經(jīng)穴注射BMSCs聯(lián)合中藥對(duì)下肢缺血大鼠促血管生成相關(guān)因子的影響

黃 鳳葉永生董 雨董建勛王伏聲丁 毅榮培晶徐旭英

（1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院瘡瘍血管外科，北京，100010；2北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029；3中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京，100700）

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經(jīng)穴注射BMSCs聯(lián)合中藥對(duì)下肢缺血大鼠促血管生成相關(guān)因子的影響

黃 鳳1葉永生2董 雨1董建勛1王伏聲1丁 毅1榮培晶3徐旭英1

（1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院瘡瘍血管外科，北京，100010；2北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029；3中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京，100700）

摘要目的：觀(guān)察經(jīng)穴注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）聯(lián)合益氣活血中藥對(duì)糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）大鼠缺血后肢骨骼肌中促血管生成因子的表達(dá)情況。方法：80只SD大鼠1∶7隨機(jī)分為2組：正常假手術(shù)組10只，其余70只一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，50. 0 mg／kg）制成DM大鼠模型，再等比例隨機(jī)分為7組，即DM假手術(shù)組、DM缺血組、益氣活血中藥組、局部注射BMSCs組、局部注射BMSCs＋中藥組、穴位注射BMSCs組、穴位注射BMSCs＋中藥組，每組10只。應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)大鼠后肢骨骼肌中VEGF、bFGF mRNA的表達(dá)。結(jié)果：穴位注射BMSCs＋中藥組術(shù)側(cè)VEGF mRNA表達(dá)量較DM假手術(shù)組升高（P＜0. 05）；DM假手術(shù)組、局部注射組、穴位注射組術(shù)側(cè)bFGF mRNA表達(dá)量較健側(cè)升高（P＜0. 05）；局部注射＋中藥組、穴位注射＋中藥組術(shù)側(cè)bFGF mRNA表達(dá)量較正常血糖假手術(shù)組、DM假手術(shù)組、DM缺血組升高（P＜0. 05）；穴位注射＋中藥組健側(cè)bFGF mRNA表達(dá)量較正常血糖假手術(shù)組、DM假手術(shù)組、DM缺血組、中藥組、局部注射組升高（P＜0. 05）。結(jié)論：穴位注射BMSCs結(jié)合益氣活血中藥可明顯促進(jìn)血管生成因子VEGF、bFGF的表達(dá)，益氣活血中藥可能促進(jìn)穴位注射BMSCs的成活率從而提高促血管生成因子VEGF、bFGF的表達(dá)。

關(guān)鍵詞糖尿病下肢缺血；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF；穴位注射；骨骼間充質(zhì)干細(xì)胞

The Effect of Acupolnt Injectlon of BMSCs Comblned wlh Chlnese Medlclne on VEGF／bFGF of Dlabetlc Rats wlth Lower Llmbs Ischemlc

Huang Feng1，Ye Yongsheng2，Dong Yu1，Dong Jianxun1，Wang Fusheng1，Ding Yi1，Rong Peijing3，Xu Xuying1
（1 Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital University of Medicine Sciences，Beijing 100010，China；2 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；3 Institute of Acu-Mox，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

Abstract Objectlve：To observe the expression of angiogenesis factor in skeletal muscle of diabetic rats with lower limbs ischemia during acupoint injection of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）with Qi-tonifying and Blood-activating Chinese medicine. Methods：Eighty Sprague Dawley（SD）rats were randomly divided into 2 groups，10 rats in the normal blood sugar control （NMC）grooup. The other 70 rats were intraperitoneally injected Streptozotocin（50. 0 mg／kg）to make DM model，then were randomly divided into 7 groups equally，namely diabetes control（DMC）group，diabetes ischemic（DMI）group，Qi-tonifying and Blood-activating（QB）group，local injection BMSCs（L-BMSCs）group，L-BMSCs＋QB group，acupoint injection BMSCS （Acu-BMSCs）group，and Acu-BMSCs＋QB group. Using RT-PCR method to detect the expression of VEGF and bFGF mRNA in muscular tissue. Results：The expression of VEGF mRNA on the operation side in Acu-BMSCs＋QB group was higher than DMC group（P＜0. 05）. The expression of bFGF mRNA on the operation side in DMC，L-BMSCs，Acu-BMSCs groups were higher than the uninjured side（P＜0. 05），and those in L-BMSCs，Acu-BMSCs＋QB groups were higher than NMC，DMC，DMI groups（P＜0. 05）. The expression of bFGF mRNA on the uninjured side in Acu-BMSCs＋QB group was higher than NMC，DMC，DMI，QB，L-BMSCs groups（P＜0. 05）. Concluslon：The expression of VEGF，bFGF were positively affected by acupoint injection of BMSCs combined with QB，which means QB Chinese herb could improve the expression of angiogenesis factor by increasing the survival rate of BMSCs injected in acupoint.

