栝樓薤白半夏湯對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌自噬及凋亡的影響*

唐丹麗，劉寨華，崔海峰，周艷華，隋 宇，張華敏

(1．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700;2．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;3．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700)

栝樓薤白半夏湯對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌自噬及凋亡的影響*

唐丹麗1，劉寨華2，崔海峰1，周艷華1，隋 宇1，張華敏3△

(1．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700;2．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;3．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700)

目的:觀察栝樓薤白半夏湯對(duì)心肌缺血再灌注損傷(MI/RI)大鼠心肌自噬及凋亡的影響。方法:將40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、3-MA干預(yù)組及栝樓薤白半夏湯組，采用可逆性冠脈左前降支結(jié)扎缺血30 min、再灌注2 h復(fù)制MI/RI模型。利用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量，采用Western blot法測(cè)定心肌自噬基因Beclin-1、LC3II及促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平。結(jié)果:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CK、LDH含量與心肌Beclin-1、LC3 II、Bax蛋白表達(dá)及LC3 II/LC3I水平均顯著升高，與模型組比較，栝樓薤白半夏湯組及3-MA干預(yù)組能降低血清CK、LDH含量，下調(diào)心肌Beclin-1、LC3 II、Bax蛋白表達(dá)及LC3 II/LC3I水平，且栝樓薤白半夏湯抑制Beclin-1表達(dá)作用優(yōu)于3-MA干預(yù)組。結(jié)論:心肌缺血再灌注可引起自噬反應(yīng)增強(qiáng)，促進(jìn)凋亡損傷，栝樓薤白半夏湯通過(guò)抑制自噬、改善心肌細(xì)胞凋亡而起到心肌保護(hù)作用。

心肌缺血再灌注損傷;自噬;凋亡;栝樓薤白半夏湯

自噬(autophagy)是廣泛存在于真核細(xì)胞生物中的一種細(xì)胞自我吞噬現(xiàn)象，在正常生理狀態(tài)下，自噬能夠清除衰老的細(xì)胞器及降解異常積聚的蛋白質(zhì)，從而保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定;當(dāng)缺氧或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏時(shí)，自噬可通過(guò)降解胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生氨基酸和脂肪酸為機(jī)體提供能量，并促進(jìn)機(jī)體蛋白和細(xì)胞器的合成。諸多證據(jù)顯示［1-2］，自噬參與心肌缺血再灌注損傷(MI/RI)過(guò)程，并在MI/RI病理進(jìn)程中扮演重要角色。

中醫(yī)藥對(duì)MI/RI保護(hù)作用的研究是近年來(lái)中西醫(yī)結(jié)合研究的切入點(diǎn)之一，如何在治療該病的有效治法方藥中系統(tǒng)地進(jìn)行篩選并研究其作用機(jī)制，對(duì)發(fā)掘傳統(tǒng)中藥方劑的臨床實(shí)用價(jià)值、闡明中藥科學(xué)內(nèi)涵有積極的推動(dòng)作用。栝樓薤白半夏湯出自東漢醫(yī)家張仲景所著《金匱要略》，是治療胸痹的名方，具備通陽(yáng)散結(jié)、祛痰寬胸之功效，是臨床常用于治療心血管疾病的有效方劑。課題組前期研究顯示［3］，該方具有抑制再灌注后 NF-кB信號(hào)通路活化、減輕炎癥損傷的作用。本研究旨在明確其對(duì)MI/RI過(guò)程中心肌自噬及凋亡的影響，以期進(jìn)一步闡明該方對(duì)再灌注損傷心肌的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(250±20)g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK-(軍)2012-0004)。

1.2 藥物

栝樓薤白半夏湯組成:栝樓24 g，薤白9 g，半夏12 g，白酒24 L［4］，所有藥材由北京同仁堂(亳州)飲片有限責(zé)任公司提供。藥物劑量換算依70 kg成人每日1劑原方用量，換算出大鼠每日用量，濃縮成含生藥1.3 g/ml的水煎液。

