龍血素B對纖溶酶原激活物抑制劑的抑制作用

閆冬

（遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116081）

龍血素B對纖溶酶原激活物抑制劑的抑制作用

閆冬

（遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116081）

纖溶酶原激活物抑制劑1（Plasiminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1）是一種分泌型單鏈糖蛋白，是絲氨酸蛋白水解酶抑制劑家族的成員之一。在纖溶系統(tǒng)中，PAI-1是尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type Plasiminogen Activator,uPA）和組織型纖溶酶原激活物（tissue-type Plasiminogen Activator,tPA）的天然特異性的抑制劑。PAI-1的異常表達會引起體內(nèi)凝血和抗凝血系統(tǒng)的紊亂，從而導(dǎo)致血栓類疾病的發(fā)生。本實驗利用底物熒光發(fā)色法確定龍血素B對PAI-1具有的抑制作用。因此，以PAI-1作為分子靶標(biāo)，龍血素B可能為研發(fā)治療血栓類相關(guān)疾病奠定了理論基礎(chǔ)。

龍血素B；PAI-1；抑制劑；血栓

龍血竭（亦稱廣西血竭）是百合科植物龍血樹屬劍葉龍血樹的含脂木材經(jīng)乙醇提取而得到的樹脂，是常用的活血化瘀中藥，有散瘀生新、活血止痛、止血生肌等功效。其中，龍血素B是龍血竭質(zhì)量標(biāo)準中的重要指標(biāo)[1]。本實驗室通過前期工作從大批量天然中草藥中篩選得到龍血素B，本實驗對其是否擁有纖溶酶原激活物抑制劑抑制作用進行如下檢測。

1 利用底物發(fā)色法測定龍血素B對PAI-1的抑制活性

PAI-1是尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）的天然抑制劑[2]，S2444是uPA的特異性底物，uPA能水解S2444使其釋放出黃色的pNA。uPA的活性可以通過其水解S2444產(chǎn)生的黃色速率來測定。在405nm下，pNA有最大的吸光度，其他則無吸光值。反應(yīng)最終體系為：龍血素B 50μM，50mM Tris-HCl pH為7.5，150mM NaCl，2.5mM CaCl2，0.02%BSA，2%DMSO，0.1%PEG6000，10nM PAI-1，10nM uPA，32μM S-2444。結(jié)果表明，龍血素B具有抑制PAI-1活性。

2 活性小分子抗PAI-1劑量依賴測定

取5mM的龍血素B利用倍比稀釋法在反應(yīng) buffer中稀釋為 400、200、100、50、25、12.5μM和0μM，轉(zhuǎn)移至96孔板中。將同樣劑量的PAI-1加入反應(yīng)體系中，23℃靜置15min。然后加入uPA，23℃下靜置5min后轉(zhuǎn)移至37℃恒溫箱中孵育10min。最后加入發(fā)色底物S2444，混勻后在酶標(biāo)儀的Kenetic模式下，測定0min和30min波長405nm的吸光度。由此可以計算體系中剩余PAI-1的活性：PAI-1activity（%）=1-ΔO. D405nmcompound30min/ΔO.D405nmuPA30min。ΔO.D405nmcompound30min表示體系中純在小分子化合物和PAI-1的情況下，37℃，波長405nm下uPA水解發(fā)色底物反應(yīng)中第1min與第30min吸光度的變化；ΔO.D405nmuPA30min表示反應(yīng)體系中只存在uPA的情況下，uPA水解發(fā)色底物吸光度第1min和第30min的變化。結(jié)果證明，龍血素B對PAI-1的抑制呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

