• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    微流控芯片的制備及其對(duì)糖類物質(zhì)的檢測(cè)

    2016-04-07 02:01:14皮曉強(qiáng)王升高劉星星崔麗佳
    關(guān)鍵詞:磁控濺射

    皮曉強(qiáng),王升高*,劉星星,張 維,陳 睿,崔麗佳

    1.武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢430074;2.湖北省等離子體化學(xué)與新材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(武漢工程大學(xué)),湖北武漢430074

    ?

    微流控芯片的制備及其對(duì)糖類物質(zhì)的檢測(cè)

    皮曉強(qiáng)1,2,王升高1,2*,劉星星1,2,張維1,2,陳睿1,2,崔麗佳1,2

    1.武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢430074;
    2.湖北省等離子體化學(xué)與新材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(武漢工程大學(xué)),湖北武漢430074

    摘要:利用軟光刻技術(shù),在聚二甲基硅氧烷(PDMS)上制備了微流通道,通過光刻-濕法刻蝕和磁控濺射鍍膜技術(shù)制備出了集成有金屬膜電極的玻璃基片,將二者經(jīng)過等離子體處理,進(jìn)行鍵合后獲得了集成有電化學(xué)檢測(cè)器的PDMS-玻璃微流控芯片.以市售蜂蜜為待測(cè)物質(zhì),研究了該芯片對(duì)蜂蜜中糖類物質(zhì)的分離檢測(cè)性能.結(jié)果表明:在分離電壓為850 V,電解液為50 mmol/L氫氧化鈉條件下,使用該P(yáng)DMS玻璃微流控芯片成功地在3 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡萄糖、蔗糖和果糖的有效分離和檢測(cè).

    關(guān)鍵詞:微流控芯片;磁控濺射;電泳分離;電化學(xué)檢測(cè);糖

    1 引 言

    微流控芯片通常被稱為微型全分析系統(tǒng)或芯片實(shí)驗(yàn)室.它是一個(gè)跨學(xué)科的領(lǐng)域,旨在通過分析化學(xué)、微機(jī)電加工、材料科學(xué)、電子學(xué)、生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)的交叉來實(shí)現(xiàn)分析從試樣處理到檢測(cè)的整體微型化、自動(dòng)化、集成化和便攜化.其優(yōu)點(diǎn)在于通過芯片溝道實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化微流控操作,這不僅降低了珍貴的生物試劑的使用,而且使分析效率得到了提高[1-4].

    微流控芯片(microfluidic chip)技術(shù)首次由Manz等[5]于1900年提出,其后短短十幾年內(nèi)得到了快速發(fā)展.目前微流控芯片的加工過程主要包括圖形設(shè)計(jì)、掩膜、光刻、刻蝕和鍵合等步驟.近年來報(bào)道了使用商品化SODA-LIME玻璃和硅基模具制作微流控芯片的方法,其降低了微流控芯片的成本和對(duì)設(shè)備的要求[6-7].陳強(qiáng)研究組[8]通過使用紫外光學(xué)膠鍵合的方法來實(shí)現(xiàn)了微流空芯片的快速鍵合,降低了鍵合工藝對(duì)基質(zhì)表面平整度的要求.

    本文通過光刻-濕法刻蝕和磁控濺射鍍膜技術(shù)制備出了集成有金屬電極的載玻片,通過軟光刻技術(shù)制備出了具有溝道的PDMS蓋片,將兩者用氧等離子體處理后鍵合,獲得了集成有電化學(xué)檢測(cè)器的PDMS-玻璃微流控芯片,并利用其對(duì)蜂蜜中的糖類物質(zhì)進(jìn)行了分離檢測(cè).

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

    實(shí)驗(yàn)試劑主要包括:氫氧化鈉(分析純,天津市化學(xué)試劑三廠),蜂蜜,溶液配制成0.1 mol/L儲(chǔ)備液,使用時(shí)再稀釋至所需濃度,所有溶液以3次蒸餾水配制,使用前利用0.22 μm的醋酸纖維素酯微孔濾膜過濾.其中NaOH溶液要每2 h更換一次.正性光刻膠(RZJ-304,蘇州瑞紅),負(fù)性光刻膠(RFJ-220,蘇州瑞紅),硝酸銀(分析純,中國(guó)人民解放軍第九五零九工廠),三氯化鐵(分析純,天津市化學(xué)試劑三廠)等.

