清熱散瘀解毒方對(duì)EP性發(fā)熱大鼠血清、下丘腦組織中cAMP含量的影響

李祖金樊 靜陳孟溪彭燕芬徐曉丹肖光輝（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙，4008；湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，長(zhǎng)沙，40006）

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清熱散瘀解毒方對(duì)EP性發(fā)熱大鼠血清、下丘腦組織中cAMP含量的影響

李祖金1樊 靜1陳孟溪2彭燕芬1徐曉丹1肖光輝1
（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙，410208；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，長(zhǎng)沙，410006）

摘要目的：通過觀察清熱散瘀解毒方對(duì)EP性發(fā)熱大鼠cAMP的影響，探討該方的退熱機(jī)理。方法：應(yīng)用隨機(jī)分組方法將大鼠分為清熱散瘀解毒方組（12只）、萘普生藥物組（12只）、模型組（12只），每組注射2，4-二硝基苯酚進(jìn)行小鼠非感染發(fā)熱造模，然后分別灌入中藥、西藥、生理鹽水（模型組和空白組）。2 h后測(cè)定體溫及血清中cAMP的含量，比較分析不同藥物對(duì)EP性發(fā)熱大鼠體溫的影響以及cAMP含量的變化。結(jié)果：中藥組和西藥組灌藥2 h后，體溫明顯低于模型組（P ＜0. 05）；中藥組、西藥組血清和下丘腦cAMP含量明顯低于模型組（P＜0. 05）。結(jié)論：清熱散瘀解毒方能降低EP性發(fā)熱大鼠體溫，其作用機(jī)理可能與下調(diào)機(jī)體血清和下丘腦組織中cAMP含量相關(guān)。

關(guān)鍵詞清熱散瘀解毒方；EP性發(fā)熱；作用機(jī)理；環(huán)磷酸腺苷

Effect of Qlngre Sanyu Jledu Decoctlon on cAMP Content ln Serum and Hypothalamus of Rats wlth EP Induced Fever

Li Zujin1，F(xiàn)an Jing1，Chen Mengxi1，Peng Yanfen2，Xu Xiaodan1，Xiao Guanghui1
（1 Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2 Affiliated Hospital of traditional Chinese and Western medicine，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410006，China）

Abstract Objectlve：To investigate the effect of Qingre Sanyu Jiedu decoction on cAMP of rats with EP induced fever. Methods：Rats were divided into the model group（n＝12），Chinese medicine group（n＝12），western medicine group（n＝12）. Rats in each group were injected with 2，4-dinitrophenol to establish fever models. A normal group（n＝6）was included in study. The normal group and model group were injected with saline，while Chinese medicine group and western medicine group were respectively injected with Qingre Sanyu Jiedu decoction and naproxen. The body temperature and the concentration of cAMP in serum and hypothalamus were measured two hours after injection. Results：The temperature of Chinese medicine group and western medicine group were lower than those of the model group. cAMP content in serum and hypothalamus of the Chinese medicine group and western medicine group were lower than vehicle group，which all showed statistical significance（P＜0. 05）. Concluslon：Qingre Sanyu Jiedu decoction may have the function of reducing temperature，and its mechanism may be related to the reduction of cAMP content in rat serum and hypothalamus.

Key Words Qingre Sanyu Jiedu decoction；EP induced fever；Effect mechanism；cAMP

癌癥發(fā)熱是指由惡性腫瘤引發(fā)的非感染性發(fā)熱，又稱“癌熱”“腫瘤熱”，為癌癥中晚期的常見表現(xiàn)之一，病程一般較長(zhǎng)。引發(fā)癌熱的機(jī)理尚不十分清楚，一般認(rèn)為可能與腫瘤細(xì)胞過度增生、壞死、釋放內(nèi)生性致熱源等因素相關(guān)［1-2］。癌性發(fā)熱目前還不能持續(xù)有效控制，一般為對(duì)癥處理，這也嚴(yán)重影響到患者的生存質(zhì)量［3］。本實(shí)驗(yàn)以2，4-二硝基苯酚進(jìn)行EP性發(fā)熱大鼠造模［4］，通過研究清熱散瘀解毒方對(duì)EP性發(fā)熱大鼠血清、下丘腦組織中cAMP含量的變化，進(jìn)一步探討該復(fù)方治療癌性發(fā)熱的可能作用機(jī)理。

1　材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)SD大鼠42只，平均體重（200±20）g，所有SD大鼠均來源于福建醫(yī)科大學(xué)附屬二院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室（fj150111）。采用隨機(jī)分組的方法，將大鼠分為四組，其中清熱散瘀解毒方組（以下簡(jiǎn)稱中藥組）12只，萘普生藥物組（以下簡(jiǎn)稱西藥組）12只，模型組12只，空白對(duì)照組6只。大鼠生存環(huán)境達(dá)到SPF級(jí)，按照大鼠生活習(xí)性，分晝夜自然照明，室內(nèi)溫度為22～25℃，環(huán)境相對(duì)濕度為50%左右，所有大鼠均予標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈水喂養(yǎng)。

