參附注射液對(duì)阿霉素所致心衰大鼠氧化應(yīng)激水平及血管緊張素Ⅱ的影響

張志剛　　孫國棟　　常文華　　陳建忠山東省聊城市人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東聊城　252000

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參附注射液對(duì)阿霉素所致心衰大鼠氧化應(yīng)激水平及血管緊張素Ⅱ的影響

張志剛孫國棟常文華陳建忠▲
山東省聊城市人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東聊城252000

[摘要]目的探討參附注射液對(duì)阿霉素（ADR）所致心衰大鼠氧化應(yīng)激水平及血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ）的影響。方法將90只大鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組（作為陽性對(duì)照），參附注射液低、中、高劑量組，每組各15只。正常對(duì)照組僅給予等體積生理鹽水，模型組于實(shí)驗(yàn)開始后第2、4天腹腔注射ADR 1mg/kg，第6、8天腹腔注射ADR 2mg/kg，第10、12天腹腔注射ADR 3mg/kg，第14、16天腹腔注射ADR 4mg/kg，累計(jì)用藥劑量達(dá)20mg/kg。卡托普利組于實(shí)驗(yàn)開始后第5天卡托普利180mg/（kg·d）灌胃。參附組于造模后1周，按低、中、高劑量組分別腹腔注射參附注射液1、2、4mL/kg，每日1次，共2周。處理結(jié)束后測定心肌超氧化物歧化酶（SOD）活力和心肌丙二醛（MDA）含量；測定血清中AngiotensinⅡ水平。光鏡觀察心肌病理形態(tài)學(xué)變化；電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果阿霉素能顯著降低大鼠心肌SOD活性，卡托普利、4mL/kg參附注射液可將心肌中SOD活性升高至（125.26±7.21）、（128.44±10.02）U/L，與模型組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ADR也提高了大鼠心肌MDA含量和血清AngiotensinⅡ水平,而給予卡托普利、4mL/kg參附注射液處理后，大鼠心肌中MDA含量分別降至（8.82±0.16）、（8.48±0.28）nmol/mg，血清AngiotensinⅡ水平降至（388.32±6.88）、（395.21±10.02）ng/L，與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而且心肌的病理學(xué)形態(tài)有了很大改善。結(jié)論參附注射液可明顯改善心衰大鼠的心功能，保護(hù)機(jī)制可能與抗氧化及降低AngiotensinⅡ的含量有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]參附注射液；阿霉素；血管緊張素Ⅱ；心力衰竭；超氧化物歧化酶

心力衰竭是指心臟結(jié)構(gòu)或功能性疾病導(dǎo)致心室充盈或射血能力減弱而引起的臨床綜合征，發(fā)病率和病死率居高不下，其發(fā)生機(jī)制尚未完全明確[1]。阿霉素（Adriamycin，ADR）是一種對(duì)包括白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤具有抑制作用的蒽環(huán)類抗生素,臨床應(yīng)用廣泛，但其劑量依賴性的心臟毒性限制了臨床應(yīng)用[2-3]。如何利用有關(guān)藥物既發(fā)揮ADR抗腫瘤作用，又防止其心臟損害具有重要意義。近年來，某些藥用植物在心血管疾病的預(yù)防過程中具有一定的預(yù)防作用[4]。參附注射液具有抗氧化、清除自由基等作用,對(duì)心血管具有良好的保護(hù)作用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠建立ADR心力衰竭模型，通過檢測大鼠血液中的血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ）含量和病理組織學(xué)變化，探討參附注射液對(duì)ADR心力衰竭的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

UV751GD紫外/可見分光光度計(jì)（上海分析儀器廠）；TDK-4離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造廠）；JEM-1200EX透射電子顯微鏡（日本電子公司）。參附注射液（四川雅安三九藥業(yè)有限公司，10 mL/支，批號(hào)：Z2004-3117）；注射用鹽酸ADR（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，10 mg/瓶，批號(hào)：130702）；AngiotensinⅡ免疫試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2實(shí)驗(yàn)分組