    實(shí)驗(yàn)設(shè)備主要包括:電化學(xué)工作站為CHI660B(上海辰華),高壓電源(天津恒博),微博等離子體化學(xué)氣相沉積裝置(實(shí)驗(yàn)自制),磁控濺射鍍膜機(jī)(JCP-200,北京中科科儀有限公司),紫外光刻機(jī)(URE-2000/17,中國(guó)科學(xué)院光電技術(shù)研究所),真空干燥箱(DZF-6020,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),超聲波清洗機(jī)(AS3120,AUTOSCI?ENCE),自制屏蔽箱等.

    2.2微流控芯片的設(shè)計(jì)

    實(shí)驗(yàn)采用的集成電化學(xué)檢測(cè)器的設(shè)計(jì)如圖1所示. a為分離高壓負(fù)極引線即分離高壓的接地端,兩引線接地端,兩引線間距180 μm,高壓負(fù)極寬150 μm. b為工作電極,寬為30 μm. c為輔助電極. d為參比電極,與工作電極距離為20 μm. b、c 和d共同構(gòu)成了微流控芯片集成電化學(xué)檢測(cè)器.

    圖1 三電極系統(tǒng)及高壓負(fù)極布置示意圖(a)高壓負(fù)極(b)工作電極(c)輔助電極(d)參比電極Fig. 1 Sketch map of three electrodes system and high voltage cathode(a)High voltage cathode;(b)Work electrode;(c)Counter electrode;(d)Reference electrode

    該電化學(xué)檢測(cè)器的分離高壓負(fù)極布置于工作電極之前,通過兩個(gè)電極引線從溝道兩側(cè)同時(shí)引出,兩電極引線之間的距離為180 μm,使得分離高壓負(fù)極還未到達(dá)檢測(cè)電極即最大限度地從地線分離流走,隔離效果優(yōu)于單根引線,有效地減少了分離高壓對(duì)檢測(cè)信號(hào)的干擾.同時(shí),三電極系統(tǒng)布置于溝道內(nèi),工作電極與分離高壓負(fù)極之間的距離為30 μm,與布置于液池內(nèi)相比,可減小樣品擴(kuò)散,防止區(qū)帶展寬.工作電極設(shè)計(jì)尺寸為20 μm,電極尺寸的減少,可提高傳質(zhì)速度和分辨率,降低響應(yīng)時(shí)間,提高電極的靈敏度.工作電極與參比電極之間的距離為20 μm,小于溝道的寬度25 μm,有效地降低了背底噪音.

    實(shí)驗(yàn)中十字溝道的設(shè)計(jì)如圖2所示.其中C為樣品池,B為樣品廢液池,D為緩沖液廢液池. BC段為進(jìn)樣溝道,AD段為分離溝道,其中ED段為有效分離長(zhǎng)度.實(shí)驗(yàn)中考慮到最大程度地減少分離高壓對(duì)電極檢測(cè)信號(hào)的影響,通過降低溝道寬度和增加溝道的有效分離長(zhǎng)度的方法進(jìn)一步達(dá)到去耦的目的.因此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的有效分離長(zhǎng)度為65 mm,溝道寬度為25 μm.同時(shí),實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的進(jìn)樣溝道寬度為50 μm,與雙T型溝道相比,可以減少進(jìn)樣時(shí)間,但達(dá)到相同的進(jìn)樣效果.