1. 2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 cAMP酶聯(lián)免疫試劑盒（美國(guó)RD分裝），2，4-二硝基苯酚（江蘇瑞恒醫(yī)藥股份有限公司），萘普生片（上海惠仁藥業(yè)有限公司）。1）2，4-二硝基苯酚-氫氧化鈉溶液配制：精密稱取2，4-二硝基苯酚200 mg，置于60 mL 0. 9%氯化鈉注射液中，逐滴加入5 mol／L的氫氧化鈉溶液，持續(xù)攪拌，直至溶液由澄明變?yōu)榱咙S色，再加入0. 9%氯化鈉注射液至80 mL，配置成濃度為25 mg／mL的2，4-二硝基苯酚-氫氧化鈉溶液，待用。2）清熱散瘀解毒液熬制：按照清熱散瘀解毒處方劑量分別取黃芩、淮牛膝、水牛角、知母、生地黃、桃仁、赤芍、牡丹皮、西洋參、甘草等中草藥（安徽盛海堂中藥飲片有限公司），所有中草藥劑量均按人與大鼠間劑量關(guān)系換算。具體熬制過程如下：首先將水牛角與其他中草藥分開浸泡2 h，然后將水牛角加純凈水煮沸30 min，待冷卻后，再將浸泡過的藥材和浸泡液一同倒入容器內(nèi)，加適量純凈水，加蓋文火煮沸30 min，冷卻后，取出藥渣倒入鍋內(nèi)，繼續(xù)加水進(jìn)行第二次熬制，最后將兩次所得藥液合并在一起，待用。3）萘普生溶液配制：取兩片萘普生片（0. 1 g／片）溶于8 mL生理鹽水中，配制為25 mg／mL的萘普生溶液，保存待用。

1. 3 實(shí)驗(yàn)儀器 恒溫水域箱（GG112-10B，上海醫(yī)療器械廠）、臺(tái)式離心機(jī)（TDZ5-40，長(zhǎng)沙天創(chuàng)儀器公司）、自動(dòng)酶標(biāo)儀（352型，Labsystems Multiskan MS）、肛溫溫度計(jì)（SW-MT02，SUNNYWORL）、移液槍（大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）、－20℃電冰箱（美的電器有限公司）等，均為福建醫(yī)科大學(xué)附屬二院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備。

1. 4 試驗(yàn)方法 給藥：給藥前3 d分別于每天早晚測(cè)量?jī)纱误w溫，并詳細(xì)記錄，其每組體溫平均值作為該組基礎(chǔ)體溫。每組實(shí)驗(yàn)前10 h均禁食喂養(yǎng)。對(duì)大鼠皮下注射相同劑量2，4-二硝基苯酚，進(jìn)行EP發(fā)熱性造模。待大鼠發(fā)熱后立即給藥：西藥組采取萘普生溶液灌胃，中藥組采取清熱散瘀解毒方煎液灌胃，空白組、模型組采取生理鹽水灌胃。樣品及數(shù)據(jù)收集：注射2，4-二硝基苯酚后2 h測(cè)量記錄每組SD大鼠體溫。體溫記錄完全之后，處死大鼠并采血。然后取各組大鼠下丘腦組織于液氮中保存，待測(cè)。

1. 5 評(píng)價(jià)指標(biāo) 用高速離心機(jī)將采取的血液離心1 min，取上清液。然后采用酶聯(lián)免疫吸附法，按說明書操作檢測(cè)血清中cAMP含量；取預(yù)存的大鼠下丘腦組織50 mg，加2 mL冰醋酸，勻漿，3 000 r／min離心，取上清液，置于60℃水浴中用氮?dú)鈱⑸锨逡捍蹈桑缓蟀凑誧AMP酶聯(lián)免疫試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析 本文中所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17. 0處理，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為單因素多組比較，采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為方差分析，各組間的數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（-±s）表示，并用軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)符合正態(tài)性與方差齊性。數(shù)據(jù)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取α＝0. 05，若P＜0. 05，則具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　研究結(jié)果

2. 1 各組間造模前后大鼠體溫比較分析 在注射2，4-二硝基苯酚后2 h后，中藥組體溫為（39. 15± 0. 30）℃，西藥組為（39. 50±0. 37）℃，模型組為（39. 80±0. 33）℃，空白組為（37. 12±0. 32）℃。四組經(jīng)方差分析可知，中藥組、西藥組體溫低于模型組（P＜0. 05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2. 2 用藥后血清及下丘腦組織中cAMP含量分析

3組間cAMP含量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得P＜0. 05，每2組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥組血清cAMP含量明顯低于西藥組，中藥組和西藥組低于模型組。3組間下丘腦cAMP含量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得P＜0. 05，每2組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥組下丘腦cAMP含量低于西藥組，中藥組、西藥組低于模型組。說明中藥療效優(yōu)于西藥，且中藥和西藥均具有療效作用。

