基于X射線衍射指紋圖譜鑒別龍骨

崔曉慧， 陳 龍， 劉義梅， 黃必勝， 陳科力（湖北中醫(yī)藥大學(xué)，教育部中藥資源和中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430065）

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基于X射線衍射指紋圖譜鑒別龍骨

崔曉慧， 陳 龍， 劉義梅， 黃必勝， 陳科力*
（湖北中醫(yī)藥大學(xué)，教育部中藥資源和中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430065）

摘要：目的 建立X射線衍射指紋圖譜對龍骨進(jìn)行鑒別。方法 應(yīng)用粉末X射線衍射技術(shù)，對11批龍骨和3批煅龍骨樣品進(jìn)行分析，以優(yōu)質(zhì)龍骨樣品的X射線衍射平均圖譜為對照指紋圖譜，以共有特征峰為指紋峰，進(jìn)行相似度評價(jià)和聚類分析。結(jié)果 以樣品的相關(guān)系數(shù)為相似度評價(jià)指標(biāo)，龍骨正品的相似度大于0.83，而聚類分析結(jié)果亦可將正偽龍骨區(qū)分開，但這兩種方法不適用于關(guān)節(jié)處龍骨的鑒別。結(jié)論 該指紋圖譜可用于對龍骨的真?zhèn)舞b別，關(guān)節(jié)處除外。關(guān)鍵詞：龍骨；X射線衍射；指紋圖譜；相似度評價(jià)；聚類分析

KEY W 0RDS：Os Draconis；X-ray diffraction；fingerprint；simi1arity eva1uation；c1uster ana1ysis

龍骨（Os Draconis）為古代哺乳動(dòng)物，如三趾馬、犀類、鹿類、牛類、象類等骨骼的化石或象類門齒的化石［1］，其性味甘、澀、平，歸心、肝、腎、大腸經(jīng)［2］，生用可平肝潛陽、鎮(zhèn)驚安神，主治煩躁易怒、心悸失眠、頭暈?zāi)垦！d狂驚厥等癥；煅用可收斂固澀，主治遺精早泄、崩漏、虛汗、濕瘡癢疹、瘡口不斂及外傷出血等癥［3］，其主要成分為碳酸鈣、磷酸鈣，另含少量的鐵、鎂、鋁、鉀、鈉、氯、硫酸根等離子［4］。由于龍骨為動(dòng)物骨骼多年形成的化石，是寶貴的不可再生資源，故現(xiàn)存量逐年減少，正品價(jià)格不斷增高，偽劣產(chǎn)品較多，如用風(fēng)化的動(dòng)物骨骼外包滑石粉或石炭粉來冒充龍骨［5］，而且骨骼在漫長的年代轉(zhuǎn)化為化石期間，還有很多中間類型，因此龍骨是市場上偽劣藥材較多的中藥品種之一。對于龍骨這類化石類藥材的鑒別，主要是依靠經(jīng)驗(yàn)性的性狀分析，其主觀性較強(qiáng)，一旦其被粉碎成粉末后，就很難再用常規(guī)的方法加以鑒別。因此，為保證藥材的質(zhì)量，確保臨床療效，運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)建立龍骨可靠的客觀鑒定方法是很有必要的。

X射線衍射法是分析和研究結(jié)晶物質(zhì)的重要手段之一，由于礦物類中藥絕大多數(shù)由晶質(zhì)礦物組成，因此采用該方法進(jìn)行鑒定具有可行性［6-10］，文獻(xiàn)［11］對龍骨和龍齒建立了指紋圖譜以進(jìn)行初步分析，并對真?zhèn)纹愤M(jìn)行了鑒定。通過比較發(fā)現(xiàn)，兩者的X射線衍射指紋特征有比較明顯的區(qū)別，故應(yīng)當(dāng)分別建立更為精細(xì)的指紋圖譜。但是，該文獻(xiàn)中生龍骨的樣品太少（只有2份），而且其圖譜分析尚未對市場上多種龍骨樣品的形式進(jìn)行解讀。因此，本實(shí)驗(yàn)采用X射線衍射法，對11批不同來源的龍骨及煅龍骨樣品進(jìn)行分析，在建立正品龍骨X射線衍射指紋圖譜的基礎(chǔ)上，與各種龍骨樣品進(jìn)行比較，并作進(jìn)一步的分析研究。

1 材料與儀器

1.1 藥材 從不同藥材市場購得11批龍骨樣品，均由湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室陳科力教授依據(jù)其性狀，進(jìn)行了初步鑒別，詳細(xì)信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Inform ation of sam p les