    圖2 十字溝道示意圖B為樣品廢液池;C為樣品池;D為緩沖液池;AD為分離溝道;BC為進(jìn)樣溝道;ED為有效分離長(zhǎng)度Fig. 2 Sketch map of the cross channel B Sample waste pool;C Sample pool;D Buffer solution pool;AD Separated channel;BC Sample injection channel;ED The length of effective separation

    2.3微流控芯片的制備

    利用磁控濺射鍍膜機(jī)在清洗后的玻璃基片表面鍍上鈦膜,再鍍金膜(鈦膜180 nm,金膜25 nm),然后在其表面勻上RZJ-304正性光刻膠.以具有所需圖形的鉻版玻璃作為掩膜版,通過顯影、濕法刻蝕及除膠后即制備出分離高壓負(fù)極和三電極系統(tǒng).圖3即為集成電化學(xué)檢測(cè)器的制備工藝流程.將參比電極在0.01 mol/L AgNO3溶液中進(jìn)行電鍍,然后在0.1 mol/L的FeCl3溶液中浸泡2 min后制得Ag/AgCl類參比電極.

    圖3 電極的加工制作工藝流程(a)鍍鈦膜和金膜;(b)涂光刻膠;(c)光照;(d)顯影;(e)濕法刻蝕除金膜和鈦膜;(f)除光刻膠Fig. 3 Electrode processing and production(a)Titanium and gold film plating;(b)Resist coating;(c)Illumination;(d)Image develop;(e)Wet etching for removing titanium and gold film and;(f)Remove photoresist

    PDMS溝道的制備采用了軟光刻技術(shù).通過預(yù)聚體Sylgard184及固化劑按質(zhì)量比10∶1均勻混合并去除氣泡后,于75℃固化2 h后澆注于負(fù)膠制作的陽模上,過程如圖4所示,固化即可得到如圖4所示的溝道的PDMS蓋片.采用氧等離子體對(duì)PDMS蓋片和玻璃基片正反兩面進(jìn)行改性處理后,在顯微鏡下進(jìn)行PDMS蓋片和玻璃基片的對(duì)準(zhǔn)操作,實(shí)現(xiàn)PDMS和玻璃的鍵合,即得到了集成有電化學(xué)檢測(cè)器的PDMS-玻璃微流控芯片,照片如圖5所示.

    圖4 PDMS溝道制作工藝流程(a)涂光刻膠;(b)光照;(c)顯影;(d)澆注PDMS單體;(e)制得具有溝道的PDMS蓋片F(xiàn)ig. 4 Fabrication of PDMS channel (a)Resist coating;(b)Illumination;(c)Image develop;(d)Pouting PDMS monomer and(e)PDMS cover plate with channel

    圖5 集成有電化學(xué)檢測(cè)器的PDMS微流控芯片實(shí)物照片(a)玻璃基片;(b)加工有十字溝道的PDMS蓋片;(c)、(d)分離高壓負(fù)極電極引線;(e)工作電極引線;(f)對(duì)電極引線;(g)參比電極引線;(h)電極的局部放大CCD照片;(i)PDMS蓋片的局部放大照片;(j)PDMS溝道的剖面圖Fig. 5 PDMS microfluidic chip integrated with electrochemical detector(a)Glass substrate;(b)PDMS cover plate with cross channel;(c)and(d)Negative leading wire for separating high voltage;(e)Leading wire of the work electrode;(f)Leading wire of counter electrode;(g)Leading wire of reference electrode;(h)CCD partial enlargement photo of electrode;(i)Partial enlargement photo of PDMS cover plate and(j)Cross?section drawn of PDMS channel

    2.4糖類物質(zhì)的檢測(cè)

    圖6為金電極作為工作電極的電泳分離圖.實(shí)驗(yàn)條件均以850 V作為分離高壓,進(jìn)樣時(shí)間5 s,以50 mmol/L NaOH作為緩沖溶液,以0.01 g蜂蜜稀釋200倍后的溶液作為檢測(cè)物.從圖中可以看出PDMS-玻璃微流控芯片能夠在3 min內(nèi)成功地從蜂蜜中分離檢測(cè)出葡萄糖、蔗糖和果糖.