表1　3組造模后2 h溫度、血清及下丘腦組織中cAMP含量比較（±s，pg／mL）

表1　3組造模后2 h溫度、血清及下丘腦組織中cAMP含量比較（±s，pg／mL）

注：與空白組比較，*P＜0. 05；與模型組比較，△P＜0. 05；與中藥組比較，▲P＜0. 05。

組別　造模后2 h溫度　血清cAMP含量下丘腦cAMP 含量例數(shù)中藥組39. 15±0. 30*△▲0. 20±0. 21*△▲　0. 35±0. 16*△▲12西藥組39. 50±0. 37*△▲0. 40±0. 20*△▲　0. 54±0. 19*△▲　12模型組39. 80±0. 33△　0. 60±0. 22△　0. 77±0. 20△　12空白組37. 12±0. 32　 0. 63±0. 41　 0. 97±0. 11　 6

3　討論與分析

惡性腫瘤進(jìn)展期的常見癥狀之一就是癌性發(fā)熱，在臨床特征上，癌性發(fā)熱一般表現(xiàn)為中度發(fā)熱，病程較長(zhǎng)。如果伴有多種惡性腫瘤，可反復(fù)發(fā)熱和持續(xù)熱［3］。有研究表明，當(dāng)腫瘤完全或部分得到控制時(shí)，癌性發(fā)熱仍持續(xù)數(shù)月之久。然而，目前醫(yī)學(xué)研究尚未闡明癌性發(fā)熱的發(fā)病機(jī)理。相關(guān)研究報(bào)道可能與以下因素有關(guān)［5-7］：1）腫瘤細(xì)胞大量破壞壞死，釋放大量腫瘤壞死因子可引起發(fā)熱；2）腫瘤本身可能是致熱源之一；3）腫瘤可浸入下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，引起體溫調(diào)節(jié)失衡；4）腦部腫瘤組織生長(zhǎng)引起占位現(xiàn)象，嚴(yán)重影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，易引起癌性發(fā)熱；5）其他內(nèi)生性致熱原交織所致，如TNF-α、IL-1β，COX-2等。

對(duì)于癌性發(fā)熱的治療，西醫(yī)常用的處理方法為對(duì)癥處理，包括物理降溫和藥物治療。其中藥物治療常用的有非甾體類、激素類等，但這兩種藥物治療方法長(zhǎng)期使用引發(fā)的不良反應(yīng)往往較大，可導(dǎo)致惡心、嘔吐、出汗、頭暈、胃潰瘍及胃出血等并發(fā)癥［8］，給患者健康帶來極大損害，直接降低了患者生存率，具有很大局限性。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為癌性發(fā)熱屬于“內(nèi)傷發(fā)熱”范疇，常因氣血不足，陰陽失調(diào)，蘊(yùn)久化火所引起，是正虛邪實(shí)的病理表現(xiàn)［9］。有研究表明［3］，癌性發(fā)熱為人體陰陽失衡，臟腑功能失調(diào)，以及“虛”“瘀”“毒”，不同階段會(huì)表現(xiàn)為實(shí)證、虛證、虛實(shí)證。陳孟溪教授按照“虛、瘀、毒”致癌熱的理論，宗活血化瘀、涼血解毒治法，以《千金要方》之犀角地黃湯為基礎(chǔ)方，加桃仁、淮牛膝、西洋參、知母、黃芩等組成驗(yàn)方主治，古方新用，意在共奏活血散瘀、清熱解毒、養(yǎng)陰生津以退癌熱，臨床應(yīng)用經(jīng)對(duì)照研究證實(shí)效果良好［10］。初步實(shí)驗(yàn)研究說明其作用機(jī)理可能與TNF-α、IL-1β，COX-2等內(nèi)生性致熱源相關(guān)［3］。

為進(jìn)一步闡明該方作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬從cAMP含量變化角度進(jìn)一步探討，進(jìn)行深入的多角度研究。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）屬于核苷酸衍生物，廣泛存在于機(jī)體內(nèi)，是一種常見的蛋白酶激活劑，因其在細(xì)胞間充當(dāng)中介遞質(zhì)，所以常被稱作“第二信使”［11］。近年來，有大量研究表明機(jī)體體溫和cAMP的含量變化呈正相關(guān)，同時(shí)cAMP與癌性發(fā)熱有密切關(guān)聯(lián)。且cAMP細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)對(duì)癌性細(xì)胞增殖起重要調(diào)節(jié)作用，癌性細(xì)胞的非正常生長(zhǎng)可能與細(xì)胞cAMP含量相關(guān)［12］。因此課題組選擇cAMP為癌熱機(jī)理研究觀察指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明清熱散瘀解毒方對(duì)EP性發(fā)熱大鼠模型退熱效果確切，其作用機(jī)理可能是降低機(jī)體內(nèi)cAMP的含量，進(jìn)而降低機(jī)體體溫。

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（2015－03－30收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng)）

中圖分類號(hào)：R289. 5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 033

通信作者：陳孟溪，地址：湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，郵編：410006，E-mail：5600378＠sohu. com

基金項(xiàng)目：湖南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)資助項(xiàng)目（編號(hào)：201118）