含笑內(nèi)酯對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞順鉑化療敏感性的影響及機(jī)制探討

孟文靜，謝曉娟，周立艷，賈勇圣，佟仲生

(天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津300060)

?

含笑內(nèi)酯對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞順鉑化療敏感性的影響及機(jī)制探討

孟文靜，謝曉娟，周立艷，賈勇圣，佟仲生

(天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津300060)

目的 觀察含笑內(nèi)酯(MCL)對(duì)三陰性乳腺癌(TNBC)細(xì)胞順鉑(DDP)化療敏感性的影響，并分析其可能的機(jī)制。方法 將TNBC細(xì)胞分為MCL組、DDP組、DDP+MCL組，分別加入MCL、DDP和DDP+MCL；另設(shè)空白對(duì)照組，加入等體積培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，采用CCK8法測(cè)算細(xì)胞存活率，計(jì)算聯(lián)合指數(shù)(CI)評(píng)價(jià)兩藥是協(xié)同(CI<0.9)或相加(CI 0.9～1.1)關(guān)系；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率；采用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞上清液中的谷胱甘肽。結(jié)果 MCL(2.5～10 μmol/L)、DDP(1.25～5 μmol/L)聯(lián)合作用TNBC細(xì)胞時(shí)，CI<0.85；空白對(duì)照組、MCL組、DDP組、MCL+DDP組細(xì)胞凋亡率分別為4.3%±1.3%、7.6%±2.0%、13.4%±4.3%、37.0%±5.7%，MCL+DDP組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他3組(P均<0.01)?？瞻讓?duì)照組、MCL組、DDP組、MCL+DDP組細(xì)胞上清液中谷胱甘肽水平分別為(43.54±3.71)、(35.85±2.67)、(50.33+3.16)、(38.46±1.74)mmol/mg，MCL組、MCL+DDP組﹤空白對(duì)照組﹤DDP組，P均<0.05；MCL組、MCL+DDP組比較，P>0.05。結(jié)論 MCL可通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平，從而增強(qiáng)TNBC細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。

三陰性乳腺癌；含笑內(nèi)酯；順鉑；耐藥

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病，不同分子分型乳腺癌的治療和預(yù)后差異較大。三陰性乳腺癌(TNBC)是指一類雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)表達(dá)均陰性的乳腺癌，其侵襲性強(qiáng)，預(yù)后較差，缺乏分子靶點(diǎn)，內(nèi)分泌治療及抗HER-2靶向治療均無(wú)效。目前，順鉑(DDP)是治療TNBC的主要化療藥物，但可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平升高從而降低藥物敏感性，增加耐藥的概率。因此，如何提高TNBC對(duì)DDP的敏感性成為研究熱點(diǎn)之一。含笑內(nèi)酯(MCL)是從70多種藥物中篩選出的一種小分子化合物，其主要成分為倍半萜內(nèi)酯，可以用小白菊內(nèi)酯(PTL)為原料，在一定溶劑和溫度下反應(yīng)得到。因MCL衍生于PTL，故其活性與PTL相當(dāng)，但穩(wěn)定性更高，血漿半衰期為PTL的6倍，并且成本較低[1，2]。2015年1～3月，我們觀察了DDP聯(lián)合MCL對(duì)TNBC細(xì)胞增殖、凋亡及谷胱甘肽水平的影響，探討MCL增強(qiáng)TNBC細(xì)胞對(duì)DDP敏感性的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人三陰乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，來(lái)源于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺癌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；DDP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MCL由天津尚德藥緣科技股份有限公司合成，分子式為C15H20O3，配置時(shí)用二甲基亞砜(DMSO)溶解；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD生物科技公司，谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液及ECL發(fā)光液購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每3～4日傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MCL對(duì)DDP化療作用的影響觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×104/孔接種96孔板，37 ℃過(guò)夜。將細(xì)胞隨機(jī)分為3組，MCL組給予0、2.5、5、10、20、40 μmol/L 的MCL，DDP組給予0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L的DDP，MCL+DDP組別以MCL、DDP各自相應(yīng)的倍比濃度；每個(gè)濃度設(shè)3復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)24 h。棄上清，更換含10%體積分?jǐn)?shù)CCK-8的完全培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-Rad)檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)的光密度(OD)值，計(jì)算MCL、DDP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的IC50值。依據(jù)中效原理(Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法)為基礎(chǔ)，應(yīng)用Combidrug統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算聯(lián)合指數(shù)(CI)，并評(píng)價(jià)兩藥是協(xié)同(CI<0.9)或相加(CI 0.9～1.1)關(guān)系。