    圖6 金電極作為工作電極的電泳分離圖(a)進(jìn)樣階段;(b)分離階段Fig. 6 Electrophoretic separation diagram of gold electrode as work electrode (a)Stage of sample injection;(b)Stage of sample separation

    3 結(jié) 語

    本實(shí)驗(yàn)采用了軟光刻技術(shù),在PDMS上制備了微流通道,通過光刻-濕法刻蝕和磁控濺射鍍膜技術(shù)制備出了集成有金屬膜電極的玻璃基片,將二者經(jīng)過等離子體處理后,進(jìn)行鍵合獲得了集成有電化學(xué)檢測(cè)器的PDMS-玻璃微流控芯片.該芯片制作簡(jiǎn)單,成本低,能夠有效的應(yīng)用于糖類物質(zhì)的分析和檢測(cè).

    參考文獻(xiàn):

    [1]霍丹群,劉振,侯長(zhǎng)軍,等.微流控芯片光學(xué)檢測(cè)技術(shù)在細(xì)胞研究中的應(yīng)用與進(jìn)展[J].分析化學(xué),2010 (9):1357-1365. HUO D Q,LIU Z,HOU C J,et al. Recent advance on optical detection method and techniques for cell-based microfluidic systems[J]. Chinese journal of analytical chemistry,2010(9):1357-1365.

    [2]馬亮波,徐溢,梁靜,等.微流控芯片電泳電導(dǎo)檢測(cè)分離分析尿蛋白[J].分析化學(xué),2011(8):1123-1128. MA L B,XU Y,LIANG J,et al. Separation and detec?tion of urinary protein by microfluidic chip integrated contactless conductivity detector[J]. Chinese journal of analytical chemistry,2011(8):1123-1128.

    [3]于冰,任玉敏,叢海林,等.微流控芯片電泳的研究進(jìn)展[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2011,30:1067-1073. YU B,REN Y M,CONG H L,et al. Research progress of electrophoresis on microfluidic chips[J]. Journal of instrumental analysis,2011,30:1067-1073.

    [4]方艷夕,朱金坤,時(shí)維靜,等.白頭翁中糖類組分的毛細(xì)管電泳-安培檢測(cè)研究[J].中成藥,2013,35:1504-1508. FANG Y X,ZHU J K,SHI W J,et al. Saccharides in pulsatillae radix by capillary electrophoresis-ampero?metric detection[J]. Chinese patent medicine,2013,35:1504-1508.

    [5]MANZ A,GRABER N,WIDMER H M. Miniaturized total chemical analysis systems:a novel concept for chemical sensing[J]. Sensors and actuators B:chemi?cal,1990(1):244-248.

    [6]張峰,張宏毅,周勇亮,等.濕法腐蝕硅制作PDMS微流控芯片[J].機(jī)械工程學(xué)報(bào),2006,41(11):194-198. ZHANG F,ZHANG H Y,ZHOU Y L,et al. Fabrica?tion of PDMS microfluidic chip by wet etching silicon [J]. Chinese journal of mechanical engineering,2006,41(11):194-198.

    [7]羅怡,婁志峰,褚德南,等.玻璃微流控芯片的制作[J].納米技術(shù)與精密工程,2004,2(1):20-23. LUO Y,LOU Z F,CHU D N,et al. Fabrication of glass microfluidic chip[J]. Nanotechnology and precision engineering,2004,2(1):20-23.

    [8]陳強(qiáng),李剛,潘愛平,等.玻璃微流控芯片廉價(jià)快速制作方法的研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào),2007,65(17):1863-1868. CHEN Q,LI G,PAN A P,et al. Study on low-cost and fast fabrication method of glass microfludic chips[J]. Acta chimica sinica,2007,65(17):1863-1868.

