幽門螺桿菌陽性患者胃黏膜組織中NOD1受體的表達(dá)變化

唐寅思，曹蓉，翁洋，李春麗，溫艷惠，周一軍

（1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽110032；2遼寧省腫瘤醫(yī)院）

幽門螺桿菌陽性患者胃黏膜組織中NOD1受體的表達(dá)變化

唐寅思1，曹蓉2，翁洋1，李春麗1，溫艷惠1，周一軍1

（1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽110032；2遼寧省腫瘤醫(yī)院）

目的 觀察幽門螺桿菌陽性患者胃黏膜組織中NOD1受體的表達(dá)變化。方法 選擇病理組織標(biāo)本120例，其中Hp陽性90例（胃癌組30例、癌前病變組30例、胃炎組30例）、Hp陰性30例（胃炎，對照組），采用免疫組化法檢測各組NOD1受體表達(dá)，采用RT-PCR法檢測各組NOD1受體mRNA表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，其他三組NOD1陽性表達(dá)率、NOD1 mRNA相對表達(dá)量均升高（P均＜0.05）；且胃癌組NOD1陽性表達(dá)率、NOD1 mRNA相對表達(dá)量最高，與其他兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論 幽門螺桿菌陽性患者胃黏膜組織中NOD1受體高表達(dá)，且組織病理類型惡性程度越高，NOD1受體表達(dá)水平越高。

幽門螺桿菌；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體；胃腫瘤；胃炎；癌前病變

幽門螺桿菌（Hp）感染已經(jīng)被證明與多種消化系統(tǒng)疾病相關(guān)，如消化道潰瘍、胃炎、胃惡性腫瘤、炎癥性腸病、食道炎、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、功能性消化不良等，然而其致病機(jī)制還未完全闡明，目前得到公認(rèn)的學(xué)說有四種，其中免疫學(xué)說越來越受到重視［1］。模式識(shí)別受體（PRRs）是通過與病原相關(guān)分子模式相結(jié)合的方式來識(shí)別外源性病原微生物，并將其清除，從而介導(dǎo)天然免疫［2］。近年來關(guān)于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣（NOD）受體的研究在國內(nèi)外均有相關(guān)報(bào)道。NOD1受體廣泛表達(dá)于成人的組織細(xì)胞中，它可以識(shí)別細(xì)菌的成分（肽聚糖），活化核因子κB（NF-κB），參與固有免疫并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和細(xì)胞凋亡［3］。NOD1受體是否在Hp感染的過程中發(fā)揮作用，目前尚不清楚。2014年3月～2015年5月本研究觀察Hp感染患者胃黏膜組織中NOD1受體的表達(dá)情況，探討NOD1介導(dǎo)的信號(hào)通路在Hp感染中的作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料 病理組織標(biāo)本均來源于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院內(nèi)鏡中心及病理科，共120例，患者男56例、女64例，年齡30～84歲、平均52歲。經(jīng)快速尿素酶試驗(yàn)及病理檢查證實(shí)Hp陽性90例，根據(jù)病理檢查結(jié)果分為胃癌組30例、癌前病變組30例、胃炎組30例；Hp陰性30例作為對照組，病理檢查結(jié)果為胃炎。各組患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性疾病及其他惡性腫瘤（不包括胃癌）患者；妊娠期婦女；甲狀腺功能亢進(jìn)或減退者；飲酒者；應(yīng)用降脂藥、口服避孕藥及激素者；4周內(nèi)使用影響Hp的藥物，如抗生素、質(zhì)子泵抑制劑、氫受體拮抗劑、非甾體抗炎藥、鉍劑等。

1.2各組NOD1受體表達(dá)檢測 采用免疫組織化學(xué)染色法。病理組織用甲醛固定，石蠟包埋，步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淺黃色、棕黃色、棕褐色染色提示陽性。采用半定量積分法判斷結(jié)果［4］：每例切片觀察5個(gè)高倍鏡視野，每視野觀察100個(gè)細(xì)胞，觀察陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比和染色程度。陽性細(xì)胞百分比＜30%計(jì)0分，30%～60%計(jì)1分，61%～90%計(jì)2分，＞90%計(jì)3分；染色程度：未染色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；以上兩項(xiàng)乘積≥1為NOD1受體陽性表達(dá)。

1.3各組NOD1受體mRNA表達(dá)檢測 采用RTPCR法。用TRIzol提取總RNA，應(yīng)用Oligo（dT）引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用RNA酶處理產(chǎn)物。設(shè)計(jì)特異性引物用于擴(kuò)增NOD1。其正向引物：5′-AAGCATTTCTGCTACCCGGAG-3′，反向引物：5′-AAGCATTTCTGCTACCCGGAG-3′；GAPDH內(nèi)參正向引物：5′-ACCTCAGTCAATGGCATCGC-3′，反向引物：5′-TACACCACTCTGGTGCCGTG-3′。通過Light Cycler軟件直接獲得各樣本中NOD1受體mRNA的Ct值，與同樣本中內(nèi)參的Ct值相減，即獲得該樣本中NOD1受體mRNA的ΔCt值，根據(jù)2-ΔΔCt公式計(jì)算目的基因相對表達(dá)量