清潔級(jí)SD大鼠90只，雌雄不限，體重250～280 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2006-0009。大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d。大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組（陽性對(duì)照）、參附注射液低劑量組、中劑量、高劑量組，每組15只。正常對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)處理同模型組，腹腔注射等劑量0.9%氯化鈉溶液；模型組：參考文獻(xiàn)[6]方法，于實(shí)驗(yàn)開始后第2、4天腹腔注射ADR 1mg/kg，第6、8天腹腔注射ADR 2mg/kg，第10、12天腹腔注射ADR 3mg/kg，第14、16天腹腔注射ADR 4mg/kg，第16天累計(jì)用藥劑量達(dá)20 mg/kg；卡托普利組：于實(shí)驗(yàn)開始后第5天卡托普利180mg/（kg·d）灌胃。參附注射液各劑量組：造模后1周，按低、中、高劑量組分別每次腹腔注射參附注射液1、2、4mL/kg，每日1次，共2周。

1.3左室重量指數(shù)的測定

末次給藥24 h，取大鼠動(dòng)脈血，分離血清備用。然后處死大鼠，取出心臟，洗凈后迅速分離左心室（含室間隔），濾紙吸干水分，電子天平稱重（單位為mg），計(jì)算左室重量指數(shù)。左室重量指數(shù)（LVMI，譯）=左室質(zhì)量/體重（LVW/BW）×1000譯。

1.4心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

取心室部分以10%甲醛固定，乙醇脫水后浸蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察；取心尖部米粒大小心臟，2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，磷酸鹽緩沖液清洗，制成超薄組織切片50 nm，鉛鈾染色，透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5心肌SOD活力和心肌MDA含量測定

取心室部分，用生理鹽水制備心臟勻漿，1500 r/min離心10min，硫代巴比妥酸顯色法測定心肌MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定心肌超氧化物歧化酶活力。

1.6血漿AngiotensinⅡ水平測定

取動(dòng)脈血4mL，注入抗凝管中，4℃3000 r/min離心，分離血漿，采用放射免疫法檢測血漿AngiotensinⅡ水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用X2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1心肌組織切片染色結(jié)果

正常對(duì)照組肌纖維完整，心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，間質(zhì)未見血管擴(kuò)張。模型組心肌纖維排列不規(guī)則，疏松，結(jié)構(gòu)紊亂，大范圍腫脹、斷裂，間質(zhì)血管明顯擴(kuò)張及大量炎癥細(xì)胞浸潤。參附注射液高劑量組肌纖維腫脹減輕，空隙略增寬，偶有炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.2心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

正常對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞肌絲排列整齊，肌節(jié)明暗帶清晰。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞肌絲排列疏松、紊亂，大部分肌絲呈斷裂溶解狀。高劑量組大鼠心肌細(xì)胞可見肌絲排列整齊，少數(shù)肌絲溶解，肌節(jié)明暗帶清晰。見圖2。

圖1　光鏡下大鼠心肌病理形態(tài)學(xué)變化（HE，2 0 0×）

圖2　電鏡下各組大鼠心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化（1 5 0 0 0×）

2.3參附注射液對(duì)大鼠LVM I含量的影響

與模型組比較，參附注射液各劑量組大鼠LVMI含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.4參附注射液對(duì)大鼠心肌SOD活性和MDA含量的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組心肌SOD活性明顯降低（P＜0.01），給予不同劑量參附注射液處理后，心肌SOD活性明顯高于模型組（P＜0.01）；模型組MDA含量明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01），參附注射液高、中、低劑量MDA含量明顯低于模型組（P＜0.01）。其中參附注射液高劑量組MDA含量降低最多。見表2。

表1　參附注射液對(duì)大鼠L VM I含量的影響（±s）

表1　參附注射液對(duì)大鼠L VM I含量的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；LVMI：左室重量指數(shù)；LVW：左室質(zhì)量