    本文編輯:龔曉寧

    Preparation of Microfludic Chip for Sugar Detection

    PI Xiaoqiang1,2,WANG Shenggao1,2,LIU Xingxing1,2,ZHANG Wei1,2,CHEN Rui1,2,CUI Lijia1,2

    1.School of Materials Science and Engineering,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430074,China;
    2.Hubei Key Laboratory of Plasma Chemistry&Advanced Materials(Wuhan Institute of Technology),Wuhan 430074,China

    Abstract:The micro channels on the surface of Polydimethylsiloxane(PDMS)were prepared by soft lithogra?phy technology,and the glass substrate integrated with metal membrane electrode was prepared by lithography?wet etching and magnetron sputtering coating technology. After the surface oxygen plasma treatment of PDMS and glass substrate,the PDMS?glass microfluidic chip was prepared through reversible bonding. Finally,the sugar detection performance of the microfluidic chip was analyzed using the honey from a market as a testing material. The result shows that the glucose,sucrose and fructose in honey can be successfully separated and detected in 3 min at the running voltage of 850 V and 50 mmol/L sodium hydroxide solution

    Keywords:microfluidic chip;magnetron sputtering;electrophoretic separation;electrochemical detection;suger

    *通訊作者:王升高,博士,教授. E-mail:wyysg@163.com

    作者簡(jiǎn)介:皮曉強(qiáng),碩士研究生. E-mail:1198475188@qq.com

    基金項(xiàng)目:湖北省科技支撐計(jì)劃(2015BAA093);國(guó)家自然科學(xué)基金(51272187);湖北省自然科學(xué)基金(2013CFA012)

    收稿日期:2016-01-04

    文章編號(hào):1674 - 2869(2016)01 - 0052 - 04

    中圖分類號(hào):R284.1

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    doi:10. 3969/j. issn. 1674?2869. 2016. 01. 009

