預(yù)期的折紙納米結(jié)構(gòu)。對目的物成型效果的觀察則需要?jiǎng)佑孟冗M(jìn)的技術(shù)，如，超微掃描電鏡、同位素顯影分析、嵌合熒光指示物的熒光檢測等。目前，多款DNA折紙術(shù)結(jié)構(gòu)的軟件成熟，可指導(dǎo)折疊出更為復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)（如圖4）[29-30]。

DNA Origami的設(shè)計(jì)過程本身具有某種藝術(shù)造型的樂趣，但尋求生物大分子納米材料的應(yīng)用更為重要：如，設(shè)計(jì)出能與藥劑又與人體受體蛋白完全契合的納米分子，將藥物、抗生素等送到真正的病灶之處；設(shè)計(jì)DNA以轉(zhuǎn)錄出人工RNA，使之折疊后成為三維結(jié)構(gòu)與真實(shí)病毒基因組相似，但序列不同的“偽基因組”，但可與帶有表面抗原的病毒外殼結(jié)合，這種形似病毒粒子，實(shí)則無侵染功能的“偽病毒”是最安全的疫苗；做成熒光指示物的載體，將熒光物質(zhì)送入蟑螂體內(nèi)，失蹤其代謝流向，從而為殺滅害蟲獲得第一手的生理代謝信息；制備微型的血管清淤工具，設(shè)想將DNA Origami技術(shù)用于設(shè)計(jì)一種納米載體，用以攜載清除粥樣硬化的淤積酶劑。注入血管后，這種復(fù)合物對硬化的血管實(shí)行溫和疏通，并最終自消化飴盡；制作微型的標(biāo)識(shí)，防偽標(biāo)簽，甚至防盜保護(hù)暗碼。因?yàn)檫@種標(biāo)志物微小和特殊，只有特殊的設(shè)備和技術(shù)才能檢測到；設(shè)計(jì)DNA三維適配體（Aptamer），使之與某些具有立體結(jié)構(gòu)的大分子抗生素、農(nóng)藥、獸藥等相適配，Aptamer帶有熒光標(biāo)記，可方便地檢測對食品安全造成危害的化學(xué)物質(zhì)。

類似的智慧還可以輻射到新型蛋白質(zhì)材料的設(shè)計(jì)。膠原蛋白是一類三股肽鏈扭旋而成的特殊結(jié)構(gòu)，是肌腱、皮膚中關(guān)鍵的生物物質(zhì)。它的獨(dú)特結(jié)構(gòu)域性能引發(fā)人們?nèi)ツM設(shè)計(jì)膠原材料。根據(jù)既定材料的性能，反推肽鏈的一級(jí)序列，演繹三股肽鏈之間的離子健與范德華力的牽拉關(guān)系，再由氨基酸序列反讀出可順暢表達(dá)的DNA序列，實(shí)現(xiàn)人工膠原蛋白材料的生物合成。

隨著人類基因組計(jì)劃 （Human Genome Project，HGP）的實(shí)施完成，生命科學(xué)進(jìn)入“生物信息學(xué)時(shí)代”?；蚪M數(shù)據(jù)庫收集生物基本的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列信息（例如Genbank DNA序列數(shù)據(jù)庫）；生物大分子數(shù)據(jù)庫，主要是蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（例如PDB數(shù)據(jù)庫），收錄通過X-衍射和核磁共振得到的蛋白質(zhì)三維晶體結(jié)構(gòu)資料。以上資料和數(shù)據(jù)一般是世界各地的科學(xué)家由實(shí)驗(yàn)所得，提交到公共平臺(tái)供全世界公眾免費(fèi)使用。這些數(shù)據(jù)庫提供分子生物信息學(xué)的基本數(shù)據(jù)資源，被稱一次數(shù)據(jù)庫。

根據(jù)生命科學(xué)不同研究領(lǐng)域的實(shí)際需要，生物學(xué)家和計(jì)算機(jī)科學(xué)家合作，共同開發(fā)構(gòu)建具有特殊生物學(xué)意義和專門用途的二次數(shù)據(jù)庫，可在線對基因組圖譜、核酸序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及文獻(xiàn)等數(shù)據(jù)進(jìn)行分類比對、分析整理、歸納注釋等功能。

2009年，印度開始實(shí)施建立世界上最大的生物識(shí)別數(shù)據(jù)庫，對本國居民進(jìn)行照片、指紋、虹膜掃描

5 構(gòu)建新型3D生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫

等信息數(shù)據(jù)采集，建立DNA身份數(shù)據(jù)庫。政府試圖將此數(shù)據(jù)庫與個(gè)人手機(jī)、醫(yī)療、就業(yè)、社保等數(shù)據(jù)信息關(guān)聯(lián)，進(jìn)入全新的大數(shù)據(jù)時(shí)代。