1.3 主要試劑與儀器

CK、LDH試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司;自噬抑制劑、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)Sigma公司產(chǎn)品;Bax抗體，Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司產(chǎn)品。動(dòng)物呼吸機(jī)ALC-V8，上海奧爾科特公司;多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，成都儀器廠;全自動(dòng)生化分析儀，日本HITACHI公司;Power Pac Basic電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司;MK3酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制

大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，腹腔注射20%烏拉坦(0.5 m1/100 g)，麻醉后仰臥位固定四肢及頭部，記錄Ⅱ?qū)碾妶D。頸部、胸前手術(shù)野備皮，切開(kāi)氣管連接動(dòng)物呼吸機(jī)(呼吸頻率70次/min，吸呼比1∶2，潮氣量9 ml/kg)。自左側(cè)第3～4肋間剪開(kāi)皮膚，鈍性分離肌肉組織，打開(kāi)胸腔剪開(kāi)心包膜，于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間找出冠狀動(dòng)脈左前降支，并以5-0號(hào)絲線結(jié)扎分支起點(diǎn)外約1～2 mm(在絲線與心肌間放一根聚乙烯小管)，此時(shí)缺血心肌壁呈現(xiàn)發(fā)紺、膨出，同時(shí)記錄心電圖，以標(biāo)準(zhǔn)肢導(dǎo)聯(lián)Ⅱ?qū)?lián)ST段弓背上抬，T波高聳，顯示心肌缺血形成。再灌注模型結(jié)扎30 min后松開(kāi)，使缺血冠脈再灌注，關(guān)閉胸腔再灌注120 min，心電圖示ST段回落1/2以上，提示造模成功。結(jié)扎前心電圖不正?；蛭吹接^察終點(diǎn)而死亡以及造模不成功者剔除。假手術(shù)組在開(kāi)胸后不結(jié)扎冠脈，而僅在相應(yīng)部位用針空穿1次即可。3-MA干預(yù)組于再灌注前10 min尾靜脈注射給藥(20 mg/kg)。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

按隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、3-MA干預(yù)組及栝樓薤白半夏方組。各組動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)，條件相同。栝樓薤白半夏方組灌服中藥煎液1 ml/(100 g·d)，其余各組大鼠每日灌服生理鹽水1 ml/(100 g·d)，造模前連續(xù)給藥3周。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組均有死亡，每組隨機(jī)取8只備檢，最終32只大鼠納入統(tǒng)計(jì)。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 標(biāo)本采集 大鼠再灌注2 h后腹主動(dòng)脈取血，之后迅速剪取心臟，預(yù)冷生理鹽水沖洗，冰盤(pán)上切取部分左冠狀動(dòng)脈供血區(qū)的心肌組織，稱(chēng)重后即于液氮中迅速冰凍，置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 血清心肌酶學(xué)檢測(cè) 取血后離心3000 r/15 min分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行心肌酶指標(biāo)檢測(cè)。

2.3.3 Western blot法檢測(cè)心肌 Beclin-1、LC3II及Bax蛋白水平 取大鼠心肌組織經(jīng)勻漿離心后，取上清液用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取各組樣品30 μg進(jìn)行15%SDS-PAGE并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉1 h。以1∶1000用5%BSA-TBST稀釋一抗，4℃孵育過(guò)夜。然后按1∶10000比例稀釋HRP二抗，室溫下孵育40 min。ECL反應(yīng)3～5 min，膠片曝光10 s～5 min顯影、定影、洗片。膠片掃描后進(jìn)行圖像分析，以β-actin作為內(nèi)參照對(duì)比，比值結(jié)果表示其蛋白的相對(duì)含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 栝樓薤白半夏湯對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠血清CK、LDH-L表達(dá)的影響

表1顯示，與假手術(shù)組比較，MI/RI模型組大鼠血清CK、LDH-L含量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01);與模型組比較，3-MA干預(yù)組及栝樓薤白半夏方組能降低血清CK及LDH-L水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)，2組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。