Key Words Diabetic；Lower limb ischemia；VEGF；bFGF；Acupoint injection；BMSCs

糖尿病下肢缺血是一種發(fā)病率高、發(fā)病較重的缺血性病變。2007年流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)7個(gè)大中城市50歲以上伴有一個(gè)以上危險(xiǎn)因素的糖尿病患者19. 47%患有PAD，其中男性占到18. 3%，女占到20. 4%，70歲以上PAD患病率更高，達(dá)31. 9%［1］。目前，外科血管重建術(shù)可在一定時(shí)間內(nèi)改善缺血肢體灌注量，但卻存在手術(shù)并發(fā)癥和死亡率的風(fēng)險(xiǎn)，且重建的血管再度狹窄率也較高。藥物治療雖可改善癥狀，但并不能徹底改善局部灌注。尋求最終改善缺血組織的灌注，提高患者的生活質(zhì)量，降低致殘率的有效治療方法仍是臨床工作亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)，干細(xì)胞療法應(yīng)用于臨床與實(shí)驗(yàn)促進(jìn)血管生成的研究［2］為這一疾病的治療提供了新的思路，并具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，因此，研究干細(xì)胞療法在治療DM下肢缺血中的意義、機(jī)制和具體應(yīng)用有著十分重要的臨床意義和研究?jī)r(jià)值。

1　材料與方法

1. 1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性大鼠80只，體重為200～ 220 g雄性SD大鼠，購(gòu)買(mǎi)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1. 2 藥品與試劑 提純?cè)噭┖衂3100，GoScript試劑盒（A5000），GoTaq qPCR Master Mix（A6001），Promega（北京）生物技術(shù)有限公司；PCR引物合成，北京諾賽基因組研究中心有限公司；Mx3000P熒光定量PCR儀，Agilent StratageneInc. USA；鏈脲佐菌素（S0130），Sigma；益氣活血方由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑室制備。

1. 3 儀器 紫外分光光度計(jì)（Pharmacia Biotech），GeneQuant；PCR擴(kuò)增儀（GeneAmp9700），Applied Biosystems；Rea-Time PCR（Mx3000P），Agilent Technologies Stratagene。

1. 4 動(dòng)物分組與造模方法

1. 4. 1 動(dòng)物分組 80只SD大鼠，先后隨機(jī)分為8組，分組情況及干預(yù)方法如表1。

表1　分組情況及干預(yù)方法

1. 4. 2 造模方法 經(jīng)普食普水適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，以1∶7隨機(jī)分為2組，正常假手術(shù)組10只，其他70只大鼠在禁食6 h后左下腹腹腔注射STZ 50. 0 mg／kg（溶于0. 1 mmol／L、pH值＝4. 2的檸檬酸鈉－檸檬酸緩沖溶液）以制備糖尿病模型［3］。于造模后3、7、14、28 d尾靜脈采血針取血檢測(cè)隨機(jī)血糖濃度，以血糖值＞16. 0 mmol／L作為糖尿病模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)。

糖尿病模型造模1個(gè)月后，將糖尿病造模成功血糖值＞16. 0 mmol／L的大鼠，等比例隨機(jī)分組后按要求行以下方法制備左后肢缺血模型。

術(shù)前大鼠用濃度為350 mg／kg水合氯醛麻醉（麻醉劑量：10 mL／kg），經(jīng)常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，經(jīng)左側(cè)腹股溝韌帶中點(diǎn)（摸到股動(dòng)脈搏動(dòng)后）做一個(gè)1 ～1. 5 cm的縱行皮膚切口暴露股動(dòng)脈。