    猜你喜歡
    磁控濺射
    C/C復(fù)合材料表面磁控濺射ZrN薄膜
    俄用磁控濺射法制造燃料電池電解質(zhì)
    2019高功率脈沖磁控濺射沉積薄膜技術(shù)與應(yīng)用會(huì)議將在蘭州召開
    Zr含量對(duì)磁控濺射NiCrZr薄膜結(jié)構(gòu)及耐蝕性的影響
    N2氣流量比對(duì)磁控濺射Mo-N涂層結(jié)構(gòu)和性能的影響
    復(fù)雜腔體件表面磁控濺射鍍膜關(guān)鍵技術(shù)的研究
    AZO薄膜理想表面形貌的制備與加工工藝優(yōu)化
    工藝參數(shù)對(duì)直流磁控濺射法制備氧化鋁薄膜的試驗(yàn)研究
    調(diào)制中頻高功率脈沖磁控濺射電源的設(shè)計(jì)
    微波介質(zhì)陶瓷諧振器磁控濺射金屬化
    涩涩av久久男人的天堂| 九九在线视频观看精品| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲人成网站在线播| 国产久久久一区二区三区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产成人免费观看mmmm| 一区二区三区免费毛片| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲无线观看免费| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 精品午夜福利在线看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 精品视频人人做人人爽| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 七月丁香在线播放| 国内精品宾馆在线| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲经典国产精华液单| 国产伦精品一区二区三区视频9| 69人妻影院| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲,一卡二卡三卡| 美女高潮的动态| 少妇的逼水好多| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲欧洲日产国产| 99热这里只有是精品在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久女婷五月综合色啪小说 | 日本黄色片子视频| 亚洲在久久综合| 只有这里有精品99| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久精品人妻少妇| 深爱激情五月婷婷| 久久久久久久大尺度免费视频| 高清视频免费观看一区二区| 久久精品国产自在天天线| 午夜亚洲福利在线播放| 18禁动态无遮挡网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日韩强制内射视频| 日韩一区二区三区影片| 在线精品无人区一区二区三 | 日韩成人av中文字幕在线观看| 免费在线观看成人毛片| 日本熟妇午夜| 久久久成人免费电影| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 成人二区视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日韩伦理黄色片| 国产黄片视频在线免费观看| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲精品成人久久久久久| 在线观看美女被高潮喷水网站| 韩国高清视频一区二区三区| 99久久九九国产精品国产免费| 精华霜和精华液先用哪个| 最近中文字幕高清免费大全6| 啦啦啦啦在线视频资源| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲自拍偷在线| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产69精品久久久久777片| 97超碰精品成人国产| 久久久午夜欧美精品| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲人与动物交配视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产精品一及| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩中字成人| 亚洲精品国产av成人精品| 男女那种视频在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产高清有码在线观看视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 国内精品美女久久久久久| xxx大片免费视频| 麻豆成人午夜福利视频| 国产伦在线观看视频一区| 中文欧美无线码| 综合色丁香网| 亚洲图色成人| 国产爱豆传媒在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 特大巨黑吊av在线直播| 全区人妻精品视频| 亚洲精品色激情综合| 亚洲精品日本国产第一区| 精品一区二区三卡| 亚洲自拍偷在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产黄片美女视频| 亚洲国产精品专区欧美| 国产淫片久久久久久久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久午夜欧美精品| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 特大巨黑吊av在线直播| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲自偷自拍三级| 久久精品久久久久久久性| 精品少妇黑人巨大在线播放| 最近最新中文字幕免费大全7| 一本一本综合久久| 91狼人影院| 美女主播在线视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日韩视频在线欧美| 亚洲欧美日韩无卡精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 综合色av麻豆| 干丝袜人妻中文字幕| 黄色一级大片看看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 日韩一本色道免费dvd| 久久影院123| 干丝袜人妻中文字幕| 伦理电影大哥的女人| 久久久久久伊人网av| 一本一本综合久久| 中国美白少妇内射xxxbb| 日韩伦理黄色片| 最近手机中文字幕大全| 亚洲国产精品999| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 尾随美女入室| 免费电影在线观看免费观看| 久久99热6这里只有精品| 国产欧美亚洲国产| 午夜激情久久久久久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 久久久久久久亚洲中文字幕| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 久久亚洲国产成人精品v| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产免费视频播放在线视频| 午夜免费观看性视频| 深夜a级毛片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲在线观看片| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产探花在线观看一区二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久久欧美国产精品| 亚洲天堂av无毛| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产在线男女| 国产成人免费观看mmmm| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费看光身美女| 高清日韩中文字幕在线| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲精品国产色婷婷电影| 晚上一个人看的免费电影| 免费观看av网站的网址| 欧美zozozo另类| 亚洲av在线观看美女高潮| 在线看a的网站| 欧美一区二区亚洲| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲精品日本国产第一区| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲av男天堂| 