在未來，隨著大數(shù)據(jù)研究的發(fā)展，會(huì)呈現(xiàn)多維視角?？蓪⒁曈X傳達(dá)設(shè)計(jì)學(xué)的理念與大生物信息數(shù)據(jù)庫相結(jié)合，為每一位顧客創(chuàng)造一個(gè)仿真的虛擬電子人。這些電子復(fù)制人為客戶提供了舒適友好的視覺界面，使之方便地搜索包括自己的基因、外貌、體征、健康等海量醫(yī)學(xué)信息，也可進(jìn)行虛擬的基因組調(diào)整改造，并瀏覽自動(dòng)生成的3D體貌。將整個(gè)用戶的生物信息分解成了二進(jìn)制的數(shù)據(jù)。通過檢測服務(wù)收集基因組中的外顯子組信息，掃描比對查找出致病基因，特別是重大疾病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)性基因，例如糖尿病、老年癡呆癥、心臟病的易感因子等，將這些潛在的疾病風(fēng)險(xiǎn)性表達(dá)成可視化3D圖像，使我們直觀了解生命未來的健康走向，為提前介入疾病防治或治療干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。

DNA技術(shù)猶如IT技術(shù)，設(shè)計(jì)與創(chuàng)新的速度呈對數(shù)激增。DNA技術(shù)需要更深入的學(xué)科交互，更有新意的設(shè)計(jì)方法學(xué)介入。人類需要更加另類的、奇思怪想的發(fā)明創(chuàng)造，更加豐富多彩的、無拘無束的智慧火花，去推動(dòng)生命科學(xué)與技術(shù)的新一輪發(fā)展。

[1]MAXAM A M，GILBERT W.A new method for sequencing DNA[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1977，74（2）：560-564．

[2]SANGER F，NICKLEN S，COULSON A R.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1977，74（12）：5463-5467.

[3]WU Z J，IRIZARRY R A.Preprocessing of oligonucleotide array data[J].Nature Biotechnology，2004，22（6）：656-658.

[4]DUGGAN D J，BITTNER M，CHEN Y D，et al.Expression profiling using cDNA microarrays[J].Nature Genetics，1999，21：10-14.

[5]HARRIS T D，BUZBY P R，BABCOCK H，et al.Single-molecule DNA sequencing of a viral genome[J].Science，2008，320（5872）：106-109.

[6]CLARKE J，WU H C，JAYASINGHE L，et al.Continuous base identification for single-molecule nanopore DNA sequencing[J]. Nature Nanotechnology，2009，4（4）：265-270.

[7]GIBSON D G，GLASS J I，LARTIGUE C，et al.Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome[J]. Science，2010.329（5987）：52-56.

[8]GIBSON D G，BENDERS G A，ANDREWS-Pfannkoch C，et al.Complete chemical synthesis，assembly，and cloning of a Mycoplasma genitalium genome[J].Science，2008，319（5867）：1215-1220.

[9]HUTCHISON C A，CHUANG RY，NOSKOV N，et al.Design and synthesis of a minimal bacterial genome[J].Science，2016，351（6280）：aad6253.

[10]CALLAWAY E.Race to design life heats up[J].Nature，2016，531（7596）：557-55.

[11]SHETTY R P，ENDY D，KNIGHT T.Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts[J].Journal of Biological Engineering，2008（2）：5.

[12]BROPHY J A N，VOIGT C A.Principles of genetic circuit design[J].Nature Methods，2014，11（5）：508-520.

[13]ZHANG R，OU H Y，ZHANG C T.DEG：a database of essential genes[J].Nucleic Acids Research，2004，32：D271-D272.

[14]BAUMGARDNER J，ACKER K，ADEFUYE O，et al.Solving a hamiltonian path problem with a bacterial computer[J].Journal of Biological Engineering，2009，3：11.

[15]HSU P D，LANDER E S，ZHANG F.Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering[J].Cell，2014，157（6）：1262-1278.

[16]DOUDNA JA，CHARPENTIER E.Genome editing.The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9[J].Science，2014，346（6213）：1077.

[17]JINEK M，CHYLINSKI K，F(xiàn)ONFARA I，et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science，2012，337（6096）：816-21.

[18]MA H，TU L C，NASERI A，et al.Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow[J].Nature Biotechnology，2016，doi：10.1038/nbt.3526.

[19]ZETSCHE B，GOOTENBERG J S，ABUDAYYEH O O，et al.Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System[J].Cell，2015，163（3）：759-771.