組別　　動(dòng)物數(shù)　體重（g）　LVW（mg）　LVMI（譯）正常對(duì)照組模型組卡托普利組參附注射液低劑量組參附注射液中劑量組參附注射液高劑量組15 15 15 15 15 15 268.32±12.34 220.35±11.86 245.26±10.21 232.33±13.23 242.02±11.01 249.44±10.02 420.52±48.65 513.69±52.34 470.27±45.68 501.28±55.25 483.36±45.62 471.25±50.24 1.57±0.22 2.33±0.12*1.91±0.14△2.16±0.13△2.00±0.11△1.89±0.15△

表2　參附注射液對(duì)大鼠心肌SOD活性和MDA含量的影響（±s）

表2　參附注射液對(duì)大鼠心肌SOD活性和MDA含量的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

組別　　動(dòng)物數(shù)　SOD（U/L）　MDA（nmol/mg）正常對(duì)照組模型組卡托普利組參附注射液低劑量組參附注射液中劑量組參附注射液高劑量組15 15 15 15 15 15 140.21±10.45 76.35±6.32*115.26±7.21△102.33±8.23△110.02±6.01△128.44±10.02△7.96±0.88 11.84±1.05*8.82±0.16△10.52±0.32△9.05±0.44△8.48±0.28△

2.5參附注射液對(duì)大鼠AngiotensinⅡ水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清AngiotensinⅡ水平顯著升高（P＜0.01）。參附注射液各劑量組和卡托普利組經(jīng)處理后，AngiotensinⅡ水平降低（P＜0.01）。其中參附注射液高劑量組大鼠的AngiotensinⅡ水平最低。見表3。

表3　參附注射液對(duì)大鼠血管緊張素Ⅱ水平的影響（n g/m L，±s）

表3　參附注射液對(duì)大鼠血管緊張素Ⅱ水平的影響（n g/m L，±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01

組別　　動(dòng)物數(shù)　　血管緊張素Ⅱ正常對(duì)照組模型組卡托普利組參附注射液低劑量組參附注射液中劑量組參附注射液高劑量組15 15 15 15 15 15 294.21±10.45 676.35±6.32*421.32±6.88△560.33±8.23△480.02±6.01△395.21±10.02△

3　討論

ADR主要適用于急性淋巴細(xì)胞白血病及粒細(xì)胞白血病，其毒性作用主要表現(xiàn)為心律失常、心肌肥大乃至心力衰竭。ADR所致心臟毒性機(jī)制頗為復(fù)雜，目前研究認(rèn)為，ADR進(jìn)入心肌細(xì)胞后產(chǎn)生過量氧自由基，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪過氧化造成細(xì)胞功能損傷[8-10]。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成能量代謝異常，從而導(dǎo)致心肌的收縮及舒張障礙進(jìn)而出現(xiàn)心力衰竭。心衰時(shí)AngiotensinⅡ含量增加，AngiotensinⅡ可作用于血管平滑肌，引起細(xì)胞的增生、肥大使血管壁增厚，促進(jìn)心衰過程的發(fā)展[11-12]。參附注射液主要治療陽虛所致的各種疾病，成分主要為人參皂苷和去甲烏頭堿，人參皂苷可改善心肌營養(yǎng)代謝，提高心肌收縮力。烏頭堿則能顯著提高心臟功能[13-14]。研究表明參附注射液具有顯著的抗氧化作用，可清除超氧自由基，抑制羥自由基對(duì)細(xì)胞膜的破壞[15-16]。