3.2 栝樓薤白半夏湯對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌Beclin-1、LC3II及促凋亡蛋白Bax表達(dá)的影響

表1、2及圖1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組Beclin-1蛋白表達(dá)及LC3II/LC3I比值升高，同時(shí)促凋亡蛋白Bax表達(dá)也顯著上升(均為P＜0.01);與模型組比較，3-MA干預(yù)組及栝樓薤白半夏方組能顯著下調(diào)Beclin-1、LC3II、Bax蛋白表達(dá)及LC3II/LC3I比值(P＜0.01或P＜0.05)，且栝樓薤白半夏方組Beclin-1蛋白水平明顯低于 3-MA干預(yù)組(P＜0.05)。再灌注后，各組間LC3I蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

將模型組Beclin-1、LC3II蛋白表達(dá)與Bax表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者均具有正相關(guān)關(guān)系(r=0.666，0.575，P＜0.01)。提示隨著再灌注后自噬高表達(dá)的同時(shí)，促凋亡蛋白Bax水平也相應(yīng)顯著升高。

表1 各組大鼠血清心肌酶CK、LDH及心肌Beclin-1、Bax蛋白表達(dá)情況(±s)

表1 各組大鼠血清心肌酶CK、LDH及心肌Beclin-1、Bax蛋白表達(dá)情況(±s)

注:與假手術(shù)組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與3-MA組比較:■P＜0.05，■■P＜0.01

組別 鼠數(shù) CK/U·L LDH/IU·L Beclin-1 Bax假 手 術(shù) 組 8 1661.75±534.23 1235.35±602.73 0.15±0.03 0.21±0.03模 型 組 8 3136.75±875.09ΔΔ 2723.31±823.58ΔΔD 0.32±0.09ΔΔ 0.56±0.06ΔΔ3-MA 干 預(yù) 組 8 2340.88±766.21* 1747.00±725.11＊＊ 0.24±0.05* 0.33±0.09＊＊栝樓薤白半夏方組 8 2454.75±354.79* 2000.51±612.74* 0.15±0.05＊＊■ 0.30±0.04＊＊

表2 各組大鼠心LC3I、LC3II蛋白表達(dá)及LC3II/LC3I比值情況(±s)

表2 各組大鼠心LC3I、LC3II蛋白表達(dá)及LC3II/LC3I比值情況(±s)

注:與假手術(shù)組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 鼠數(shù)LC3I LC3II LC3II/LC3I假 手 術(shù) 組8 0.53±0.01 0.07±0.05 0.13±0.10模 型 組 8 0.39±0.11Δ 0.24±0.08ΔΔ 0.60±0.05ΔΔ3-MA 干 預(yù) 組 8 0.45±0.12 0.13±0.11* 0.28±0.18＊＊栝樓薤白半夏方組 8 0.42±0.04* 0.11±0.06* 0.27±0.11＊＊

圖1 各組大鼠心肌Beclin-1、LC3II、Bax蛋白表達(dá)

4 討論

心肌壞死是心肌缺血再灌注損傷可能導(dǎo)致的最嚴(yán)重結(jié)果，心肌缺血壞死或細(xì)胞膜通透性增加，可使心肌內(nèi)的細(xì)胞酶釋放入血，因而血清心肌酶可以反映心肌梗死的發(fā)生以及病灶的大小，是判斷心肌壞死程度的重要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)中采用CK、LDH的釋放為觀測(cè)指標(biāo)，觀察到再灌注后大鼠血清CK、LDH含量顯著增加，表明缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞受損嚴(yán)重，而栝樓薤白半夏湯對(duì)MI/RI心肌具有一定的保護(hù)作用，減輕了心肌細(xì)胞膜的損傷，降低了心肌酶的釋放，從而改善能量代謝障礙，保護(hù)心肌細(xì)胞。