[20]DONG D，REN K，QIU X，et al.The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA[J].2016，532（7600）：522-526.

[21]GAO F，SHEN X Z，JIANG F，et al.DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute[J].Nature Biotechnology，2016（10）：38

[22]XIE K，Minkenberg B，YANG Y.Targeted gene mutation in rice using a CRISPR-Cas9 system[J].Bio-Protocol，2014，4（17）：e1225.

[23]XiIE K，Minkenberg B，YANG Y.Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA processing system[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2015，112（11）：3570-3575.

[24]NIU Y，SHEN B，CUI Y，et al.Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos[J].Cell，2014，156：836-843.

[25]DROST J，JAARSVELD R H，PONSIOEN B，et al.Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells[J]. Nature，2015，521：43-47.

[26]KAMINSKI R，CHEN Y L，F(xiàn)ISCHER T，et al.Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing[J].Nature，2016，doi：10.1038/srep22555

[27]YANG Y，WANG K，WU H.Genetically humanized pigs exclusively expressing human insulin are generated through custom endonuclease-mediated seamless engineering[J].Journal of Molecular Cell Biology，2016：174-177.

[28]ROTHEMUND P W.Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns[J].Nature，2006，440（7082）：297-302.

[29]HAN D R，PAL S，Nangreave J，et al.DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space[J].Science，2011，332（6027）：342-346.

[30]ERIK B，ABDULMELIK M，Johan G，et al.DNA rendering of polyhedral meshes at the nanoscale[J].Nature，2015，523（7561）：441-U139.

會(huì)議信息

會(huì)議名稱(中文)：第二十一屆全國生物固氮學(xué)術(shù)研討會(huì)

所屬學(xué)科：動(dòng)植物微生物學(xué),植物營養(yǎng)學(xué)

開始日期：2016-12-02 結(jié)束日期：2016-12-04

所在城市：湖北省 武漢市

具體地點(diǎn)：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國際學(xué)術(shù)交流中心

主辦單位：農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、中國微生物學(xué)會(huì)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)

聯(lián)系人：曹揚(yáng)榮 聯(lián)系電話：027-62435859，13264720378

E-MAIL：yrcao@mail.hzau.edu.cn

會(huì)議網(wǎng)站：http://csm.im.ac.cn/templates/team/introduction.aspx?nodeid=9&page=ContentPage&contentid=4209

會(huì)議背景介紹：為了展示我國生物固氮研究的最新成果及進(jìn)展，加強(qiáng)與生物固氮研究領(lǐng)域相關(guān)科技工作者之間的交流與合作，促進(jìn)生物固氮研究在現(xiàn)代綠色農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用。由農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、中國微生物學(xué)會(huì)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)聯(lián)合主辦的“第二十一屆全國生物固氮學(xué)術(shù)研討會(huì)”，將于2016年12月2-4日在湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)舉行。會(huì)議誠摯邀請全國從事生物固氮及相關(guān)研究領(lǐng)域的專家和學(xué)者，就生物固氮領(lǐng)域的重大科學(xué)問題、實(shí)際應(yīng)用中的關(guān)鍵技術(shù)、研究進(jìn)展與合作交流開展廣泛和深入討論。會(huì)議主題：生物固氮與現(xiàn)代綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展。

Design Wisdoms in DNA Technology

ZHANG Ling， WANG Wu*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

From the second half of the 20th century,the invention of the protein and nucleic acid sequence detection technologies has induced an information explosion of the structure and function of biological macromolecules and the rational design of macromolecular sequence.Consequentially, an empire has been built to construct the functional tertiary structure of bio-macromolecules.In the 21st century,the innovative design wisdom in DNA technology began to spring up benefited from the interdisciplinary integration.The genome of a simple life such as virus and mycoplasma has been successfully recombined.Genome chassis has been designed with the construction of artificial evolution platform.A novel gene editing technique,named CRISPR,has been used as a powerful tool for genomic rectification.The technique of DNA origami improved the precise self-assembly of 3D DNA nano-materials.Moreover,the 3D bioinformatics database system can be constructed using the principle of stereoscopic constitution combined with the design method based on user experience.

DNA technology，design wisdom，genomic chasiss，CRISPR，stereoscopic constitution，DNA origami

Q 812

A

1673—1689（2016）11—1121—08

2016-07-01

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31340027）；江蘇省優(yōu)青基金項(xiàng)目（BK20160053）。

張 玲（1981—），女，新疆哈密人，發(fā)酵工程博士研究生，助理研究員，主要從事酶基因工程研究。E-mail：zhangdoudou2004@aliyun.com

*通信作者：王 武（1952—），女，福建福州人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵工程和基因工程研究。E-mail：wangwu@jiangnan.edu.cn