正常血糖假手術(shù)組與糖尿病大鼠假手術(shù)組：游離股動(dòng)脈，不行結(jié)扎、也不切除動(dòng)脈術(shù)，直接縫合切口。

糖尿病大鼠后肢缺血模型：大鼠左側(cè)后肢缺血模型。游離股動(dòng)脈后，用1號(hào)線(xiàn)結(jié)扎近端股動(dòng)脈，切除股動(dòng)脈、遠(yuǎn)端隱動(dòng)脈和所有側(cè)支血管。術(shù)畢，5-0縫合線(xiàn)縫合皮膚，建立糖尿病大鼠左側(cè)后肢缺血模型。

1. 4. 3 穴位注射 取穴：凡局部注射取缺血組織與正常假手術(shù)組織交界處等距離選取5個(gè)點(diǎn)為注射部位，注射標(biāo)記的BMSCs，每只共注射100 μL 1×106個(gè)細(xì)胞［4］，每處注射20 μL；假手術(shù)組、模型對(duì)照組注射等量1×PBS＋蒸餾水灌胃；中藥治療各組分別選用相應(yīng)中藥灌胃。

穴位如表2［5］。

表2　注射穴位及定位

1. 5 RT-PCR法測(cè)VEGF、bFGF在大鼠下肢缺血骨骼肌中的表達(dá) 大鼠麻醉后，取每組大鼠術(shù)側(cè)后肢骨骼肌50～100 mg，將取得的新鮮組織迅速放入已標(biāo)記無(wú)RNA酶凍存管，立即放入液氮儲(chǔ)存，后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存。Trizol一步法提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系：總RNA2 μg，Oligo（dT）1 μg，引物1 μg，加入Nuclease-Free Water至10 μL，反應(yīng)條件：70℃、5 min終止反應(yīng)后，立即行PCR反應(yīng)。引物序列：GAPDH上游5'-TCCATCAAGGGAGTGTGTGC-3'，下游5'TCCGTGACCGGTAAGTGTTG-3'；VEGF上游5'-GTCACCGTCGACAGAACAGT-3'，下游5'-GACCCAAAGTGCTCCTCGAA3'；bFGF上游5'-TCCATCAAGGGAGTGTGTG-3'，下游5'-TCCGTGACCGGTAAGTGTTG-3'；PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，引物0. 8 μL，GoTaq qPCR Master Mix 10 μL，加Nuclease-Free Water至20 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃引物退火15 s，60 ℃1 min；熔解曲線(xiàn)95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s，共40個(gè)循環(huán)。

1. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用MxPro Mx3005P 4. 0軟件分析曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將各樣品測(cè)得的Ct值換算成拷貝數(shù)，分析各組檢測(cè)樣本中目的基因拷貝數(shù)相對(duì)于陽(yáng)性定量參考樣品的基因拷貝數(shù)，分析方法利用2－△△Ct方法，比較組間基因拷貝數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19. 0統(tǒng)計(jì)軟件分析比較，計(jì)量資料采用（± s）的形式表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P＜0. 05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)大鼠后肢術(shù)側(cè)、健側(cè)骨骼肌中VEGF mRNA和bFGF mRNA的表達(dá)水平。

2. 1 各組大鼠后肢骨骼肌中VEGF mRNA表達(dá)量的比較 經(jīng)t檢驗(yàn)，術(shù)側(cè)與健側(cè)VEGF mRNA表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0. 05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

經(jīng)ANOVA檢驗(yàn)，與DM假手術(shù)組比較，穴位注射BMSCs＋中藥組術(shù)側(cè)VEGF mRNA表達(dá)量明顯升高（P＜0. 05），差異有統(tǒng)計(jì)意義（見(jiàn)表3，圖1）。

表3　各組大鼠后肢骨骼肌中VEGF mRNA表達(dá)量分析（-±s）

表3　各組大鼠后肢骨骼肌中VEGF mRNA表達(dá)量分析（-±s）

注：經(jīng)ANOVA檢驗(yàn)：與DM假手術(shù)組比較，*P＜0. 05。

分組　　患側(cè)（L側(cè)）　　健側(cè)（R側(cè)）正常假手術(shù)組0. 54±0. 18　0. 64±0. 26 DM假手術(shù)組　0. 38±0. 05　0. 48±0. 19 DM缺血組　0. 43±0. 06　0. 46±0. 12中藥組　0. 73±0. 30　0. 68±0. 09局部注射組　0. 61±0. 16　0. 67±0. 29局部＋中藥組　0. 71±0. 15　0. 78±0. 25穴位注射組　0. 81±0. 23　0. 71±0. 22穴位＋中藥組　0. 99±0. 37*0. 82±0. 12