1.2 儀器 X’PertPro型X射線粉晶衍射儀（荷蘭帕納科公司）；MID Jade6.5分析軟件；Origin8數(shù)據(jù)分析和繪圖軟件。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備 分別取11批龍骨樣品，干燥，粉碎，過200目篩，制成待測樣品。

煅制方法為將樣品S3、S4和S5的粉末置于坩堝內(nèi)，再放到650℃馬弗爐中，2 h后取出冷卻，標(biāo)記為樣品D3、D4和D5。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件及X射線衍射圖譜采集 入射光源為CuKα輻射；Ni片濾波；X光管工作電壓為40 kV；電流為40 mA；光闌系統(tǒng)為DS＝SS＝1°；IS＝0.3 mm。使用連續(xù)掃描方式，掃描速率為8°/min；2θ分辨率為0.02°；掃描范圍為3°～65°；采用超能探測器。

取少量樣品粉末，用玻璃板壓平于樣品板的凹槽中，按照儀器操作程序，采集各樣品粉末的X射線衍射原始圖譜，并導(dǎo)入MID Jade 6.5分析軟件中，對圖譜做11點(diǎn)平滑處理，得到各樣品的分析圖譜。

2.3 龍骨樣品的X射線衍射圖譜特征及分析

2.3.1 優(yōu)質(zhì)龍骨 應(yīng)用Origin 8軟件處理，繪制S1～S4共4批優(yōu)質(zhì)龍骨樣品的X射線衍射共有模式圖，見圖1，發(fā)現(xiàn)其幾何拓?fù)鋱D形規(guī)律一致。利用JADE 6.0數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)，對這些圖譜分別進(jìn)行尋峰、物相檢索，查閱由國際粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合會(huì)負(fù)責(zé)編輯出版的“粉末衍射卡片PDF卡片”，初步判斷這其X射線衍射數(shù)據(jù)與PDF74-0565 （hydroxy1apatite）及PDF72-1937（ca1cite）基本一致，說明這些優(yōu)質(zhì)龍骨樣品主要含Ca10（PO4）6（OH）2（羥基磷灰石）與CaCO3（方解石型碳酸鈣），這與文獻(xiàn)［11-12］報(bào)道相符。另外，樣品S3與其他樣品相比，在2θ＝26.639°處多一個(gè)譜峰，與PDF79-1906一致，是石英（SiO2）的特征峰，其相對峰面積為34%，表明該樣品中石英含有量較低。將這4批優(yōu)質(zhì)龍骨X射線衍射圖譜中的峰疊加后平均，得到平均數(shù)圖譜，作為龍骨的對照圖譜，見圖2。由圖可知，2θ＝26.639°處是石英（SiO2）的特征峰，而并非龍骨的特征峰，故將其去掉。

圖1 4批龍骨正品的X射線衍射指紋圖譜Fig.1 X-ray diffraction fingerprints of four batches of genuine Os Draconis

圖2 4批龍骨正品的平均數(shù)圖譜Fig.2 M ean spectrum of four batches of genuine Os Draconis

2.3.2 關(guān)節(jié)位置處龍骨圖譜 樣品S5、S6為關(guān)節(jié)處龍骨，初步鑒定為龍骨正品，其X射線衍射圖譜的幾何拓?fù)鋱D形規(guī)律一致，見圖3。物相檢索結(jié)果表明，這2批龍骨樣品主要含羥基磷灰石與少量石英，不含方解石，與優(yōu)質(zhì)龍骨在物相組成和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜上有較大差異，說明可能為龍骨偽品。但對已確證為龍骨的S3樣品關(guān)節(jié)部分S3-2的X射線衍射圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其物相組成也與S5、S6完全一致，也含少量石英，不含方解石，即兩者也可能為龍骨正品。故根據(jù)X射線衍射圖譜，對S5、S6的鑒定結(jié)果為“龍骨存疑”，所以該方法不適合關(guān)節(jié)處龍骨樣品的鑒別，還有待作深入的探討。

2.3.3 煅龍骨 3批煅龍骨的X射線衍射圖譜見圖4。比較龍骨和煅龍骨的物相組成，發(fā)現(xiàn)D3與S3一樣，主要為羥基磷灰石與方解石，還含很少量的石英；D4與S4一樣，主要含羥基磷灰石與方解石；D5與S5一樣，主要含羥基磷灰石和少量石英，表明龍骨煅燒前后物相組成無明顯變化。比較龍骨煅燒前后的峰形發(fā)現(xiàn)，煅燒前，羥基磷灰石的特征峰鈍而寬，彌散嚴(yán)重［13-14］，說明該物相純度及結(jié)晶度較低；煅燒后，各衍射峰強(qiáng)度增強(qiáng)，底部寬度變窄，峰形變尖銳，說明煅燒后樣品的晶化程度大大提高。