99热全是精品| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产成人精品婷婷| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品一区二区性色av| 久久综合国产亚洲精品| 成人综合一区亚洲| 又大又黄又爽视频免费| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品久久久久久久电影| 观看美女的网站| 亚洲av在线观看美女高潮| 日韩人妻高清精品专区| 97热精品久久久久久| 午夜视频国产福利| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲最大成人手机在线| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲av福利一区| 嘟嘟电影网在线观看| 国产成人精品久久久久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产综合懂色| 在线观看一区二区三区| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 亚洲熟女精品中文字幕| 久久久久精品性色| 全区人妻精品视频| 深爱激情五月婷婷| 老女人水多毛片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日韩成人伦理影院| 国产男人的电影天堂91| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 91久久精品电影网| 丰满少妇做爰视频| 国产欧美亚洲国产| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产乱人视频| 毛片女人毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲国产欧美人成| 国产免费又黄又爽又色| 精品久久久久久电影网| 天堂俺去俺来也www色官网| 免费观看在线日韩| 色播亚洲综合网| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 中文在线观看免费www的网站| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 五月开心婷婷网| 亚洲国产欧美人成| 夜夜爽夜夜爽视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 美女高潮的动态| 人妻夜夜爽99麻豆av| 在线观看免费高清a一片| 18+在线观看网站| 七月丁香在线播放| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产黄色免费在线视频| 国产 精品1| 亚洲经典国产精华液单| 校园人妻丝袜中文字幕| 青春草视频在线免费观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 99热6这里只有精品| 99视频精品全部免费 在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | av网站免费在线观看视频| 欧美成人a在线观看| kizo精华| 久久久精品94久久精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品成人在线| 少妇熟女欧美另类| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美激情国产日韩精品一区| 青春草亚洲视频在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产黄频视频在线观看| 午夜激情福利司机影院| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 在现免费观看毛片| 成年女人看的毛片在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲最大成人中文| 舔av片在线| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲av免费在线观看| 久久99热6这里只有精品| 交换朋友夫妻互换小说| 毛片女人毛片| av.在线天堂| 国产成人a∨麻豆精品| 伦精品一区二区三区| 色哟哟·www| 最近最新中文字幕大全电影3| 日韩伦理黄色片| 性色av一级| 中文字幕av成人在线电影| 一级毛片我不卡| 不卡视频在线观看欧美| 青青草视频在线视频观看| 成人美女网站在线观看视频| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久精品久久久久久久性| 国产乱人视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产成人精品久久久久久| 一区二区三区免费毛片| 夫妻性生交免费视频一级片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 最近手机中文字幕大全| 三级经典国产精品| 免费观看无遮挡的男女| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 人妻一区二区av| 精品一区在线观看国产| 国产又色又爽无遮挡免| 激情 狠狠 欧美| 成人欧美大片| 精品久久国产蜜桃| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品国产成人久久av| 日韩电影二区| 在线观看三级黄色| 中文字幕久久专区| 一级片'在线观看视频| 丝袜喷水一区| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲人成网站高清观看| 国产男人的电影天堂91| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 搡女人真爽免费视频火全软件| 女的被弄到高潮叫床怎么办| av国产免费在线观看| 人妻系列 视频| 午夜福利高清视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲av日韩在线播放| 一级毛片我不卡| 免费av不卡在线播放| 国产av国产精品国产| 国产精品99久久久久久久久| 校园人妻丝袜中文字幕| www.av在线官网国产| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久久久久久久成人| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲国产欧美在线一区| 日本三级黄在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 婷婷色综合www| 大陆偷拍与自拍| 国产成人a∨麻豆精品| 伦理电影大哥的女人| 久久6这里有精品| 日韩国内少妇激情av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲国产精品999| 一级二级三级毛片免费看| 免费av观看视频| 国产视频首页在线观看| av在线亚洲专区| 久久久精品欧美日韩精品| 国产又色又爽无遮挡免| 超碰av人人做人人爽久久| 91精品一卡2卡3卡4卡| 嫩草影院精品99| 18+在线观看网站| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产在线男女| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲精品一二三| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 中国美白少妇内射xxxbb| 深爱激情五月婷婷| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产精品国产三级国产专区5o| 久久精品人妻少妇| 国产亚洲一区二区精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久精品国产a三级三级三级| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产日韩欧美亚洲二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 最近最新中文字幕大全电影3| 日韩大片免费观看网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 在线观看一区二区三区激情| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 