3 通過SDS-PAGE檢測龍血素B對uPA/ PAI-1復(fù)合物形成的影響

采用倍比稀釋法用事先配好的TBS緩沖液稀釋龍血素B終濃度為100、50、25、12.5、0μM。加入10μL PAI-1，23℃孵育15min。然后加入10μL 的uPA，37℃反應(yīng)10min。加入5μL非還原性loading buffer。將混合好的樣品沸水中煮3min。之后用10%的SDS電泳90V電泳1.5h。在37℃下用考馬斯亮藍染色40min，在用脫色液多次脫色。結(jié)果表明，龍血素B能對PAI-1和uPA的復(fù)合物形成產(chǎn)生影響，這種影響具有一定的劑量依賴性。

4 血漿纖維蛋白實驗

在96孔板中將藥品倍比稀釋成最終濃度為400、200、100、50μM和25μM。加入5μL PAI-1在室溫下反應(yīng)15min，然后加入2μL uPA在37℃下孵育10min。將人血漿與65μL的反應(yīng)體系（其中包括150mM NaCl，2mM CaCl2，20mM HEPES， pH7.4）混合，然后加入人凝血酶促進纖維蛋白形成，在37℃下反應(yīng)10min，確保形成的纖維蛋白在2h內(nèi)保持穩(wěn)定。然后，將之前準備好的樣品相互混合，混勻。用酶標(biāo)儀測定其在405nm的光吸收值。結(jié)果顯示，纖溶酶能促進血纖維溶解，使吸光度變小。隨著小分子抑制劑劑量的增加，PAI-1的活性隨之降低，uPA的活性反之增高，溶解血纖維蛋白的速率增加。

5 小結(jié)

血竭是我國傳統(tǒng)名貴中藥，其應(yīng)用已有1 500余年的歷史，在古醫(yī)學(xué)中多有記載?！侗静菥V目》謂其能散滯諸痛，《本草經(jīng)疏》也有血竭為散瘀血之要藥的論述[3]。血竭在臨床上常用于外科、骨傷科、內(nèi)科、婦科?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，血竭既能使處于高凝狀態(tài)的血液重新流通，起到活血化瘀的作用，又能使處于低凝狀態(tài)的血液在血管破口處凝固而使出血停止，起到收斂止血的作用，在中醫(yī)治療血證方面具有雙向調(diào)節(jié)作用。本實驗研究表明，血竭中的龍血素B通過阻止PAI-1和uPA的復(fù)合物形成對PAI-1具有特異的抑制活性，并且這種抑制作用具有劑量依賴性。進一步研究表明，說明龍血素B具有較好的抗血栓、抗血瘀、抗凝血等活血化瘀藥理作用。這為龍血素B及血竭的進一步開發(fā)利用提供了實驗依據(jù)。

[1]陳奇主.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1993:377,484,564,571.

[2]Amy Liang, Faye Wu, Kathy Tran. Characterization of a small molecule PAI-1inhibitor, ZK4044[J]. Thrombosis Research, 2005,115(4):341-350.

[3]李楓,張蓓蕾.活血圣藥- 血竭研究綜述[J].上海醫(yī)藥,1998,19(8): 33.

Inhibitory Effects of Loureirin B on Plasminogen Activator Inhibitor

Yan Dong
(College of Life Science, Liaoning Normal University, Liaoning Dalian 116081)

Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) is a member of the serine protease inhibitor gene family and is the major inhibitor of both tissue-type plasminogen activator (tPA) and urokinase-type plasmanogen activator (uPA) invivo. In the fibrinolytic system, PAI-1 is the natural specific inhibitors of both uPA and tPA. The abnormal expression of PAI-1 can cause the disorder of coagulation and anti coagulation system in the body, which can lead to the occurrence of thrombotic diseases. This experiment used fluorogenic substrate colorimetry method to determine the Loureirin B on PAI-1 has inhibitory effect; therefore the PAI-1 as a molecular target, Loureirin B might be for the development of treatment of thrombosis related diseases has laid a theoretical foundation.

Loureirin B; PAI-1; Inhibitor; Thrombosis

R285

A

2096-0387（2016）02-0049-02

閆冬（1989-），男，遼寧盤錦人，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學(xué)。