圖3 2批關(guān)節(jié)處龍骨的X射線衍射圖譜Fig.3 X-ray diffraction fingerprints of tWo batches of Os Draconis in joints

圖4 3批煅龍骨的X射線衍射圖譜Fig.4 X-ray diffraction fingerprints of three batches of calcined Os Draconis

2.3.4 龍骨劣質(zhì)品及摻偽品 樣品S7呈圓柱狀，石化明顯，表面有黏土，骨髓腔處被大量巖石填充，滴加稀鹽酸后迅速產(chǎn)生大量氣泡，故鑒定為骨髓腔填充巖石的龍骨，即劣質(zhì)龍骨，其X射線衍射圖譜（圖5）亦反映出該樣品的龍骨組分特征。另外，其2θ＝29.413°（晶面間距d＝3.034 2 ?）處有一基峰（相對峰高I/I0＝100%），為方解石特征，表明該樣品含大量方解石，主要來自髓部填充的巖石；2θ＝26.639°（d＝3.343 5 ?）處有一尖峰，為石英特征，可推測其來自樣品表面附著的黏土。樣品S8、S9均為經(jīng)過粉碎處理后的龍骨統(tǒng)貨，性狀特征不明顯，但仔細(xì)挑選后可見龍骨碎塊，亦有大量表面光滑、無石化特征的現(xiàn)代動(dòng)物骨頭碎片，以及形如龍骨碎片的黏土塊，而且后者亦發(fā)現(xiàn)一些表面包裹一層龍骨粉黏土塊摻偽物，故兩者也為龍骨偽品，其X射線衍射圖譜見圖5。通過物相檢索，發(fā)現(xiàn)這2批樣品均有羥基磷灰石和方解石，為龍骨正品的主要成分，同時(shí)均含有大量石英，其衍射強(qiáng)度大于主要成分。另外，樣品S9還含有其他雜質(zhì)礦物，如長石、石膏。

圖5 3批龍骨偽品的X射線衍射圖譜Fig.5 X-ray diffraction fingerprints of three batches of pseudo Os Draconis

2.3.5龍骨偽品的圖譜分析 龍骨樣品S10、S11無石化特征，故為偽品，其X射線衍射圖譜見圖6。通過物相檢索發(fā)現(xiàn)，樣品S10主要含羥基磷灰石和少量石英，不含碳酸鈣，由于羥基磷灰石的特征峰峰形尖銳，分裂明顯，與煅燒品類似，故推斷其為偽品；S11主要含羥基磷灰石，不含CaCO3，峰形彌散嚴(yán)重，樣品結(jié)晶性差。

2.4 龍骨XID圖譜指紋性分析

2.4.1 X射線衍射圖譜尋峰處理 利用JADE 6.0軟件，對4批優(yōu)質(zhì)龍骨的圖譜分別進(jìn)行尋峰處理，經(jīng)分析比較，選取強(qiáng)度較大的共有特征峰10個(gè)（圖2）作為龍骨特征指紋峰。然后，對其他樣品尋峰，得到各峰位值（2θ/°）和相對強(qiáng)度（I/I0），數(shù)據(jù)見表2。

表2 共有特征峰的峰位與相對強(qiáng)度Tab.2 Peak positions and relative intensities of common characteristic peaks

2.4.2 相似度計(jì)算 以圖2中4批龍骨正品的平均數(shù)圖譜為對照圖譜，采用相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法分別計(jì)算各批龍骨的相似度，結(jié)果見表3。由表可知，各類樣品的相似度由大到小依次為優(yōu)質(zhì)龍骨、優(yōu)質(zhì)煅龍骨、摻偽品、劣質(zhì)品、偽品及關(guān)節(jié)處龍骨，可明顯加以區(qū)分。

表3 各批龍骨的相似度Tab.3 Sim ilarities of various batches of Os Draconis

2.5 聚類分析方法驗(yàn)證 根據(jù)表3中各批龍骨樣品的10個(gè)共有峰數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖7。由圖可知，所有樣品被聚為兩類，樣品S1、S2、S3、S4、D3、D4、S7聚為一類，均為正品龍骨，包括骨髓腔中充填了巖石的S7，其中S1、S3，S2、S4，D3、D4當(dāng)距離標(biāo)尺為1時(shí)，緊密相聚；樣品D5、S5、S6、S8、S9、S10、S11聚為另一類，包括摻偽品S8、S9，偽品S10、S11，關(guān)節(jié)處樣品D5、S5、S6，其中S8、S9緊密聚類，其它聚為一類，說明關(guān)節(jié)處的龍骨樣品與偽品較難區(qū)分。以上結(jié)果與相似度分析基本一致，可用以明顯鑒別除關(guān)節(jié)處的各類龍骨樣品，也說明X射線衍射指紋圖譜可用于龍骨品質(zhì)評價(jià)及真?zhèn)舞b別。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對不同來源的11批龍骨樣品和3批煅龍骨樣品進(jìn)行性狀鑒定和X射線衍射分析，建立了以4批優(yōu)質(zhì)龍骨樣品平均圖譜的10個(gè)共有特征峰為對照的龍骨X射線衍射指紋圖譜，可準(zhǔn)確區(qū)分優(yōu)質(zhì)、劣質(zhì)、摻偽、偽品等不同品質(zhì)的龍骨及煅龍骨。