精品久久国产蜜桃| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产精品精品国产色婷婷| 日韩成人伦理影院| 久久6这里有精品| 成人亚洲精品一区在线观看 | 免费黄色在线免费观看| 日本与韩国留学比较| 女人被狂操c到高潮| 深夜a级毛片| 亚洲精品国产av蜜桃| 又大又黄又爽视频免费| 免费黄频网站在线观看国产| 精品久久久久久久久av| 免费看不卡的av| 青青草视频在线视频观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 能在线免费看毛片的网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲精品456在线播放app| 26uuu在线亚洲综合色| 久久精品国产a三级三级三级| 久久久久久伊人网av| 一级爰片在线观看| av一本久久久久| 麻豆成人av视频| 亚洲色图综合在线观看| 国产av码专区亚洲av| 久久久久网色| 国产精品偷伦视频观看了| 国产一级毛片在线| 亚洲国产精品专区欧美| 日韩电影二区| 欧美一区二区亚洲| 亚洲经典国产精华液单| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费高清在线观看视频在线观看| 香蕉精品网在线| 精品久久久久久电影网| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲精品国产成人久久av| 久久久久久久久久成人| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品一二三区在线看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久精品国产亚洲av天美| 免费av毛片视频| 亚洲人成网站高清观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 熟女av电影| 久久6这里有精品| 人体艺术视频欧美日本| 国产美女午夜福利| 精品人妻视频免费看| 中文字幕免费在线视频6| 国产成人91sexporn| 色婷婷久久久亚洲欧美| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品久久久久久精品古装| 久久精品国产自在天天线| 国产综合懂色| 成人特级av手机在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲高清免费不卡视频| 国内精品美女久久久久久| 久久人人爽人人片av| eeuss影院久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美另类一区| 国产毛片a区久久久久| 插阴视频在线观看视频| 亚洲精品视频女| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲综合色惰| 另类亚洲欧美激情| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲成人久久爱视频| 日本色播在线视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲,欧美,日韩| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲国产成人一精品久久久| 777米奇影视久久| 亚洲无线观看免费| 丰满少妇做爰视频| 亚洲av国产av综合av卡| 久久精品国产亚洲av天美| 一级片'在线观看视频| 亚洲,欧美,日韩| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美精品一区二区大全| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产伦在线观看视频一区| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲av男天堂| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 性插视频无遮挡在线免费观看| 最近中文字幕2019免费版| 水蜜桃什么品种好| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 中文字幕久久专区| 最近中文字幕高清免费大全6| 日本免费在线观看一区| 久久精品久久久久久久性| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品一二三| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日韩一本色道免费dvd| 中文字幕免费在线视频6| 一级片'在线观看视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 禁无遮挡网站| 国产一区二区三区av在线| 久久久a久久爽久久v久久| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲成人av在线免费| 亚洲欧美一区二区三区国产| 精品国产三级普通话版| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 性插视频无遮挡在线免费观看| 22中文网久久字幕| 欧美极品一区二区三区四区| 麻豆国产97在线/欧美| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 免费观看的影片在线观看| 免费看a级黄色片| videos熟女内射| 一级二级三级毛片免费看| 熟女电影av网| 免费看av在线观看网站| 亚洲精品乱久久久久久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 一本一本综合久久| 五月伊人婷婷丁香| 欧美潮喷喷水| 欧美成人a在线观看| 亚洲精品自拍成人| 久久精品国产亚洲av天美| 激情五月婷婷亚洲| 国产老妇女一区| 韩国高清视频一区二区三区| 亚州av有码| 国产成人freesex在线| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲欧美日韩无卡精品| 中文字幕久久专区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲国产欧美人成| av天堂中文字幕网| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久久久久伊人网av| 亚洲无线观看免费| 一本一本综合久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 人妻 亚洲 视频| 天天躁日日操中文字幕| 免费高清在线观看视频在线观看| tube8黄色片| 91在线精品国自产拍蜜月| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产91av在线免费观看| 91久久精品国产一区二区三区| 最近中文字幕2019免费版| 国产亚洲一区二区精品| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 91狼人影院| 男人和女人高潮做爰伦理| 哪个播放器可以免费观看大片| 青春草视频在线免费观看| 国产成人a∨麻豆精品| 日日啪夜夜撸| 国产成人精品一,二区| 欧美激情在线99| 男女边摸边吃奶| 亚洲不卡免费看| 3wmmmm亚洲av在线观看| av在线老鸭窝| 国产亚洲最大av| 搞女人的毛片| 国产一区二区亚洲精品在线观看| av免费观看日本| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久影院123| 色网站视频免费| 成年人午夜在线观看视频| 街头女战士在线观看网站| 中文字幕免费在线视频6| 高清日韩中文字幕在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产av码专区亚洲av| 高清欧美精品videossex| av在线观看视频网站免费| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲欧洲日产国产| 少妇高潮的动态图| 国产人妻一区二区三区在| 成人黄色视频免费在线看| 真实男女啪啪啪动态图| 91久久精品国产一区二区三区| 伦理电影大哥的女人| 99久久精品国产国产毛片| 日韩一本色道免费dvd| 国产一级毛片在线| 久久久久久伊人网av| 成人欧美大片| 午夜免费鲁丝| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 在线观看一区二区三区激情| 91久久精品国产一区二区三区|