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組NOD1陽性表達(dá)率比較 胃癌組、癌前病變組、胃炎組、對照組NOD1陽性表達(dá)率分別為90%（27／30）、67%（20／30）、53%（16／30）、17%（5／30）；與對照組比較，其他三組NOD1陽性表達(dá)率均升高（P均＜0.05）；胃癌組、癌前病變組、胃炎組NOD1陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.2各組NOD1 mRNA表達(dá)比較 胃癌組、癌前病變組、胃炎組、對照組NOD1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.64±0.26、0.54±0.27、0.47±0.26、0.28± 0.17；與對照組比較，其他三組NOD1 mRNA相對表達(dá)量均升高（P均＜0.05）；胃癌組、癌前病變組、胃炎組NOD1 mRNA相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

3　討論

固有免疫反應(yīng)是機(jī)體抵御外來病原生物入侵的第一道防線。與固有免疫相關(guān)的PRRs中，Toll樣受體家族主要識(shí)別細(xì)菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物，而NLRs主要介導(dǎo)抗細(xì)菌感染。目前已鑒定出多種不同的炎癥復(fù)合體，包括NOD。NOD樣受體是一類在遺傳上高度保守的蛋白質(zhì)家族，廣泛存在于植物、線蟲、脊椎動(dòng)物和人類細(xì)胞內(nèi)，是一種細(xì)胞內(nèi)識(shí)別受體［5］。NOD樣受體家族中包括5個(gè)成員，其中最具代表性的是NOD1和NOD2（分別稱為CARD4和CARD15）。NOD1和NOD2可識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁中的脂多糖和肽聚糖，并依靠其CARD募集受體相互作用蛋白激酶（RIP）家族成員中的受體相互作用蛋白2（RIP2），從而使絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）［6］和NF-κB活化［7］?；罨腘F-κB可結(jié)合許多蛋白質(zhì)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子部位的κB序列，從而誘導(dǎo)細(xì)胞因子、生長因子、急性期蛋白、趨化因子、免疫受體和轉(zhuǎn)錄因子等多種物質(zhì)的表達(dá)。相關(guān)研究已經(jīng)表明，NOD1受體與感染、慢性炎癥性疾病、腫瘤（包括白血?。⒋x紊亂及自身免疫性疾病相關(guān)［8］。

目前關(guān)于Hp感染導(dǎo)致消化系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制有幾種學(xué)說［1］，即漏頂學(xué)說、促胃液素聯(lián)系學(xué)說、基因?qū)W說和免疫學(xué)說；其中對免疫學(xué)說的研究近年來比較廣泛，該觀點(diǎn)認(rèn)為作為一種長期定植于人體胃黏膜表面的細(xì)菌。Hp可通過多種細(xì)菌的黏附、毒力因子對黏膜細(xì)胞的直接損傷以及機(jī)體對細(xì)菌的免疫反應(yīng)而導(dǎo)致的免疫和（或）炎癥組織損傷等機(jī)制而引起消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生。Hp感染后，宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)在胃黏膜炎癥和損害方面也起著一定的作用。局部的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，激活T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體反應(yīng)，使中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放IL-2、IL-6以及激活氧自由基和一氧化氮的釋放，導(dǎo)致炎癥和細(xì)胞損傷?，F(xiàn)已有研究證實(shí)，NOD1參與介導(dǎo)Hp感染性胃病，從不同層面證實(shí)了兩者具有相關(guān)性。其中Wang等［9］研究認(rèn)為，在中國漢族人群中，NOD1基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病相關(guān)。Kim等［10］研究認(rèn)為，NOD1（796G＞A）單核苷酸改變與韓國地區(qū)Hp相關(guān)性胃病發(fā)病有相關(guān)性；Oikawa等［11］研究認(rèn)為，日本人中NOD1基因多態(tài)性與糜爛性食管炎發(fā)病有相關(guān)性?；诩?xì)胞水平的研究證明，NOD1信號(hào)通路在Hp感染中得以激活，從而介導(dǎo)了其相關(guān)疾病的發(fā)病及進(jìn)展［12］；除此之外，以動(dòng)物（小鼠）為研究對象的一些國內(nèi)外報(bào)道也證實(shí)了上述觀點(diǎn)，通過Hp感染小鼠模型，驗(yàn)證NOD1與Hp感染相關(guān)胃病的發(fā)病具有相關(guān)性［13］；且已有許多下游的細(xì)胞因子（如IL-18、IL-33等）被證實(shí)通過調(diào)控NOD1信號(hào)通路影響其表達(dá)水平。但通過人組織病理為實(shí)驗(yàn)材料的相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究相對較少。