自噬在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)、對(duì)抗外界環(huán)境變化、應(yīng)激和炎癥反應(yīng)方面起著重要作用，當(dāng)自噬出現(xiàn)過(guò)表達(dá)或應(yīng)激和炎性反應(yīng)強(qiáng)烈，自噬的保護(hù)作用就會(huì)轉(zhuǎn)化成自噬性細(xì)胞死亡或凋亡［5］。心肌缺血本質(zhì)上也是血流供應(yīng)不足導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，因此自噬可以被缺血誘導(dǎo)，而且再灌注過(guò)程會(huì)促進(jìn)自噬體的形成。在心臟再灌注階段，氧化應(yīng)激、線粒體損傷及炎癥反應(yīng)等可使自噬過(guò)度激活，從而過(guò)度降解重要蛋白和細(xì)胞器會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞不可逆死亡［6］。Beclin-1是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬過(guò)程的關(guān)鍵基因，Beclin-1的表達(dá)水平一定程度上反映了自噬的活性。LC3是自噬標(biāo)志性蛋白，分為2個(gè)亞型，在細(xì)胞自噬形成過(guò)程中，LC3Ⅰ被剪形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ在細(xì)胞自噬泡形成過(guò)程中起到重要作用［7］。因此，在應(yīng)激情況下LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ的比值可以反映自噬被激活的程度。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，再灌注后大鼠心肌Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白水平以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高，說(shuō)明此時(shí)心肌自噬被激活且維持過(guò)表達(dá)水平，栝樓薤白半夏湯具有與自噬抑制劑3-MA作用相當(dāng)?shù)囊种谱允尚?yīng)。

MI/RI過(guò)程中，細(xì)胞凋亡是MI/RI重要的病理環(huán)節(jié)之一，是心肌缺血及再灌注細(xì)胞死亡的一種主要形式［8］。凋亡亦與自噬之間存在密切的內(nèi)在聯(lián)系，有研究［9］利用創(chuàng)傷后遲發(fā)性心臟損傷模型發(fā)現(xiàn)，自噬和凋亡既相互獨(dú)立又存在相互作用，低水平的自噬具有保護(hù)作用，可以抑制凋亡;當(dāng)自噬調(diào)節(jié)不當(dāng)或過(guò)度時(shí)，可以誘發(fā)凋亡或壞死，且相關(guān)性分析顯示，自噬與凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。以往研究證明［10］，在Bcl-2/bcl-XL低表達(dá)、Bax過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，抗凋亡能力受到抑制，可通過(guò)Caspase-3依賴(lài)的Beclin-1裂解以降低自噬水平;而在抗凋亡Bcl-2的蛋白高表達(dá)的細(xì)胞中，Bax中止 Bcl-2/bcl-xl和Beclin-1的相互作用以加強(qiáng)自噬，從而進(jìn)一步解釋了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

自噬在缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用，自噬的變化直接關(guān)聯(lián)著心肌細(xì)胞的存亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，MI/RI后心肌血清心肌酶水平升高，自噬表達(dá)迅速上調(diào)，心肌凋亡嚴(yán)重，栝樓薤白半夏湯可以通過(guò)抑制自噬過(guò)表達(dá)，減輕凋亡反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

［1］Zeng M，Wei X，Wu Z，et al．NF-κB-mediated induction of autophagy in cardiac ischemia/reperfusion injury［J］．Biochem Biophys Res Commun，2013，436(2):180-185．

［2］Matsui Y，Takagi H，Qu X，et al．Distinct roles of autophagy inthe heart during ischemia and reperfusion:roles of AMP-activated protein kinase and Beclin 1 in mediating autophagy［J］．Circ Res，2007，100(6):914-922．

［3］Zhang Hua-min，Tang Dan-li，Tong Lin，et al．Gualou Xiebai Banxia decoction inhibits NF-kappa B-dependent inflammation in myocardial ischemic-reperfusion injury of rats［J］．Journal of Traditional Chinese Medicine，2011，31(4):338-343．