2. 2 各組大鼠后肢骨骼肌中bFGF mRNA表達(dá)量的比較 經(jīng)t檢驗(yàn)，與健側(cè)比較，DM假手術(shù)組、局部注射組、穴位注射組術(shù)側(cè)bFGF mRNA表達(dá)量明顯升高（P＜0. 05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　各組大鼠后肢骨骼肌中VEGF、bFGF mRNA表達(dá)量組內(nèi)與組間比較圖

經(jīng)ANOVA檢驗(yàn)，與正常血糖假手術(shù)組、DM假手術(shù)組、DM缺血組比較，局部注射＋中藥組、穴位注射＋中藥組術(shù)側(cè)bFGF mRNA表達(dá)量明顯升高（P ＜0. 05）；且穴位注射＋中藥組較中藥組明顯升高（P＜0. 01），差異均有統(tǒng)計(jì)意義（見(jiàn)表4，圖1）。

穴位注射＋中藥組健側(cè)bFGF mRNA表達(dá)量明顯較正常血糖假手術(shù)組、DM假手術(shù)組、DM缺血組、中藥組、局部注射組升高（P＜0. 05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表4，圖1）。

表4　各組大鼠后肢骨骼肌中bFGF mRNA表達(dá)量分析（-±Se）

表4　各組大鼠后肢骨骼肌中bFGF mRNA表達(dá)量分析（-±Se）

注：經(jīng)t檢驗(yàn)：與健側(cè)比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01。經(jīng)ANOVA檢驗(yàn)：與正常假手術(shù)組比較，△P＜0. 05；與DM假手術(shù)組比較，▲P＜0. 05；與DM缺血組比較，□□P＜0. 01；與中藥組比較，■P＜0. 05；與局部注射組比較，○P＜0. 05。

分組　　患側(cè)（L側(cè)）　　健側(cè)（R側(cè)）正常假手術(shù)組1. 79±0. 63　1. 03±0. 10 DM假手術(shù)組　1. 53±0. 19*　1. 05±0. 29 DM缺血組　1. 81±0. 33　0. 75±0. 14中藥組　2. 62±1. 03　1. 08±0. 18局部注射組　4. 23±1. 09*　0. 90±0. 48局部＋中藥組　5. 43±2. 38△▲□　1. 12±0. 32穴位注射組　4. 40±0. 88*　1. 13±0. 42穴位＋中藥組　6. 05±2. 56△▲□■　2. 03±0. 15△▲□□■○

3　討論

缺血組織血管新生過(guò)程復(fù)雜，需要各種因子之間相互協(xié)同或制約作用從而形成新的血管。VEGF是目前最重要的、促血管生成作用最強(qiáng)的血管生長(zhǎng)因子之一。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞外基質(zhì)的成分，促進(jìn)血管的新生［6］。VEGF主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞，屬于胞漿內(nèi)表達(dá)抗原，可產(chǎn)生血管基底膜分解所需要的蛋白酶及特定的整合素，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移［7］；促進(jìn)骨髓源性的EPCs聚集和活化，提高小血管通透性，使血漿蛋白外滲并形成細(xì)胞外基質(zhì)，引起內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［8］，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡［9］，其兩種旁分泌因子具有維持血管內(nèi)皮的完整性和修復(fù)內(nèi)皮損傷的作用。局部應(yīng)用VEGF可產(chǎn)生全身效應(yīng)。