1.4 細(xì)胞凋亡觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×105/孔接種于6孔板，37 ℃過(guò)夜。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(加入等體積培養(yǎng)基)、MCL組、DDP組、DDP+MCL組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別加入MCL 5 μmol/L、DDP 5 μmol/L、DDP 5 μmol/L+MCL 5 μmol/L。37 ℃培養(yǎng)24 h后，胰酶消化；收集細(xì)胞，離心，PBS沖洗；分別加入緩沖液50 μL、AnnexinⅤ-FITC 5 μL、PI染液10 μL，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞上清液谷胱甘肽檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105/孔接種于6孔板，細(xì)胞分組及藥物處理同1.4。37 ℃培養(yǎng)24 h后，PBS洗滌，胰酶消化；離心收集細(xì)胞，棄上清；加入細(xì)胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑S溶液，充分震蕩后用液氮和37 ℃水浴對(duì)樣品進(jìn)行兩次快速凍融。冰浴放置5 min后，離心取上清液。用蛋白去除試劑稀釋5倍后，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各10 μL分別加入96 孔板中；加入總谷胱甘肽檢測(cè)工作液150 μL，25 ℃孵育5 min；加入0.16 mg/mL NADPH 50 μL，水平振蕩混勻25 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定A412值，然后對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算谷胱甘肽水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 MCL對(duì)DDP化療作用的影響 MCL組的IC50為(38.15±2.45)μmol/L，DDP組的IC50為(20.36±2.64)μmol/L，MCL+DDP組MCL的IC50為(29.12±1.85)μmol/L、DDP的IC50為(8.12±2.71)μmol/L，MCL+DDP組DDP的IC50較DDP組明顯降低(P<0.05)。較低濃度DDP(1.25～5 μmol/L)、MCL(2.5～10 μmol/L)聯(lián)合作用細(xì)胞時(shí)呈協(xié)同作用(CI<0.85)，隨著藥物濃度的增加兩藥聯(lián)合趨于相加(CI>1.05)。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 空白對(duì)照組、MCL組、DDP組、MCL+DDP組細(xì)胞凋亡率分別為4.3%±1.3%、7.6%±2.0%、13.4%±4.3%、37.0%±5.7%，MCL+DDP組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他三組(P均<0.01)。

2.3 各組細(xì)胞上清液谷胱甘肽水平比較 空白對(duì)照組、MCL組、DDP組、MCL+DDP組細(xì)胞上清液中谷胱甘肽水平分別為(43.54±3.71)、(35.85±2.67)、(50.33+3.16)、(38.46±1.74)mmol/mg，MCL組、MCL+DDP組﹤空白對(duì)照組﹤DDP組，P均<0.05；MCL組、MCL+DDP組比較，P﹥0.05。

3 討論

目前，DDP是治療TNBC最常用的化療藥物之一，但乳腺癌細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥作用是影響化療效果的主要原因之一。DDP是一種細(xì)胞毒性鉑類衍生物，腫瘤細(xì)胞對(duì)其耐藥機(jī)制主要包括細(xì)胞內(nèi)DDP累積量減少、谷胱甘肽和巰基蛋白水平升高、DNA損傷修復(fù)[3～6]。因此，尋找能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP耐藥的方法成為目前研究的熱點(diǎn)。