心臟LVMI是評(píng)價(jià)左心功能不全嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，本研究采用ADR造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠LVMI較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.01），同時(shí)心肌病理形態(tài)學(xué)改變明顯，提示成功建立ADR心衰模型。高劑量參附注射液（4 mL/kg）與卡托普利降低心衰大鼠LVMI的作用相當(dāng)（P＞0.05）?？ㄍ衅绽⒏阶⑸湟航o藥后的心衰大鼠LVMI較模型組顯著降低（P＜0.01），表明參附注射液與卡托普利均可保護(hù)心肌組織。SOD和MDA是脂肪過氧化的重要產(chǎn)物，SOD通過催化超氧陰離子歧化為H2O和O2，從而起到清除自由基的作用[17-19]。MDA是自由基代謝產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組血清MDA量和Ⅱ含量明顯升高，心肌SOD活性下降，參附注射液各劑量組SOD活性明顯高于模型組，MDA含量明顯低于模型組，表明參附注射液可能通過降低血漿中MDA含量、增強(qiáng)SOD活性而發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化作用起到心臟保護(hù)作用，減少心肌損傷。同時(shí)模型組Ⅱ水平明顯升高，與相關(guān)研究一致[20]。陽性對(duì)照組和參附各劑量組Ⅱ水平降低，與模型組相比有明顯差異。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明參附注射液可以改善ADR心衰大鼠的心功能，機(jī)制可能與其抗氧化、降低AngiotensinⅡ含量有關(guān)。而至于AngiotensinⅡ引起的分子機(jī)制變化，需要在下一步研究中進(jìn)一步探討。

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Effects of Shenfu Injection on oxdative stress and AngiotensinⅡof rats w ith heart failure induced by Adriam ycin

ZHANG Zhigang SUN Guodong CHANGWenhua CHEN Jianzhong▲
Department of Pharmacology,Liaocheng People's Hospital,Shandong Province,Liaocheng 252000,China

[Abstract]Objective To explore the effects of Shenfu Injection on oxdative stress and angiotensinⅡof rats with heart failure induced by Adriamycin.M ethods Totally 90 rats were randomly divided into five groups with 15 rats in each group:normal control group,model control group,Captopril group(as positive control),and Shenfu Injection low,medium,high dose group.The normal control group was only treated with saline by intraperitoneal injection throughout the course of the experiment,while the other four groups were given Adriamycin by intraperitoneal injection with the total dosage of 20mg/kg.For the Shenfu Injection low,medium,high dose group,1,2,4mL/kg Shenfu Injection were given after Adriamycin Injection seven days later.For the positive control group,180mg/(kg·d)Captoprilwas given.After the model was successfully established,relevant indexes were measured.The activities of plasma superoxide dismutase (SOD)and the contents ofmalondialdehyde(MDA)in myocardial tissuesweremeasured.The levels of angiotensinⅡin serum were detected.Pathological changes in cardiomyocyte were observed.With electron microscope,the cardiac ultrastructural changes in damaged myocardium were examined.Results Adriamycin significant decreased the activities of SOD.After treatmentwith Captopril and 4 mL/kg Shenfu Injection,the activities of superoxide dismutase increased to(125.26±7.21),(128.44±10.02)U/L.There were great significances as compared with those in model group,the differenceswere statistically significant(P＜0.01).Adriamycin also increased the contents of MDA and the levels of angiotensinⅡ.After treatmentwith Captopril and 4 mL/kg Shenfu Injection,the contents of MDA in myocardial tissues decreased to(8.82±0.16),(8.48±0.28)nmol/mg.The levelsof angiotensinⅡin serum decreased to(388.32± 6.88),(395.21±10.02)ng/L,compared with those inbook=22,ebook=25model group,the differenceswere statistically significant(P＜0.01).In addition,the changes ofmyocardial pathological and ultrastructural damages were improved.Conclusion Shenfu Injection significantly improves the cardiac function of ratswith adriamycin-induced heart failure through antioxidant and reducing the angiotensinⅡlevel.

[Key words]Shenfu Injection;Adriamycin;AngiotensinⅡ;Heart failture;Superoxide dismutase

通訊作者▲

[作者簡介]張志剛（1975.11-），男，碩士；研究方向：心血管藥理學(xué)。

[中圖分類號(hào)]R332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-7210（2016）01（a）-0021-04