圖7 聚類分析圖Fig.7 Cluster analysis chart

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相關(guān)系數(shù)法計(jì)算得到的相似度比夾角余弦法的差異更顯著，故采用相關(guān)系數(shù)法考察該指紋圖譜。結(jié)果，樣品S1、S2、S3、S4、D3、D4的相關(guān)系數(shù)均在0.83以上，為優(yōu)質(zhì)龍骨，而且煅品均小于生品，兩者可明顯區(qū)分。在優(yōu)質(zhì)龍骨中，樣品S3的相關(guān)系數(shù)偏低，其表面有少量黏土，可能在制樣過程中摻入；摻偽品的相似度略低于煅品（＜0.81），但大于劣質(zhì)品S7（0.701 3），說明摻偽品的質(zhì)量比劣質(zhì)品好，這與其性狀特點(diǎn)相符。人為摻雜其他雜質(zhì)的摻偽品中依然以優(yōu)質(zhì)正品龍骨為主，但S7天然伴生雜質(zhì)的含有量卻大于藥用部位，致使其品質(zhì)較摻偽差。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)處龍骨及其煅品因與偽品在物相組成上都不含方解石，相似度均較低（＜0.55），所以不能通過相似度法區(qū)分開，這一結(jié)果也通過X射線衍射圖譜的聚類分析法得到了印證。由于在實(shí)際銷售和臨床使用中，并不存在將關(guān)節(jié)處龍骨單獨(dú)列出的情況，而是共同使用，故為避免其干擾，在應(yīng)用X射線衍射指紋圖譜鑒別龍骨時(shí)，應(yīng)避開關(guān)節(jié)處。

在聚類分析中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)距離標(biāo)尺為3時(shí)，劣質(zhì)品S7與優(yōu)質(zhì)龍骨聚為一類，結(jié)合其性狀特點(diǎn)及物相組成，可說明天然形成的劣質(zhì)品性狀及物相組成與優(yōu)質(zhì)品相似，僅各物相含有量存在差異，而摻偽品中帶入其他雜質(zhì)，對藥材品質(zhì)的影響更大。因此，對于S7之類的摻偽龍骨可敲碎，剔除伴生雜質(zhì)礦物后再使用。

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［綜 述］

Identification of Os Draconis based on X-ray diffraction fingerprint

CUIXiao-hui， CHEN Long， LIU Yi-mei， HUANG Bi-sheng， CHEN Ke-1i*

（Key Laboratory of TraditionalChineseMedicineResourceand Compound Prescription，Ministry of Education，HubeiUniversity of ChineseMedicine，Wuhan 43OO65，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an X-ray diffraction fingerprint for the identification of Os Draconis.METH-0 DS The powder X-ray diffraction techno1ogy was used for ana1yzing e1even batches of Os Draconis and three batches of ca1cined Os Draconis.The simi1arity eva1uation and c1uster ana1ysisweremade with the average X-ray diffraction patterns of high qua1ity Os Draconis as reference fingerprint and common characteristic peaks as fingerprint peaks.RESULTS With the corre1ation coefficients of samp1es as eva1uation index，the simi1arity of genuine Os Draconis wasmore than 0.83，whi1e c1uster ana1ysis cou1d a1so distinguish genuine from pseudo Os Draconis.But these twomethods were not suitab1e for the identification of Os Draconis in joints.C0NCLUSI0N This fingerprint can be used for the identification of Os Draconis except joints.

*通信作者：陳科力（1947—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及其品質(zhì)。E-mai1：ke1ichen@126.com

作者簡介：崔曉慧（1979—），女，博士生，講師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及其品質(zhì)。Te1：18971089410，E-mai1：53879185@qq.com

基金項(xiàng)目：武漢市2012年高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展行動(dòng)計(jì)劃生物技術(shù)與新醫(yī)藥專項(xiàng)（201260523193）

收稿日期：2015-07-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.031

中圖分類號(hào)：I282.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）03-0624-06