PTL是從菊科植物中提取的倍半萜烯酯，可誘導(dǎo)乳腺癌、結(jié)腸癌及肝癌等腫瘤細(xì)胞凋亡，也可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[7～9]。但PTL穩(wěn)定性差、血漿半衰期短，限制了其臨床應(yīng)用。MCL是PTL的衍生物，其活性與PTL相當(dāng)，但在血漿中更加穩(wěn)定，血漿半衰期也較長(zhǎng)。本研究顯示，MCL和DDP單獨(dú)及聯(lián)合作用于TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231時(shí)均能抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)兩種藥物聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)細(xì)胞的抑制作用及凋亡誘導(dǎo)作用明顯強(qiáng)于兩藥單獨(dú)使用，具有良好的協(xié)同作用。

細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平提高是腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP敏感性降低的主要機(jī)制之一。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，加入DDP后TNBC細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平明顯升高。谷胱甘肽通過(guò)巰基與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的自由基結(jié)合，可以轉(zhuǎn)化成容易代謝的酸類物質(zhì)從而加速自由基的排泄，有助于降低DDP療效，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP耐藥。谷胱甘肽是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸縮合而成的含有γ-酰胺鍵和巰基的三肽，其體內(nèi)存在形式有氧化型(GSSH)和還原型(GSH)兩種。GSH能夠幫助機(jī)體保持正常的免疫系統(tǒng)功能，具有抗氧化作用和整合解毒的作用，在多種腫瘤細(xì)胞中GSH水平升高，與腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的抵抗有關(guān)，尤其是對(duì)鉑類的耐藥。谷氨酰-L-半胱氨酸連接酶(GCL)的基因表達(dá)是控制GSH合成、維持細(xì)胞內(nèi)GSH含量穩(wěn)定的重要途徑。GCL是由一個(gè)73 kD的催化亞基(GCLC) 和一個(gè)31 kD的調(diào)節(jié)亞基(GCLM)所組成的異二聚體，GCLC具有催化活性并且是GSH反饋抑制的位點(diǎn)[10]。另外，谷胱甘肽過(guò)氧化酶1(GPX1)同樣在GSH合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

PTL可以通過(guò)抑制谷胱甘肽合成通路的關(guān)鍵酶GCLC及GPX1而干擾谷胱甘肽的合成，亦可通過(guò)活化NADPH氧化酶產(chǎn)生活性氧，耗竭細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽和蛋白巰基，從而使細(xì)胞死亡，達(dá)到抗腫瘤作用[11～13]。而MCL作為PTL的衍生物，是否二者在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面存在共同作用機(jī)制，是否MCL亦可通過(guò)抑制谷胱甘肽發(fā)揮其化療增敏作用，是本實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，MCL可以明顯降低TNBC細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平，與DDP聯(lián)用時(shí)，有效增強(qiáng)TNBC對(duì)DDP的敏感性。推測(cè)PTL作為MCL的類似物，可以抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽合成通路的關(guān)鍵酶GCLC及GPX1的蛋白表達(dá)，從而降低細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平。

綜上所述，MCL可通過(guò)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平，抑制谷胱甘肽對(duì)DDP的解毒作用，從而增加TNBC細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。但是，MCL與DDP協(xié)同抗腫瘤的機(jī)制很復(fù)雜，可能還通過(guò)其他途徑引起腫瘤細(xì)胞凋亡，尚需進(jìn)一步研究。

[1] Zhai JD, Li D, Long J, et al. Biomimetic semisynthesis of arglabin from parthenolide[J]. J Org Chem, 2012,77(16):7103-7107.

[2] Zhang Q, Lu Y, Ding Y, et al. Guaianolide sesquiterpene lactones, a source to discover agents that selectively inhibit acute myelogenous leukemia stem and progenitor cells[J]. J Med Chem, 2012,55(20):8757-8769.

[3] Masuda H, Ozols RF, Lai GM, et al. Increased DNA repair as a mechanism of acquired resistance to cis-diamminedichloroplatinum (Ⅱ) in human ovarian cancer cell lines[J]. Cancer Res, 1988,48(20):5713-5716.

[4] Johnson SW, Laub PB, Beesley JS, et al. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines[J]. Cancer Res, 1997,57(5):850-856.

[5] Kawaguchi H, Terai Y, Tanabe A, et al. Gemcitabine as a molecular targeting agent that blocks the Akt cascade in platinum-resistant ovarian cancer[J]. J Ovarian Res, 2014,7:38.