［4］苗明三，王升啟．現(xiàn)代方劑學(xué)［M］．北京:清華大學(xué)出版社，2004:1621．

［5］朱慧忠，呂定超，劉慧榮，等．自噬與自噬相關(guān)炎性因子在心肌損傷早期診斷中的意義［J］．中華臨床醫(yī)師雜志:電子版，2014，8(4):716-720．

［6］曾敏，顏紅兵．自噬與心肌缺血再灌注［J］．中華心血管病雜志，2012，40(8):711-713．

［7］劉琴，李凌云，喬世剛，等．七氟烷預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞H9c2 LC3蛋白表達(dá)的影響［J］．蘇州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，31(1):39-42．

［8］Gottlieb RA，Engler RL．Apoptosis in myocardial ischemiareperfusion［J］．Ann N Y Acad Sci，1999，30，874:412-426．

［9］Wang J，Lu K，Liang F，et al．Decreased autophagy contributes to myocardialdysfunction in rats subjected to nonlethal mechanical trauma［J］．Plos one，2013，8(8):10-17．

［10］Luo S，Rubinsztein DC．Apoptosis blocks Beclin 1 dependent autophagosome synthesis:an effect rescued by Bcl-Xl［J］．Cell Death Differ，2010，17(2):268-277．

Effects of Gualou Xiebai Banxia Decoction on the Myocardial Autophagy and Apoptosis in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

TANG Dan-li1，LIU Zhai-hua2，CUI Hai-feng1，ZHOU Yan-hua1，SUI Yu1，ZHANG Hua-min3△
(1．Experimental Research Center of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China; 2．Institute of Basic Theory for Chinese Medicine of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China; 3．Institute of Information on Chinese Medicine of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China)

Objective:To study the effects of Gualou Xiebai Banxia decoction(GXBD)on autophagy and antiapoptosis of myocardial ischemia-reperfusion injury(MI/RI)in rats．Methods:40 SD rats were randomly divided into sham-operated group，model group，3-MA and GXBD groups．The model of ischemia reperfusion of the myocardium was reproduced by ligation of left descending artery for 30 min and followed by releasing the ligation for 2 hours in rats．Serum contents of CK，LDH were measured by automatic biochemical analyzer，the protein expression of Beclin-1、LC3II，Bax and the level of LC3 II/LC3I were determined by Western blot．Results:Compared with the sham-operated group，the contents of CK、LDH and the protein expression of Beclin-1，LC3 II，Bax and the level of LC3 II/LC3I were both significantly increased in MI/RI model groups;Compared with the model group，the 3-MA and GXBD groups down-regulated the expression of Beclin-1，LC3II，Bax and LC3 II/LC3I．The level of Beclin-1 in GXBD group were decreased than that in 3-MA group(P!0.05)．Conclusion:Autophagy and apoptosis were induced and activated by MI/RI，GXBD may protect cardiomyocytes of MI/RI rats by inhibiting autophagy and reducing apoptosis．

Myocardial ischemia-reperfusion injury;Autophagy;Apoptosis;Gualou Xiebai Banxia decoction (GXBD)

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0177-04

2015-06-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202630)-痰瘀同治法對(duì)心肌缺血再灌注損傷中核轉(zhuǎn)錄因子-κB與自噬交互作用的調(diào)控機(jī)制研究;國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373792)-痰瘀同治法對(duì)MI/RI中IKK/NF-κB-PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)與自噬間交互作用的調(diào)控機(jī)制研究;中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院自主選題項(xiàng)目(ZZ2014002)-栝樓薤白半夏湯對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用中自噬及凋亡調(diào)控效應(yīng)的影響

唐丹麗(1979-)，女，山東人，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥防治心血管疾病的臨床與研究。

△通訊作者:張華敏，女，研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥防治心血管疾病的臨床與研究，E-mail:zhanghm@mail．cintcm．a(chǎn)c．cn。