本研究在RT-PCR和免疫組化兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中均得到相同提示：對照組與胃炎組中mRNA表達(dá)及NOD1受體的表達(dá)均存在差異，且其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明NOD1受體可能參與介導(dǎo)了Hp感染相關(guān)疾病。胃癌組、癌前病變組、胃炎組之間NOD1 mRNA表達(dá)及NOD1受體的表達(dá)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明組織病理惡性程度不同，NOD1受體表達(dá)情況也不相同。提示Hp感染后的胃炎、癌前病變及胃癌的胃黏膜組織中，在不同病理階段其表達(dá)程度存在差異，即NOD1受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路對胃黏膜造成損傷在不同病理階段產(chǎn)生不同程度的作用。

本研究結(jié)果說明，NOD1受體的表達(dá)與Hp感染情況相關(guān)，即NOD1信號(hào)通路在Hp感染中得以激活。NOD1受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和表達(dá)在Hp相關(guān)胃病中的研究有助于完善對Hp感染發(fā)病機(jī)制的探索，可能為Hp感染相關(guān)胃病的治療提供新的靶點(diǎn)，有希望為疫苗研制提供可行性思路；NOD1受體陽性表達(dá)對胃癌癌前病變黏膜組織的動(dòng)態(tài)監(jiān)測可能成為胃癌診治的新方向。未來隨著更多的PRRs的發(fā)現(xiàn)及其識(shí)別機(jī)制的闡明，將促進(jìn)更多的新型藥物問世，從而為人類戰(zhàn)勝更多疾病提供強(qiáng)有力武器。

［1］胡立民.幽門螺桿菌的致病機(jī)制［J］.臨床軍醫(yī)雜志，2004，32（6）：117-118.

［2］Kvarnhammar AM，Cardell LO.Pattern-recognition receptors in human eosinophils［J］.Immunology，2012，136（1）：11-20.

［3］茍芳，徐勇.NOD1受體、NOD2受體與糖尿病的關(guān)系研究進(jìn)展［J］.山東醫(yī)藥，2014（11）：90-92.

［4］Sasaki H，Nio M，Iwami D，et al.E-cadherin，a-catenin and bcatenin in biliary atresia：Correlation with apoptosis and cell cycle［J］.Pathology International，2001，51（12）：923-932.

［5］閆鴻斌，高閃電，賈萬忠，等.細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體研究進(jìn)展［J］.免疫學(xué)雜志，2008，24（3）：359-362.

［6］Zhao L，Hu P，Zhou Y，et al.NOD1 activation induces proinflammatory gene expression and insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2011，301（4）：587-598.

［7］Abbott DW，Wilkins A，Asara JM，et al.The Crohn′s disease protein，NOD2，requires RIP2 in order to induce ubiquitinylation of a novel site on NEMO［J］.Curr Biol，2004，14（24）：2217-2227.

［8］Davis BK，Wen H，Ting JP.The inflammasome NLRs in immunity，inflammation and associated diseases［J］.Annu Rev Immunol， 2011（29）：707-735.

［9］Wang P，Zhang L，Jiang JM，et al.Association of NOD1 and NOD2 genes polymorphisms with Helicobacter pylori related gastric cancer in a Chinese population［J］.World J Gastroenterol，2012，18（17）：2112-2120.

［10］Kim EJ，Lee JR，Chung WC，et al.Association between genetic polymorphisms of NOD1 and helicobacter pylori-induced gastric mucosal inflammation in healthy korean population［J］.Helicobacter，2013，18（2）：143-150.

［11］Oikawa T，Asano N，Imatani A，et al.Gene polymorphisms of NOD1 and interleukin-8 influence the susceptibility to erosive esophagitis in Helicobacter pylori infected Japanese population［J］.Hum Immunol，2012，73（11）：1184-1189.

［12］Harder J，Nunez G.Functional expression of the intracellular pattern recognition receptor NOD1 in human keratinocytes［J］.J Invest Dermatol，2009，129（5）：1299-1302.

［13］Watanabe T，Asano N，F(xiàn)ichtner-Feigl S，et al.NOD1 contributes to mouse host defense against Helicobacter pylori via induction of typeⅠIFN and activation of the ISGF3 signaling pathway［J］.J Clin Invest，2010，120（5）：1645-1662.

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.032

R573

B

1002-266X（2016）21-0079-03

周一軍（E-mail：zhoudoctor＠163.com）

（2015-08-27）