[6] Galluzzi L, Vitale I, Michels J, et al. Systems biology of cisplatin resistance: past, present and future[J]. Cell Death Dis, 2014,5:e1257.

[7] Czyz M, Lesiak-Mieczkowska K, Koprowska K, et al. Cell context-dependent activities of parthenolide in primary and metastatic melanoma cells[J]. Br J Pharmacol, 2010,160(5):1144-1157.

[8] Li CJ, Guo SF, Shi TM. Culture supernatants of breast cancer cell line MDA-MB-231 treated with parthenolide inhibit the proliferation, migration, and lumen formation capacity of human umbilical vein endothelial cells[J]. Chin Med J (Engl), 2012,125(12):2195-2199.

[9] Wang WJ, Meng ZL, Mo YC, et al. Unloading the infarcted heart affect MMPs-TIMPs axis in a rat cardiac heterotopic transplantation model[J]. Mol Biol Rep, 2012,39(1):277-283.

[10] 張宗亮.谷胱甘肽在腫瘤中的研究進(jìn)展[J/OL]. 泌尿外科雜志,2013,5(4):28-33.

[11] Sun Y, St CD, Xu Y, et al. A NADPH oxidase-dependent redox signaling pathway mediates the selective radiosensitization effect of parthenolide in prostate cancer cells[J]. Cancer Res, 2010,70(7):2880-2890.

[12] D′Anneo A, Carlisi D, Lauricella M, et al. Parthenolide induces caspase-independent and AIF-mediated cell death in human osteosarcoma and melanoma cells[J]. J Cell Physiol, 2013,228(5):952-967.

[13] Pei S, Minhajuddin M, Callahan KP, et al. Targeting aberrant glutathione metabolism to eradicate human acute myelogenous leukemia cells[J]. J Biol Chem, 2013,288(47):33542-33558.

Effect of Micheliolide on chemosensitivity of triple negative breast cancer cells to cisplatin

MENGWenjing,XIEXiaojuan,ZHOULiyan,JIAYongsheng,TONGZhongsheng

(TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,NationalClinicalResearchCenterforCancer,Tianjin300060,China)

Objective To observe the effect of Micheliolide (MCL) on chemosensitivity of triple negative breast cancer (TNBC) cells to cisplatin (DDP) and the related mechanisms. Methods TNBC cells were randomly divided into MCL group, DDP group and DDP+MCL group, which were respectively added with MCL, DDP and DDP+MCL. Another blank control group was added with equal volume of culture medium. The cell viability was measured by CCK8, the CI was calculated, apoptotic cells were calculated by flow cytometry as well as the apoptosis rate, and glutathione (GSH) in supernatant was detected by ELISA.Results MCL(1-10 μmol/L) combined with DDP (1-5 μmol/L)showed an obvious synergistic effect(CI<0.85), the apoptosis rates were 4.3%±1.33%, 7.6%±2.02%, 13.4%±4.26% and 37.0%±5.74% in the control, MCL, DDP and MCL+DDP groups, respectively; the apoptosis rate of the MCL+DDP group was higher than that of the MCL group and DDP group (allP<0.05). The intracellular GSH levels were (43.54±3.71), (35.85±2.67), (50.33+3.16), and (38.46±1.74) mmol/mg in the control, MCL, DDP and MCL+DDP groups, respectively. The intracellular GSH level: MCL group, MCL+DDP group0.05.Conclusion MCL enhances the sensitivity of TNBC cells MDA-MB-231 to cisplatin by decreasing intracellular GSH levels.

triple negative breast carcinoma; micheliolide; cisplatin; drug resistance

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(20131202120003)；天津市抗癌重大專項(xiàng)攻關(guān)計(jì)劃(12ZCDZSY16200)。

孟文靜(1982-)，女，醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槿橄侔┑木C合治療及基礎(chǔ)。E-mail: wenjingmx@163.com

簡(jiǎn)介：佟仲生(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槿橄侔┑木C合治療及基礎(chǔ)。E-mail: tongzhongsheng@tjmuch.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.004

R737.9

A

1002-266X(2016)42-0014-03

2016-01-17-21)