研究證明，體內(nèi)許多組織都分布和表達(dá)bFGF，尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌和高度血管化的器官［10-11］。bFGF亦是體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最為有效的促血管形成因子之一［12-13］，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)VEGF的產(chǎn)生和誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的VEGFR-2的表達(dá)增強(qiáng)VEGF的促血管生成作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，術(shù)側(cè)與健側(cè)比較，VEGF mRNA、 bFGF mRNA表達(dá)量均不同程度升高趨勢(shì)，說(shuō)明在結(jié)扎離斷大鼠后肢股動(dòng)脈造成骨骼肌缺血缺氧時(shí)，便會(huì)刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF、bFGF等因子，使促血管生成因子表達(dá)升高。穴位注射BMSCs＋中藥組術(shù)側(cè)VEGF mRNA、bFGF mRNA表達(dá)量較DM缺血模型組明顯升高，說(shuō)明經(jīng)穴注射BMSCs聯(lián)合中藥比單純穴位注射BMSCs、局部注射BMSCs或單用中藥更能刺激VEGF、bFGF的分泌，說(shuō)明穴位注射BMSCs聯(lián)合中藥對(duì)促進(jìn)DM缺血后肢骨骼肌中VEGF、bFGF等促血管因子的表達(dá)量，以此推測(cè)對(duì)促進(jìn)毛細(xì)血管新生、改善DM后肢缺血有積極作用。

文獻(xiàn)報(bào)道注射干細(xì)胞通常分為以下幾種：肌肉注射［14］、動(dòng)、靜脈管腔內(nèi)灌注［15］等方式，但管腔注射容易因?yàn)檫h(yuǎn)端血管閉塞性病變而降低藥物到達(dá)局部的效果，且血流容易將細(xì)胞沖到其他非治療部位而引起不必要的血管增生性損傷，另外其操作難度亦較大。本課題組在原有干細(xì)胞移植的方法（局部肌肉注射、靜脈注射與動(dòng)脈注射）基礎(chǔ)之上不斷探索、創(chuàng)新，提出辨證循經(jīng)注射BMSCs聯(lián)合中藥以提高BMSCs存活率、分化能力以及療效的觀(guān)點(diǎn)。

對(duì)于經(jīng)穴注射BMSCs聯(lián)合益氣活血中藥促進(jìn)VEGF、bFGF表達(dá)增加的原因，大致歸納為以下幾點(diǎn)：一是刺激經(jīng)穴亦可起到調(diào)節(jié)臟腑功能的作用，從而起到一定的調(diào)節(jié)血糖的作用，對(duì)后肢缺血情況的改善起到一定的作用，從而也提高了注射后BMSCs的存活率；二是穴位注射有產(chǎn)生藥理作用速度快、作用強(qiáng)，與同藥等劑量下靜脈注射者相當(dāng)或超過(guò)，治療優(yōu)于皮下或肌肉注射［16］，經(jīng)穴給藥除選擇足三陰、三陽(yáng)經(jīng)，取“寧失其穴，勿失其經(jīng)”的理論外，亦選擇缺血局部穴位進(jìn)行注射，除起到經(jīng)穴效應(yīng)外，亦取其局部效應(yīng)，即經(jīng)絡(luò)理論之“局部取穴”，加快了藥物的吸收過(guò)程，提高了細(xì)胞的存活率，亦使細(xì)胞直達(dá)病所，發(fā)揮療效；另外，聯(lián)合益氣活血中藥，對(duì)促進(jìn)血液循環(huán)、調(diào)暢經(jīng)絡(luò)氣血、增強(qiáng)細(xì)胞活性、滋養(yǎng)血管神經(jīng)組織、提高大鼠整體功能亦有促進(jìn)作用。

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（2015－11－12收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng)）

中圖分類(lèi)號(hào)：R587. 2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 030

通信作者：徐旭英，Tel：（010）52176058，E-mail：xxying7341＠126. com；榮培晶，Tel：（010）64089302，E-mail：drrongpj＠163. com

作者簡(jiǎn)介：第一黃鳳（1984—），女，內(nèi)蒙古烏海，博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥治療周?chē)芗膊〉呐R床與基礎(chǔ)研究，Tel：（010）52176642，E-mail：hf2061043＠163. com

基金項(xiàng)目：北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：7122084）；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)計(jì)劃（編號(hào)：2013-3-080）；北京市科委首都臨床特色應(yīng)用研究（編號(hào)：Z131107002213117）；北京市中醫(yī)藥科技年度規(guī)劃項(xiàng)目（編號(hào)：WZF2012-02）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)外科重點(diǎn)學(xué)科

共同第一作者：葉永生（1982—），男，中國(guó)香港，博士研究生，醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究，E-mail：drneil＠live. hk